Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

Moja grupa badawcza koncentruje się na podstawach biologii molekularnej i biochemii biosyntetycznych linii montażowych u bakterii. Naszym celem jest zmodyfikowanie bakterii do produkcji nowych antybiotyków. Jesteśmy pasjonatami wprowadzania tej pracy do klasy, zapewniając uczniom praktyczne doświadczenie w najnowocześniejszych technikach biotechnologii.

Klonowanie oparte na topoizomerazie jest obecnie stosowane w klasie biologii molekularnej na studiach licencjackich Cal Poly, aby zapoznać studentów z klonowaniem molekularnym. Montaż Gibsona stał się techniką klonowania molekularnego o znaczeniu przemysłowym, a my staramy się zapewnić studentom odpowiednie doświadczenia. Klonowanie molekularne to technika, która może być trudna do konceptualizacji w tradycyjnej klasie licencjackiej.

Zaprojektowaliśmy praktyczny moduł laboratoryjny, w którym studenci projektują i oceniają swój eksperyment, a także przyczyniają się do autentycznych projektów badawczych. Zwiększa to ich zrozumienie procesu klonowania i zastosowań ich pracy. Podczas gdy inne doświadczenia badawcze oparte na kursach licencjackich wykorzystujące techniki klonowania molekularnego zostały opublikowane, żadne z nich nie zawiera adaptowalnego modułu montażowego Gibsona.

Zaprojektowaliśmy wszystkie materiały do pomiaru efektów uczenia się dla tego doświadczenia badawczego opartego na kursie licencjackim. Mamy nadzieję, że posłuży to jako łatwe do wdrożenia narzędzie do edukacji naukowej, aby poprawić ocenę instruktorów i edukację studentów w laboratoriach biologii molekularnej na poziomie college'u. Aby rozpocząć, określ źródło matrycy DNA dla wstawek genów, takie jak genomowe DNA, plazmid lub syntetyczne DNA.

Pobierz sekwencje DNA wstawień genów i wektora. Zaimportuj żądane sekwencje wstawiania i sekwencje wektorowe do Benchling jako nowe pliki sekwencji DNA. Następnie otwórz każdą zaimportowaną sekwencję, która ma być użyta w reakcji montażu Gibsona.

Teraz zlokalizuj narzędzie Kreator montażu u dołu ekranu. Kliknij opcję Kreator złożeń, a następnie wybierz opcję Utwórz nowy zestaw. Z wyświetlonych opcji wybierz Gibson i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć składanie.

W oknie Sekwencja wektorowa wybierz podstawy szkieletu wektora, zaczynając od 3 głównych końców wstawki genu do żądanego punktu końcowego. Po wybraniu kliknij kartę Szkielet u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. W oknie Wstaw sekwencję wybierz wszystkie podstawy wstawek, które mają zostać uwzględnione w zespole.

Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. Jeśli istnieje wiele wstawek genów, kliknij przycisk plusa po prawej stronie Kreatora zestawów. W oknie Wstaw sekwencję wybierz wszystkie podstawy dla dodatkowej wkładki, która ma zostać uwzględniona w zespole.

Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. Po ustawieniu wszystkich fragmentów zmień nazwę zestawu na żądaną nazwę plazmidu. Kliknij przycisk Złóż po prawej stronie Kreatora złożeń.

Następnie wybierz żądaną lokalizację folderu zarówno dla folderu sekwencji, jak i folderu startera, a następnie kliknij przycisk Utwórz, aby złożyć rekombinowaną sekwencję plazmidową. Teraz otwórz zmontowany plazmid i kliknij Historia złożenia, aby wyświetlić podstawową mapę plazmidu i przegląd sekwencji, z których został uzyskany. Na karcie Parametry zespołu wyświetl nazwy podkładów zaprojektowanych dla zespołu.

Upewnij się, że dla każdej wstawki znajdują się dwa startery i że nazwy starterów pochodzą od tytułów plików sekwencji DNA. Upewnij się, że temperatury topnienia podkładu i sugerowane temperatury wyżarzania są zgodne. Po zakończeniu projektowania startera dla żądanych plazmidów kliknij przycisk Finalizuj w Kreatorze złożeń.

Korzystając z gradientowego eksperymentu PCR z matrycami DNA, przetestuj zarówno pary starterów, jak i pary starterów specyficzne dla wektora, aby uzyskać optymalne temperatury wyżarzania. Po określeniu temperatur wyżarzania utwórz podwielokrotności roztworów starterów, matryce DNA i niezbędne odczynniki do reakcji PCR dla uczniów. Na początek zdobądź od instruktora startery i roztwory matryc DNA do PCR.

Za pomocą pokazanych tutaj odczynników przygotuj 25-mikrolitrowe reakcje PCR, aby uzyskać liniowe fragmenty pożądanych sekwencji DNA. Cyklicznie przeprowadź reakcję w termocyklerze. Upewnij się, że temperatura wyżarzania jest odpowiednia dla podkładów i że czas wydłużania jest odpowiedni do długości pożądanego amplikonu.

Następnie przeanalizuj pięć mikrolitrów każdej reakcji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Podczas działania żelu dodaj jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego DpnI do każdej reakcji, w której wykorzystano plazmidowe DNA jako matrycę. Inkubuj tę mieszaninę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie zobrazuj żel, aby potwierdzić, że PCR się powiódł i uzyskano prawidłową amplifikację. Oczyść wszelkie udane reakcje PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Zmierz stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do wykorzystania w kolejnych obliczeniach zespołu Gibsona.

Odpipetuj elementy reakcji zespołu Gibsona. Inkubować reakcję w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut. Podczas inkubacji reakcji rozmrażaj chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli na lodzie w celu transformacji.

Przekształć dwa mikrolitry reakcji montażu Gibsona w chemicznie kompetentne ogniwa za pomocą szoku cieplnego. Odpipetować 100 mikrolitrów przekształconych komórek na dwie płytki selekcyjne i rozprowadzić wysterylizowanymi kulkami. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie policz kolonie na wszystkich płytkach i oblicz wydajność przemiany za pomocą podanego wzoru. Za pomocą markera wybierz i oznacz cztery odrębne kolonie na płytce selekcyjnej inicjałami ucznia i liczbą.

Weź nową płytkę agarową LB zawierającą antybiotyki do selekcji i podziel ją na ćwiartki. Użyj około połowy każdej kolonii, aby ponownie przesunąć się na odpowiednią ćwiartkę. Dodaj odpowiednie stężenie antybiotyku do probówek oznaczonych tożsamością kolonii w celu selekcji.

Następnie zaszczepij pięciomililitrową płynną kulturę LB drugą połową każdej z czterech wybranych kolonii. Inkubować płynne kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, a płytkę agarową w inkubatorze statycznym w tej samej temperaturze. Wyizoluj plazmidowe DNA z płynnych kultur za pomocą mini zestawu przygotowawczego.

Zmierz stężenie wyizolowanego plazmidowego DNA w nanogramach na mikrolitr. Po zaprojektowaniu przesiewowego badania przesiewowego PCR z przesyceniem restrykcyjnym w celu analizy izolowanych plazmidów, należy pipetować reakcje trawienia restrykcyjnego lub reakcje PCR. Następnie przeanalizuj wyniki za pomocą elektroforezy żelowej.

Po ukończeniu modułu montażu Gibsona poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wielokrotnego wyboru na spotkaniu laboratoryjnym. Połącz wszystkie dane z odpowiedzi udzielonych w kwestionariuszu przed i po kwestionariuszu w celu analizy i oceń ich istotność statystyczną. Po zakończeniu projektu średni wynik treści znacznie wzrósł z 63,7% do 80,4%, co wskazuje na lepsze zrozumienie przez uczniów pojęć biologii molekularnej i klonowania.

Średnia pewność siebie terminu znacznie wzrosła z 3,52 do 3,87, przy czym duży rozmiar efektu świadczy o lepszym zrozumieniu przez uczniów terminów biologii molekularnej. Pewność siebie przeciętnego studenta w wykonywaniu technik laboratoryjnych znacznie wzrosła z 3,82 do 4,33, co świadczy o zwiększonym komforcie z technikami biologii molekularnej. Liczba odpowiedzi wskazujących na znajomość terminu montaż Gibsona znacznie wzrosła od kwestionariusza przed i po, ze znaczącym wzrostem liczby osób, które potrafiły wyjaśnić ten termin.

Pewność siebie w wykonywaniu techniki montażu Gibsona poprawiała się przy większości odpowiedzi, przechodząc od neutralnego lub niezgadzającego się przed sesją do zgadzania się lub zdecydowanego zgadzania się po. Pewność siebie uczniów w zakresie ogólnych zagadnień biologicznych nie wykazała statystycznie istotnych zmian. W przeciwieństwie do tego, zaufanie do specjalistycznych pytań montażowych Gibsona znacznie wzrosło.