Name: Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę Gibson Assembly w kursie badawczym CURE na studiach licencjackich. Studenci zwiększyli zrozumienie klonowania molekularnego i pewność siebie w pracy laboratoryjnej dzięki praktycznemu doświadczeniu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Andrei Laubscher za wsparcie techniczne, a także Michaelowi Blackowi, Sandi Clement i Javinowi Ozie za pomocne dyskusje na temat wdrażania laboratorium nauczania i oceny efektów uczenia się. Autorzy z uznaniem dziękują wszystkim studentom, którzy wzięli udział w badaniu efektów uczenia się w kohortach 2019, 2022 i 2023, a także studentom Nathanowi Kuhnowi i Aayushi Adettiwarowi, którzy pomagali w przygotowaniu odczynników do wdrożenia w laboratorium dydaktycznym. Autorzy dziękują również za wsparcie finansowe ze strony William and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant oraz National Science Foundation (NSF-1708919 i NSF-2300890).

Badania z udziałem uczestników zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez uczestników w Research Institutional Review Board w Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). Uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w tym badaniu.
Poniższy protokół opisuje przygotowanie instruktora (kroki 1.1–1.3), działania studentów w module nauczania składającym się z trzech eksperymentów, który obejmuje PCR w celu uzyskania fragmentów liniowych (kroki 2.1–2.7), montaż, transformację i selekcję klonów Gibsona (kroki 3.1–3.5), izolację i badania przesiewowe plazmidu (kroki 4.1–4.4) oraz ocenę efektów uczenia się (5.1–5.2). Przygotowanie instruktora opisuje jeden z reprezentatywnych przykładów projektowania podkładu i przygotowania pożądanej mapy plazmidowej in silico. Wszystkie sekcje protokołu można dostosować do innych pożądanych plazmidów. Każdy eksperyment studencki podzielony jest na dwa 3-godzinne spotkania laboratoryjne.
1. Przygotowanie instruktora 
<ol>
	<li>Projektowanie podkładu zespołu Gibson przy użyciu kreatora montażu ławkowego
	<ol>
		<li>Określ źródło matrycy DNA dla wstawienia genu, takie jak genomowe DNA, plazmid i syntetyczne DNA. 
		nuta: W przypadku genów, które będą amplifikowane ze złożonych matryc genomowego DNA, zaleca się najpierw określenie unikalnych miejsc wiązania starterów w szablonie genomowego DNA, które są specyficzne dla interesującego genu (genów), korzystając z narzędzia National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)21, zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 1. W przypadku prostych szablonów, takich jak plazmidy lub syntetyczne DNA, przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Pobierz sekwencje DNA wstawki genu (wstawień) genu (wstawień) genu genu (sytuacji) genu hydroksylazy poliketydowej i sekwencji pUC19 dostarczonej jako pliki GenBank w pliku uzupełniającym 8). Zaimportuj żądaną sekwencję (sekwencje) wstawiania i żądaną sekwencję wektorową do Benchling, każdy jako nowy plik sekwencji DNA. Otwórz każdą zaimportowaną sekwencję, która ma zostać uwzględniona w reakcji zespołu Gibsona. 
		nuta: Można importować pliki sekwencji DNA w kilku formatach, w tym GenBank i FASTA. Można również zaimportować sekwencję bezpośrednio z bazy danych z numerem dostępu lub wkleić sekwencję nukleotydową skopiowaną z innego pliku lub przeglądarki.</li>
		<li>U dołu ekranu znajdź narzędzie Kreator złożenia. Kliknij opcję Kreator złożeń, a następnie wybierz opcję Utwórz nowy zestaw. Z wyświetlonych opcji wybierz Gibson i kliknij Start, aby rozpocząć składanie.</li>
		<li>W oknie sekwencji wektorów wybierz wszystkie bazy z wektorowej sieci szkieletowej, które mają zostać uwzględnione w złożeniu. Rozpocznij selekcję od pozycji nukleotydu na końcu 3' wstawki genu (np. pozycja 657 pUC19) i wybierz wszystkie pozostałe nukleotydy do włączenia (np. przez pozycję 656, aby uwzględnić całą sekwencję pUC19). Po wybraniu kliknij kartę Szkielet u dołu ekranu| Ustaw Fragment. 
		nuta: Przełączaj się między widokami Mapy sekwencji i Plazmidów wektora, aby wybrać wszystkie żądane podstawy okrągłego szablonu. Alternatywnie, jeśli planujesz przygotować fragment wektora za pomocą trawienia restrykcyjnego (zamiast PCR) dla montażu Gibsona, zlinearyzuj sekwencję szkieletową z miejscem cięcia enzymu restrykcyjnego (np. XbaI). Aby to zrobić, kliknij miejsce cięcia, przytrzymaj Shift i ponownie kliknij miejsce cięcia. Następnie kliknij Ustaw fragment, aby ustawić szkielet. Należy pamiętać, że startery specyficzne dla wektorów nie zostaną wygenerowane przez Benchlinga, jeśli szkielet zostanie zlinearyzowany za pomocą enzymu restrykcyjnego w Kreatorze złożeń.</li>
		<li>W oknie sekwencji wstawiania wybierz wszystkie podstawy wkładki, które mają zostać uwzględnione w zespole. Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu | Ustaw fragment.</li>
		<li>W przypadku wielu wstawek genów kliknij przycisk + po prawej stronie Kreatora zestawów. W oknie sekwencji wstawiania wybierz wszystkie podstawy wstawek, które mają zostać uwzględnione w zespole. Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu | Ustaw fragment.</li>
		<li>Po ustawieniu wszystkich fragmentów zmień nazwę zespołu na żądaną nazwę plazmidu i kliknij przycisk Złóż po prawej stronie Kreatora złożeń. Wybierz żądaną lokalizację folderu zarówno dla folderu sekwencji, jak i folderu podkładu. Kliknij przycisk Utwórz, aby złożyć sekwencję rekombinowanego plazmidu.</li>
		<li>Otwórz zmontowany plazmid i kliknij opcję Historia złożenia, aby wyświetlić podstawową mapę plazmidu i przegląd sekwencji, z których został on uzyskany. Upewnij się, że pozycje nukleotydów dla każdego fragmentu są zgodne z pożądanym projektem.</li>
		<li>Na karcie Parametry zespołu wyświetl nazwy podkładów zaprojektowanych dla zespołu. Zauważ, że dla każdej wkładki będą przeznaczone dwa startery (do przodu i do tyłu), a nazwy starterów będą pochodzić z tytułów plików sekwencji DNA. Upewnij się również, że temperatury topnienia podkładu i sugerowane temperatury wyżarzania są zgodne w tym oknie (patrz Plik uzupełniający 8, Reprezentatywne startery).
		<ol>
			<li>Jeśli temperatury topnienia startera lub wyżarzania nie są idealne, ręcznie dostosuj sekwencje startera (np. usuwając nukleotydy w celu obniżenia temperatury topnienia) w plikach sekwencji starterów. Alternatywnie, kliknij Otwórz ponownie i dostosuj ustawienia startera, klikając przycisk Ustawienia enzymu/startera obok przycisku Złóż w Kreatorze montażu. Następnie powtórz krok montażu i ponownie sprawdź sekwencje starterów.</li>
			<li>Jeśli biblioteka plazmidów ma być sklonowana z wieloma różnymi genami sklonowanymi do tej samej sieci szkieletowej wektora,</li>
			<li>W każdym przypadku użyj tej samej pary starterów dla wektora. Aby to zrobić, ręcznie usuń wszystkie nukleotydy ze starterów wektorowych, które zainstalowałyby zwisy specyficzne dla insertu. Nukleotydy te znajdowałyby się na końcu 5' startera. Po usunięciu upewnij się, że temperatury topnienia podkładu i temperatury wyżarzania są zgodne (patrz plik uzupełniający 8, Reprezentatywne podkłady).</li>
			<li>Upewnij się, że wszystkie pary podkładów mają bardzo podobne temperatury topnienia i wyżarzania. 
			nuta: Zmniejszy to potrzebę optymalizacji temperatury wyżarzania każdej pary i pozwoli na cykliczne przeprowadzanie wszystkich reakcji PCR uczniów w tym samym czasie przy użyciu tego samego programu termocyklera.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po zakończeniu projektowania startera dla żądanych plazmidów kliknij przycisk Finalizuj w Kreatorze złożeń. Zamów startery w firmie zajmującej się syntezą DNA i pobierz próbki matryc DNA do wstawienia (wstawień) i wektora.</li>
		<li>Przetestuj zarówno pary starterów specyficzne dla insertu, jak i wektora, aby uzyskać optymalne temperatury wyżarzania, korzystając z gradientowego eksperymentu PCR z matrycami DNA. Początkowo należy sprawdzić zalecane przez Benchlinga temperatury wyżarzania ± 3 °C.</li>
		<li>Po określeniu temperatur wyżarzania utwórz podwielokrotności roztworów starterów, matryce DNA i niezbędne odczynniki do reakcji PCR dla uczniów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed eksperymentami rozdaj uczniom arkusze robocze, które pomogą im się przygotować i ocenić zrozumienie (Plik Uzupełniający 4, Dodatek 5 i Dodatek 6).</li>
	<li>Gromadzenie danych o efektach uczenia się 
	nuta: Jeśli jesteś zainteresowany zebraniem danych o wynikach uczenia się z modułu Gibson Assembly i opublikowaniem wyników, uzyskaj zgodę na badania z udziałem ludzi zgodnie z polityką instytucji.
	<ol>
		<li>Zaproś uczniów do wzięcia udziału w badaniu efektów uczenia się co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem niezależnego projektu Gibson Assembly.</li>
		<li>Poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wstępnego wielokrotnego wyboru (Plik uzupełniający 6) na spotkaniu laboratoryjnym przed rozpoczęciem niezależnego projektu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperyment studencki A: PCR w celu uzyskania fragmentów liniowych
<ol>
	<li>Zdobądź startery i roztwory matryc DNA do PCR od instruktora.</li>
	<li>Pipeta 25 μl reakcji, w tym polimeraza DNA MasterMix, matryca DNA, startery do przodu i do tyłu oraz woda wolna od nukleaz zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku dla uczniów (patrz plik uzupełniający 2).</li>
	<li>Cyklicznie przeprowadź reakcję w termocyklerze zgodnie z podręcznikiem dla uczniów w pliku uzupełniającym 2. Upewnij się, że temperatura wyżarzania w reakcji jest odpowiednia dla starterów, a czas wydłużania jest odpowiedni dla długości pożądanego amplikonu. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 2 i Pliku Uzupełniającym 3.</li>
	<li>Przechowywać reakcje PCR w temperaturze 4 °C lub -20 °C do następnego okresu laboratoryjnego.</li>
	<li>Przeanalizować 5 μl każdej reakcji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Podczas pracy żelu dodaj 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI do każdej reakcji, która wykorzystywała plazmidowe DNA jako matrycę. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	nuta: DpnI zdegraduje pozostałą kolistą matrycę plazmidowego DNA, zmniejszając prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie dodatnich na etapie transformacji.</li>
	<li>Zobrazuj żel, aby potwierdzić, że PCR się powiódł i osiągnięto prawidłową amplifikację. Oczyść wszelkie udane reakcje PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Zmierz stężenie (ng/μl) oczyszczonego produktu PCR za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do wykorzystania w kolejnych obliczeniach zespołu Gibsona.</li>
	<li>Przed następnym spotkaniem klasowym zaprojektuj przepis na reakcję dla zespołu Gibsona (patrz Plik Uzupełniający 2 i Plik Uzupełniający 4).</li>
</ol>
3. Eksperyment studencki B: Gibson Montaż, transformacja i selekcja klonów 
<ol>
	<li>Odpipetować reakcję zespołu Gibsona zgodnie z opracowaną recepturą. Inkubować reakcję w temperaturze 50 °C przez 15 minut. Podczas inkubacji reakcji przygotuj się do transformacji, rozmrażając chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli na lodzie.</li>
	<li>Przekształć 2 μl zespołu Gibsona w chemicznie kompetentne ogniwa za pomocą szoku cieplnego. Odpipetować 100 μl przekształconych komórek na dwóch płytkach selekcyjnych i rozprowadzić za pomocą wysterylizowanych kulek. Przygotować 10-4, 10-5 i 10-6 rozcieńczeń pozostałych komórek na agarze Luria-Bertani (LB). Umieścić 100 μl każdego seryjnego rozcieńczenia na LB (bez wyboru) i rozprowadzić sterylizowanymi kulkami. 
	nuta: Ten krok pozwala na obliczenie wydajności transformacji.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do następnego okresu lekcyjnego.</li>
	<li>Policz kolonie na wszystkich płytkach i oblicz wydajność transformacji zgodnie z instrukcjami w pliku uzupełniającym 2. Ponownie prążkować jedną selektywną płytkę czterema koloniami z każdej selektywnej płytki i inkubować tę płytkę w temperaturze 37 °C przez noc. 
	nuta: Służy to jako kultura zapasowa twoich pozytywnych klonów.</li>
	<li>Za pomocą markera wybierz, zakreśl i oznacz cztery odrębne kolonie na płytce selekcyjnej inicjałami ucznia i liczbą (np. ABC1). Pobrać nową płytkę LB-agar zawierającą antybiotyk do selekcji, użyć markera, aby podzielić płytkę na ćwiartki (tj. ćwiartki), a następnie użyć ~ 1/2 każdej kolonii do ponownego naniesienia smug na odpowiednio oznakowany kwadrant, a drugiej 1/2 do zaszczepienia 5 ml płynnej kultury LB dla każdej z czterech wybranych kolonii. Pamiętaj, aby oznaczyć probówki odpowiednią tożsamością kolonii (np. ABC1) i dodać odpowiednie stężenie antybiotyku do wyboru. Inkubować płynne kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc, a płytkę agarową w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C; Płynne kultury kultury i płytki przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego okresu lekcyjnego.</li>
</ol>
4. Eksperyment studencki C: Izolacja plazmidu i badania przesiewowe
<ol>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA z płynnych kultur z eksperymentu B za pomocą zestawu do miniprzygotowania. Zmierzyć stężenie izolowanego plazmidu (w ng/μl).</li>
	<li>Zaprojektuj trawienie restrykcyjne lub przesiewowe badanie PCR w celu analizy izolowanych plazmidów (patrz szczegółowe instrukcje w pliku uzupełniającym 2 i oczekiwania dotyczące raportu w pliku uzupełniającym 5).</li>
	<li>Pipetować restrykcyjne reakcje trawienia lub reakcje zgodnie z opracowanymi recepturami i inkubować w temperaturach i czasie określonym wcześniej.</li>
	<li>Analizuj wyniki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
</ol>
5. Ocena 
<ol>
	<li>Poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wielokrotnego wyboru po spotkaniu laboratoryjnym (Plik uzupełniający 7) po ukończeniu modułu Gibson Assembly.</li>
	<li>Połącz wszystkie dane z odpowiedzi udzielonych przed i po kwestionariuszu w celu analizy.
	<ol>
		<li>Zbadaj istotność statystyczną wzrostu średniego wyniku każdego pytania o treść między kwestionariuszami, używając dwustronnych sparowanych testów t i wielkości efektu d Cohena.</li>
		<li>Oceń wzrost pewności siebie uczniów dla każdego indywidualnego terminu i techniki, aby określić zakres zmiany i jej istotność statystyczną.</li>
		<li>Określ wpływ pochodzenia ucznia i czynników akademickich na uczenie się ucznia za pomocą znormalizowanych wyników uczenia się (NLG) i niesparowanych testów t.</li>
		<li> Oceń postawy uczniów wobec doświadczeń związanych z projektem i karierą w biologii molekularnej, oceniając średnie wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Implementing Gibson Assembly to Enhance Molecular Biology Education and Skills

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Tutaj proponujemy regulowany projekt laboratoryjny w klasie licencjackiej, który uczy studentów klonowania molekularnego za pomocą Gibson Assembly w warunkach badawczych opartych na kursach. W sumie 28 nowych plazmidów zostało sklonowanych przez studentów studiów licencjackich w warunkach klasowych. Indywidualny sukces zgłaszany przez studentów wahał się od 44,4% do 81,8% w trzech kohortach, a ogólny sukces klonowania wyniósł 80% (28 z 35 wszystkich przypisanych plazmidów zostało pomyślnie sklonowanych). Mniejszy sukces klonowania w 2023 r. był prawdopodobnie spowodowany dwoma złożonymi czynnikami. Po pierwsze, probówki z próbkami matrycowego DNA zostały oznaczone bardzo blisko spokrewnionymi nazwami; Możliwe, że doszło do pomieszania matryc DNA przygotowanych przez studentów-badaczy, co doprowadziło do połączenia niekompatybilnych fragmentów liniowych podczas reakcji montażu Gibsona przeprowadzonej przez studentów w laboratorium dydaktycznym. W przyszłych iteracjach tego projektu matrycowe DNA powinno zostać najpierw zsekwencjonowane lub przesiane za pomocą skrótu restrykcyjnego, aby potwierdzić poprawną tożsamość, zanim zostanie dostarczone uczniom. Po drugie, iteracja tego projektu w 2023 r. składała się z czterofragmentowych zespołów (jeden wektor i trzy wstawki), w przeciwieństwie do dwufragmentowych zespołów w poprzednich latach (jeden wektor i jedna wkładka). Mogło to również zmniejszyć sukces klonowania w tym projekcie, ponieważ więcej fragmentów w zespole Gibsona może obniżyć wydajność reakcji22. W przyszłych iteracjach tego projektu można zbudować większą redundancję poprzez klonowanie tego samego plazmidu przez więcej grup lub ustawianie przez grupy wielu reakcji zespołu Gibsona w różnych proporcjach insercji do wektora, aby zwiększyć prawdopodobieństwo udanej ligacji i transformacji plazmidu. Dodatkowo, włączenie dłuższych nakładek między fragmentami i wydłużenie czasu inkubacji reakcji zespołu Gibsona może zwiększyć sukces w zespołach z 4-6 fragmentami23.
Wyniki ankiety przeprowadzonej przed i po zakończeniu projektu wskazują, że oprócz klonowania nowych plazmidów, studenci pogłębili swoją wiedzę na temat biologii molekularnej i koncepcji klonowania molekularnego, przy czym największy efekt uzyskali w przypadku pytań dotyczących klonowania Gibson Assembly. Ponadto w przypadku większości ocenianych studentów zaufanie studentów do terminologii biologii molekularnej i technik laboratoryjnych znacznie się poprawiło po zakończeniu projektu. Zespół Gibsona jest ważną i wszechstronną techniką klonowania molekularnego stosowaną w badaniach akademickich i w przemyśle biotechnologicznym2. Ucząc tych pojęć i praktycznych umiejętności na kursie laboratoryjnym, wszyscy studenci studiów licencjackich mają równe szanse na ukończenie studiów z kompetencjami badawczymi i umiejętnościami możliwymi do zatrudnienia w momencie wejścia na rynek pracy lub kontynuowania edukacji.
Opisany program nauczania Gibson Assembly obejmuje pięć elementów udanego CURE4. Studenci wykorzystali praktyki naukowe, projektując własne protokoły, w tym cele i oczekiwania oparte na rozmiarach amplikonów PCR i ograniczeniach trawienia (plik uzupełniający 3, plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5). Niezależny projekt promuje współpracę uczniów poprzez podzielenie przygotowania każdego wymaganego fragmentu między członków grupy i ostatecznie wykorzystanie fragmentów od każdego członka grupy w jednej reakcji podwiązania (Eksperyment Arkusz planowania A (oparty na zespole) w pliku uzupełniającym 3). Plazmidy, które te niezależne projekty miały na celu sklonować, to nowe plazmidy ekspresyjne mające znaczenie dla projektów badawczych poza salą lekcyjną, potencjalnie dostarczając danych do badań nadających się do publikacji. Podobnie jak w przypadku bardziej tradycyjnych doświadczeń badawczych, wskaźniki sukcesu klonowania w kursie CURE nie wynosiły 100%. Studenci zostali poproszeni o ocenę zmiennych, które mogły dać negatywne wyniki, oraz o zaproponowanie hipotez wyjaśniających, dlaczego plazmid nie został pomyślnie sklonowany, co służy jako autentyczne doświadczenie edukacyjne dla studentów w odniesieniu do wyników badań.
W tej iteracji Gibson Assembly CURE studenci sklonowali plazmidy związane z badaniami nad naturalnymi produktami Actinomycetota; Jednak przepływ pracy został zaprojektowany tak, aby można go było łatwo dostosować również do innych projektów. Przedstawione tutaj protokoły są uogólnione, co pozwala studentom na klonowanie plazmidów, które mogą być wykorzystane do wielu celów badawczych w ciągu sześciu spotkań laboratoryjnych i dwóch wykładów. Ramy te pozwalają uczniom klonować nowe plazmidy indywidualnie lub współpracować w celu sklonowania pojedynczego plazmidu z >2 fragmentów liniowych w podejściu zespołowym. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to można dostosować do szerokiego zakresu projektów badawczych, które mogą wymagać różnego wykorzystania zespołu Gibsona.
W badaniu tym oceniano postępy uczniów w nauce dzięki podejściu opartemu na CURE do nauczania Gibson Assembly, ale dodatkowe informacje można uzyskać poprzez rozszerzenie badania. Podczas gdy format kwestionariusza przed i po nim umożliwił ocenę efektów uczenia się dzięki niezależnemu projektowi, nie przeprowadzono porównania z nauczaniem opartym na wykładzie w Gibson Assembly. Porównanie opartego na eksperymencie CURE z wykładem lub bardziej tradycyjną aktywnością laboratoryjną, w której wyniki eksperymentalne są już zaprojektowane dla studentów, dostarczyłoby więcej informacji, gdyby ulepszone wyniki uczenia się Gibson Assembly były specyficzne dla modelu kursu CURE. Wreszcie, podczas gdy niektóre pytania dotyczące treści związane z Gibson Assembly wykazały znaczną poprawę zrozumienia, inne nie. Pytania dotyczące homologicznego nakładania się stosowanych w zespole Gibsona, sposobu ich instalacji i sposobu ich rekombinacji w reakcji klonowania zespołu Gibsona nie uległy poprawie. Sugeruje to, że dalsze wyjaśnienia lub dodatkowa ocena uczenia się na te tematy mogą poprawić zrozumienie przez uczniów w przyszłych wdrożeniach tego programu nauczania.
Niezależna struktura projektu Gibson Assembly jest nadal wdrażana w Cal Poly. W przyszłych iteracjach kursu projekt ten zostanie zmodyfikowany, aby umożliwić większą samodzielność uczniów, generowanie hipotez i projektowanie eksperymentów. Nadchodząca zmiana programu nauczania w Cal Poly stanowi okazję do wydłużenia niezależnego projektu o projekt elementarza prowadzony przez studentów, wybór szkieletu wektorowego, analizę sekwencji i / lub dalsze testowanie plazmidów, na przykład pod kątem ekspresji białek. Dodatkowo, niezależny projekt może zostać dostosowany do nauczania innych istotnych technik biologii molekularnej, takich jak mutageneza ukierunkowana na miejsce lub edycja genów, w zależności od potrzeb trwających projektów badawczych. Zmiana technik stosowanych przez studentów w niezależnym projekcie może zapewnić lepsze rozeznanie w kwestii tego, które tematy są odpowiednie dla formatu CURE, a które okazują się trudne do wdrożenia.
Podsumowując, raport ten szczegółowo opisuje adaptowalny moduł dydaktyczny Gibson Assembly, który wdraża CURE zarówno w celu poprawy zrozumienia przez uczniów nowej metodologii klonowania, jak i zwiększenia kompetencji w procesie naukowym. Niezależny projekt przyczynił się do poprawy wyników uczenia się uczniów i zwiększenia zaufania do większości ocenianych terminów i technik biologii molekularnej. Zachęcamy do korzystania i adaptacji tego modułu nie tylko w celu tworzenia nowych plazmidów badawczych, ale także w celu poprawy dostępności i zaufania studentów do technik badawczych, lepiej przygotowując studentów do przyszłej kariery w STEM. Idealnie byłoby, gdyby prace te zainspirowały ulepszenia w programach nauczania biologii molekularnej i zachęciły do adaptacji kursów STEM w miarę rozwoju metodologii badań naukowych.

Szkolenie studentów w zakresie podstawowych pojęć biologii molekularnej i technik laboratoryjnych jest kluczowe dla ich rozwoju naukowego i zawodowego, ponieważ te metodologie są powszechne w różnych środowiskach badawczych, w tym w środowisku akademickim i przemyśle. W związku z tym studenci kierunków biologii (koncentracja biologii molekularnej i komórkowej) oraz biochemii na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo (Cal Poly) są zobowiązani do wzięcia udziału w kursie laboratoryjnym biologii molekularnej wyższego szczebla, aby poznać i zastosować te tematy (CHEM / BIO 475). Podstawowy program nauczania dla tego kursu został wcześniej opracowany, w którym studenci wykonują klonowanie na bazie topoizomerazy (TOPO) w celu złożenia plazmidu zawierającego aktynę, który jest przygotowany z szablonu komplementarnego DNA drożdży (cDNA) 1. Studenci projektują eksperymenty w oparciu o pytania, które naśladują autentyczne hipotezy badawcze, zwiększając swoją znajomość praktyk laboratoryjnych i uczenia się opartego na dociekaniu. Ciągły postęp w dziedzinie biologii molekularnej wymaga, aby odpowiednie programy nauczania były dostosowywane w celu przygotowania studentów z nowoczesnymi kompetencjami do pracy na rynku pracy. W szczególności użycie Gibson Assembly stało się bardziej dominujące w środowisku naukowym; Chociaż metoda ta została pierwotnie opracowana do syntezy sztucznych chromosomów<klasa sup="xref">2, ponad 5000 publikacji w czasie tego raportu odnosiło się do oryginalnej pracy Gibsona i wsp. Montaż Gibsona jest wyjątkowy w porównaniu z tradycyjnymi metodologiami klonowania: jest wysoce konfigurowalny i może łatwo liminować wiele liniowych fragmentów DNA bez potrzeby stosowania miejsc restrykcyjnych w celu wytworzenia połączeń. W związku z tym dostrzegliśmy możliwość reorganizacji programu nauczania CHEM/BIO 475 w celu uwzględnienia nowoczesnych technik klonowania molekularnego i ulepszenia modelu kursu opartego na dociekaniu.</klasa>
Ustalono, że doświadczenia badawcze studentów przyczyniają się do lepszego zrozumienia koncepcji, rozwoju umiejętności i wytrwałości w nauce3, jednak nie wszyscy studenci studiów licencjackich mają możliwość bezpośredniego uczestnictwa w laboratorium badawczym. Aby sprostać wyzwaniu, jakim jest ograniczona liczba studentów w laboratoriach badawczych, opracowano i zastosowano doświadczenia badawcze oparte na kursach licencjackich (CURE) w celu zwiększenia dostępności nauki poprzez autentyczne badania w klasie. Chociaż CURE różnią się pod względem wdrożenia, ustanowiono wspólne praktyki, które odnoszą się do pięciu założeń badań naukowych. W dobrze zaprojektowanym CURE uczniowie będą 1) korzystać z praktyk naukowych, 2) współpracować w projekcie badawczym, 3) próbować dokonywać nowych odkryć, 4) przyczyniać się do pracy istotnej poza klasą oraz 5) ponownie oceniać i korygować hipotezy i metody w przypadku niepowodzenia eksperymentalnego4. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych doświadczeń badawczych studentów w laboratorium, wykazano, że CURE wzmacniają zaufanie uczniów do nauk ścisłych, umiejętności naukowych, odpowiedzialności za projekt i wytrwałości w naukach ścisłych, technologii, inżynierii i matematyce (STEM)5. Chociaż CUREs obejmujące klonowanie molekularne zostały zgłoszone wcześniej6,7,8,9,10,11,12,13, nie znamy żadnych, które podkreślałyby zdolność adaptacji Gibson Assembly do stworzenia biblioteki autentycznych badań plazmidy.
Tutaj informujemy o rozszerzeniu obecnego programu nauczania CHEM/BIO 475 opartego na dociekaniach na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo z dwoma głównymi ulepszeniami: praktycznym doświadczeniem w korzystaniu z Gibson Assembly i udziałem studentów w CURE, który dostarczył oryginalne konstrukcje plazmidowe dla projektów badawczych finansowanych przez National Science Foundation (NSF-1708919 i NSF-2300890). W ciągu trzech wdrożeń tego programu nauczania studenci przyczynili się do dwóch odrębnych projektów badawczych skoncentrowanych na naturalnej biosyntezie produktów bioaktywnych cząsteczek wytwarzanych przez Actinomycetota. Produkty naturalne często zawierają farmakofory o działaniu antybiotycznym, przeciwgrzybiczym i/lub przeciwnowotworowym, co nadaje tym małym cząsteczkom znaczenie w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków i potencjalne znaczenie kliniczne14. Badania te wymagają stworzenia bibliotek plazmidowych, które umożliwią badanie zarówno funkcji, jak i potencjału inżynieryjnego bakteryjnych enzymów biosyntetycznych. W tym CURE studenci zaprojektowali i przeprowadzili eksperymenty z montażem Gibsona, aby sklonować unikalne biblioteki plazmidów związane z tymi projektami badawczymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ponadto format i konstrukcja modułu są charakterystyczne, ponieważ można go łatwo dostosować do generowania dowolnych plazmidów interesujących dla innych projektów badawczych.</silna>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Rysunek 1: Przegląd roli Gibson Assembly w naszym laboratorium badawczym. Actinomycetota wytwarza małocząsteczkowe naturalne produkty o klinicznie istotnej bioaktywności przy użyciu klastrów genów kodujących enzymy biosyntetyczne. W naszych badaniach plazmidy zawierające gen biosyntezy są składane za pomocą zespołu Gibsona w celu dalszych badań funkcji kodowanego enzymu. Ikony nauki z Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Przegląd laboratorium
Laboratorium Biologii Molekularnej to kurs wyższej klasy wymagany dla kierunków biochemicznych i biologicznych z koncentracją biologii molekularnej i komórkowej. Inni studenci spełniający wymagania wstępne są mile widziani w kursie jako fakultatywnym kursie wyższej dywizji. Kurs jest współtworzony przez Wydział Chemii i Biochemii oraz Wydział Biologii w Cal Poly. Wykładowcy z obu wydziałów na zmianę prowadzą zajęcia w każdym semestrze (dwie ćwiartki biologii, jedna czwarta chemii i biochemii). 
Klasa spotyka się w laboratorium dwa razy w tygodniu na 170 minut i raz w tygodniu na 50-minutowym wykładzie. Sekcje laboratoryjne zawierają maksymalnie 16 uczniów, a co kwartał oferowane są 2–3 sekcje laboratoryjne. Kurs trwa 10 tygodni, a egzamin końcowy przeprowadzany jest podczas ostatniego spotkania w 10 tygodniu. Czas wykładu poświęcany jest na omawianie teorii stojącej za wieloma technikami eksperymentalnymi przeprowadzanymi w laboratorium, a także aktualnych tematów z biologii molekularnej, które nie są omawiane w laboratorium. Podstawa programowa laboratorium obejmuje proces klonowania genu aktyny z drożdży1, który trwa około 7 tygodni (13–14 spotkań laboratoryjnych). Techniki obejmują mikropipetowanie, izolację RNA drożdży, amplifikację genu drożdży za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), klonowanie TOPO, badania przesiewowe niebiesko-białe, izolację plazmidu i weryfikację insercji przez trawienie restrykcyjne i PCR, analizę in silico klonów oraz analizę sekwencji DNA. Program nauczania na ostatnie 3 tygodnie kursu jest w gestii instruktora, ale obejmuje uczniów wykonujących "niezależny projekt" z nieokreślonymi wynikami. 
Przegląd eksperymentu
Jednym z celów naszej grupy badawczej są szlaki biosyntezy u Actinomycetota. Projektując niezależny projekt, przewidzieliśmy sobie, że studenci stworzą plazmidy za pomocą Gibson Assembly do wykorzystania w naszych projektach badawczych dotyczących biosyntezy produktów naturalnych. Podczas gdy iteracje modułu kursu, które są tutaj oceniane, były specyficzne dla plazmidów, które pozwalają na manipulowanie szlakami biosyntezy, przepływ pracy Gibson Assembly jest niezwykle elastyczny dla innych projektów klonowania molekularnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Przepływ pracy został podzielony na trzy różne eksperymenty (A, B i C), które zostały przeprowadzone w dwóch okresach wykładów i sześciu okresach laboratoryjnych (łącznie 3 tygodnie) (patrz plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2). Eksperymenty zostały poprzedzone arkuszami roboczymi, które miały pomóc uczniom w przygotowaniu się i ocenić ich zrozumienie (Plik Uzupełniający 3, Plik Uzupełniający 4 i Plik Uzupełniający 5). Przepływ pracy jest prezentowany w formacie, który jest elastyczny w zależności od potrzeb i zainteresowań instruktora.</silna>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Rysunek 2: Przepływ pracy modułu montażowego Gibsona. Dzień 1 i Dzień 4 to okresy wykładowe, podczas których studenci przeprowadzają analizę sekwencji in silico i projekt eksperymentalny. Dni 2-3 i 5-8 to spotkania laboratoryjne, podczas których przeprowadzane są etapy klonowania nowych plazmidów za pomocą zespołu Gibsona, a następnie izolacja i badania przesiewowe. Obrazkowy schemat blokowy jest pogrupowany według trzech eksperymentów wykonywanych przez uczniów (A, B i C). Bardziej szczegółowe wskazówki i protokoły można znaleźć w Podręcznikach dla instruktorów i uczniów, które są dostarczane odpowiednio jako Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2. Ikony nauki z Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Moduł niezależnego projektu Gibson Assembly został po raz pierwszy pilotażowy w wiosennym kwartale 2019 roku w CHEM/BIO 475. W latach 2020 i 2021 kurs był prowadzony online ze względu na pandemię SARS-CoV-2. Kiedy wiosną 2022 i 2023 r. wznowiono nauczanie osobiste, studenci kursu zostali zaproszeni do udziału w badaniu oceniającym efekty uczenia się niezależnego projektu Gibson Assembly, w którym klonowane byłyby oryginalne, istotne dla badań plazmidy. W 2019 roku studenci stworzyli bibliotekę plazmidów składającą się z kaset genów z genomu Micromonospora echinospora ATCC 15837, które zostały sklonowane do pKC1132 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Ta biblioteka plazmidów jest wykorzystywana w naszym laboratorium badawczym do inaktywacji genów będących przedmiotem zainteresowania w przypuszczalnym klastrze genów biosyntetycznych dla produktu naturalnego TLN-0522015. Aby uzupełnić nasze badania nad inaktywacją genów, studenci w 2022 r. sklonowali niewielką bibliotekę genów z domniemanego klastra genów TLN-05220 do pUC19 (Fi<silna klasa="xfig">gure 3); nasza grupa badawcza wykorzystała te plazmidy do subklonowania genów do wektorów ekspresyjnych, w tym pET28b, do nadekspresji i oczyszczania białek. Studenci z kohorty 2023 przyczynili się do trwających prac nad projektem inżynierii biosyntetycznej na syntetazie epoksomycyny16. W zespołach 3-4 osobowych studenci sklonowali zmodyfikowane domeny modułów syntetazy peptydów nierybosomalnych17 do różnych wektorów ekspresji białek, aby zoptymalizować nadekspresję i oczyszczanie tych enzymów w naszym laboratorium badawczym (ryc. 3). Nadmiarowość została wbudowana w plan klonowania dla każdej kohorty. Na przykład kohorta z 2019 r. składała się z 44 uczniów, a 15 plazmidów zostało przydzielonych do klasy do klonowania. W związku z tym próbowano sklonować każdy plazmid dwa lub trzy razy.</silna></silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 3: Podsumowanie sklonowanych plazmidów i uczestników studenckich podczas niezależnych iteracji projektów w 2019, 2022 i 2023 roku. Projekt Gibson Assembly był wdrażany trzykrotnie. W każdej ofercie studenci klonowali inną bibliotekę plazmidów, które miały być wykorzystane w projektach badawczych badających szlaki biosyntezy. Projekty w 2019 i 2022 roku wsparły nasze trwające prace nad naturalnym produktem TLN-0522015 z dwoma fragmentami (jeden gen, kaseta lub gen i wektor) reakcjami Gibson Assembly. Projekt z 2023 r. obejmował zamianę domen w modułach 1 i 2 enzymu syntetazy peptydowej (NRPS) nierybosomalnej, który bierze udział w biosyntezie epoksomycyny16. Zakreskowane fragmenty reprezentują dwa różne mutanty zamienionej domeny, a jednolite kolory reprezentują domeny, które nie zostały zamienione. W sumie wygenerowano osiem różnych fragmentów genów (cztery dla modułu 1 i cztery dla modułu 2) z nawisami kompatybilnymi z montażem Gibsona. Dla każdego modułu, dwie różne kombinacje trzech fragmentów genów zostały połączone z jednym z dwóch różnych wektorów (pBAD33 i pET28, łącznie cztery fragmenty na zespół), co daje potencjał do wygenerowania ośmiu zmodyfikowanych plazmidów NRPS. Ikony nauki z Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
Przegląd oceny
Co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem niezależnego projektu Gibson Assembly, studenci z kohort 2022 i 2023 zostali zaproszeni do udziału w badaniu wyników uczenia się, zaprojektowanym podobnie do badania przeprowadzonego w ankiecie na kursie laboratoryjnym biochemii w Cal Poly18. Studenci-uczestnicy wypełnili kwestionariusz wielokrotnego wyboru na spotkaniu laboratoryjnym przed rozpoczęciem niezależnego projektu oraz kwestionariusz wielokrotnego wyboru po zakończeniu spotkania laboratoryjnego (tj. po ukończeniu modułu Gibson Assembly). Kwestionariusze wstępne i końcowe składały się z 28 identycznych pytań oraz dwóch dodatkowych pytań w kwestionariuszu końcowym (łącznie 30). Napisano dziesięć pytań merytorycznych, aby ocenić wiedzę uczniów na temat enzymów i mechanizmów związanych z klonowaniem molekularnym (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], montaż Gibsona, transformacja, badania przesiewowe niebiesko-białe). W kolejnych siedmiu pytaniach poproszono uczniów o samoocenę znajomości terminów związanych z klonowaniem molekularnym (np. polimeraza DNA, egzonukleaza, ligaza). Kolejne 10 pytań pozwoliło studentom na samoocenę swojej zdolności do wykonywania technik klonowania molekularnego (np. analiza sekwencji DNA, reakcje trawienia restrykcyjnego, elektroforeza w żelu agarozowym). Studenci stwierdzili również, czy czuliby się komfortowo, kontynuując karierę w biologii molekularnej w oparciu o swoją wiedzę na temat technik klonowania molekularnego. W kwestionariuszu zamieszczonym po zakończeniu kursu zawarto dwa dodatkowe pytania, aby umożliwić studentom samoocenę ich zaangażowania w naukę na kursie oraz to, czy kurs był wartościowym doświadczeniem edukacyjnym (Plik uzupełniający 6 i Plik uzupełniający 7). Wszystkie dane z odpowiedzi studentów przed i po kwestionariuszu z 2022 i 2023 roku zostały połączone do analizy i są dostępne w tabeli uzupełniającej S1.

<table><tbody><tr><td>Trifosforan dezoksyrybonukleotydu (dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Homemade' MasterMix składnik</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0861</td><td>Homemade' MasterMix składnik</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 jednostek</td></tr><tr><td>Inkubator mikrobiologiczny Fisherbrand Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Kąpiel wodna</td><td>Isotemp Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Barwnik w żelu z kwasami nukleinowymi</td><td>Biotium</td><td>NC9594719</td><td>10 000X</td></tr><tr><td>Ekstrakcja żelu GeneJET i mikrozestaw do oczyszczania DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Drabinka DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 zastosowań</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Domowy składnik MasterMix Mastercycler</td></tr><tr><td>nexus X2 Gradient Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Microfuge 16</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Bakterie Micromonospora echinospora</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Klasa biologii molekularnej Agaroza</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanokropla Jeden spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa Kompetentny E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0,05 ml</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 reakcji</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna New Brunswick Innova 40</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki BioReagenty Fisher</td><td></td><td>bez nukleaz</td><td>BP248450 50 ml</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimeraza New</td><td>England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr><tr><td>Przenośna waga</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 wektor New</td><td>England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 reakcji</td></tr><tr>T5 <td>Epicentrum</td><td>egzonukleazy</td><td>T5E4111K</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 ml</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Domowy składnik MasterMix</td></tr></tbody></table>

poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Ciągły postęp technik biologii molekularnej wymaga, aby programy nauczania biologii molekularnej były regularnie udoskonalane, aby skutecznie przygotować uczniów do wejścia na rynek pracy z nowoczesnymi kompetencjami. W szczególności pojawienie się Gibson Assembly, wysoce konfigurowalnej i adaptacyjnej techniki klonowania molekularnego, posunęło naprzód krajobraz klonowania molekularnego w wielu środowiskach badawczych. W związku z tym stworzyliśmy moduł klonowania Gibson Assembly do wdrożenia w laboratorium biologii molekularnej na Politechnice Kalifornijskiej w San Luis Obispo i oceniliśmy wyniki uczenia się studentów z tego modułu. W ciągu trzech iteracji kursu studenci uczestniczyli w niezależnym projekcie opartym na eksperymencie, który obejmował klonowanie trzech unikalnych bibliotek plazmidów w celu wsparcia projektów badawczych w zakresie biosyntezy produktów naturalnych. Studenci otrzymali kwestionariusze wstępne i końcowe, aby ocenić ich zrozumienie klonowania molekularnego i ich zaufanie do terminów i technik biologii molekularnej. Odpowiedzi studentów wykazały znaczny wzrost zarówno w poznawaniu koncepcji klonowania molekularnego, jak i w samoocenie pewności siebie w odniesieniu do terminów i technik klonowania molekularnego. Ten framework modułów można uogólnić, aby nauczać Gibson Assembly dla różnych zastosowań, zapewniając instruktorom zestaw narzędzi do nauczania elastycznej i pojawiającej się technologii klonowania podczas rozwijania ich projektów badawczych.

Adaptowalny moduł klonowania molekularnego Gibson Assembly został wykorzystany w formacie kursu opartego na kursie licencjackim (CURE) dla studentów kursów laboratoryjnych biologii molekularnej. Ocena efektów uczenia się studentów wykazała lepsze zrozumienie i pewność siebie w klonowaniu molekularnym po ukończeniu CURE, a nowe plazmidy sklonowano do badań nad biosyntezą produktów naturalnych.

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

Moja grupa badawcza koncentruje się na podstawach biologii molekularnej i biochemii biosyntetycznych linii montażowych u bakterii. Naszym celem jest zmodyfikowanie bakterii do produkcji nowych antybiotyków. Jesteśmy pasjonatami wprowadzania tej pracy do klasy, zapewniając uczniom praktyczne doświadczenie w najnowocześniejszych technikach biotechnologii.Klonowanie oparte na topoizomerazie jest obecnie stosowane w klasie biologii molekularnej na studiach licencjackich Cal Poly, aby zapoznać studentów z klonowaniem molekularnym. Montaż Gibsona stał się techniką klonowania molekularnego o znaczeniu przemysłowym, a my staramy się zapewnić studentom odpowiednie doświadczenia. Klonowanie molekularne to technika, która może być trudna do konceptualizacji w tradycyjnej klasie licencjackiej.Zaprojektowaliśmy praktyczny moduł laboratoryjny, w którym studenci projektują i oceniają swój eksperyment, a także przyczyniają się do autentycznych projektów badawczych. Zwiększa to ich zrozumienie procesu klonowania i zastosowań ich pracy. Podczas gdy inne doświadczenia badawcze oparte na kursach licencjackich wykorzystujące techniki klonowania molekularnego zostały opublikowane, żadne z nich nie zawiera adaptowalnego modułu montażowego Gibsona.Zaprojektowaliśmy wszystkie materiały do pomiaru efektów uczenia się dla tego doświadczenia badawczego opartego na kursie licencjackim. Mamy nadzieję, że posłuży to jako łatwe do wdrożenia narzędzie do edukacji naukowej, aby poprawić ocenę instruktorów i edukację studentów w laboratoriach biologii molekularnej na poziomie college'u. Aby rozpocząć, określ źródło matrycy DNA dla wstawek genów, takie jak genomowe DNA, plazmid lub syntetyczne DNA.Pobierz sekwencje DNA wstawień genów i wektora. Zaimportuj żądane sekwencje wstawiania i sekwencje wektorowe do Benchling jako nowe pliki sekwencji DNA. Następnie otwórz każdą zaimportowaną sekwencję, która ma być użyta w reakcji montażu Gibsona.Teraz zlokalizuj narzędzie Kreator montażu u dołu ekranu. Kliknij opcję Kreator złożeń, a następnie wybierz opcję Utwórz nowy zestaw. Z wyświetlonych opcji wybierz Gibson i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć składanie.W oknie Sekwencja wektorowa wybierz podstawy szkieletu wektora, zaczynając od 3 głównych końców wstawki genu do żądanego punktu końcowego. Po wybraniu kliknij kartę Szkielet u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. W oknie Wstaw sekwencję wybierz wszystkie podstawy wstawek, które mają zostać uwzględnione w zespole.Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. Jeśli istnieje wiele wstawek genów, kliknij przycisk plusa po prawej stronie Kreatora zestawów. W oknie Wstaw sekwencję wybierz wszystkie podstawy dla dodatkowej wkładki, która ma zostać uwzględniona w zespole.Po wybraniu kliknij kartę Wstaw u dołu ekranu i wybierz opcję Ustaw fragment. Po ustawieniu wszystkich fragmentów zmień nazwę zestawu na żądaną nazwę plazmidu. Kliknij przycisk Złóż po prawej stronie Kreatora złożeń.Następnie wybierz żądaną lokalizację folderu zarówno dla folderu sekwencji, jak i folderu startera, a następnie kliknij przycisk Utwórz, aby złożyć rekombinowaną sekwencję plazmidową. Teraz otwórz zmontowany plazmid i kliknij Historia złożenia, aby wyświetlić podstawową mapę plazmidu i przegląd sekwencji, z których został uzyskany. Na karcie Parametry zespołu wyświetl nazwy podkładów zaprojektowanych dla zespołu.Upewnij się, że dla każdej wstawki znajdują się dwa startery i że nazwy starterów pochodzą od tytułów plików sekwencji DNA. Upewnij się, że temperatury topnienia podkładu i sugerowane temperatury wyżarzania są zgodne. Po zakończeniu projektowania startera dla żądanych plazmidów kliknij przycisk Finalizuj w Kreatorze złożeń.Korzystając z gradientowego eksperymentu PCR z matrycami DNA, przetestuj zarówno pary starterów, jak i pary starterów specyficzne dla wektora, aby uzyskać optymalne temperatury wyżarzania. Po określeniu temperatur wyżarzania utwórz podwielokrotności roztworów starterów, matryce DNA i niezbędne odczynniki do reakcji PCR dla uczniów. Na początek zdobądź od instruktora startery i roztwory matryc DNA do PCR.Za pomocą pokazanych tutaj odczynników przygotuj 25-mikrolitrowe reakcje PCR, aby uzyskać liniowe fragmenty pożądanych sekwencji DNA. Cyklicznie przeprowadź reakcję w termocyklerze. Upewnij się, że temperatura wyżarzania jest odpowiednia dla podkładów i że czas wydłużania jest odpowiedni do długości pożądanego amplikonu.Następnie przeanalizuj pięć mikrolitrów każdej reakcji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Podczas działania żelu dodaj jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego DpnI do każdej reakcji, w której wykorzystano plazmidowe DNA jako matrycę. Inkubuj tę mieszaninę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie zobrazuj żel, aby potwierdzić, że PCR się powiódł i uzyskano prawidłową amplifikację. Oczyść wszelkie udane reakcje PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Zmierz stężenie oczyszczonego produktu PCR za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego do wykorzystania w kolejnych obliczeniach zespołu Gibsona.Odpipetuj elementy reakcji zespołu Gibsona. Inkubować reakcję w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut. Podczas inkubacji reakcji rozmrażaj chemicznie kompetentne komórki Escherichia coli na lodzie w celu transformacji.Przekształć dwa mikrolitry reakcji montażu Gibsona w chemicznie kompetentne ogniwa za pomocą szoku cieplnego. Odpipetować 100 mikrolitrów przekształconych komórek na dwie płytki selekcyjne i rozprowadzić wysterylizowanymi kulkami. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie policz kolonie na wszystkich płytkach i oblicz wydajność przemiany za pomocą podanego wzoru. Za pomocą markera wybierz i oznacz cztery odrębne kolonie na płytce selekcyjnej inicjałami ucznia i liczbą.Weź nową płytkę agarową LB zawierającą antybiotyki do selekcji i podziel ją na ćwiartki. Użyj około połowy każdej kolonii, aby ponownie przesunąć się na odpowiednią ćwiartkę. Dodaj odpowiednie stężenie antybiotyku do probówek oznaczonych tożsamością kolonii w celu selekcji.Następnie zaszczepij pięciomililitrową płynną kulturę LB drugą połową każdej z czterech wybranych kolonii. Inkubować płynne kultury w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, a płytkę agarową w inkubatorze statycznym w tej samej temperaturze. Wyizoluj plazmidowe DNA z płynnych kultur za pomocą mini zestawu przygotowawczego.Zmierz stężenie wyizolowanego plazmidowego DNA w nanogramach na mikrolitr. Po zaprojektowaniu przesiewowego badania przesiewowego PCR z przesyceniem restrykcyjnym w celu analizy izolowanych plazmidów, należy pipetować reakcje trawienia restrykcyjnego lub reakcje PCR. Następnie przeanalizuj wyniki za pomocą elektroforezy żelowej.Po ukończeniu modułu montażu Gibsona poproś uczniów-uczestników o wypełnienie kwestionariusza wielokrotnego wyboru na spotkaniu laboratoryjnym. Połącz wszystkie dane z odpowiedzi udzielonych w kwestionariuszu przed i po kwestionariuszu w celu analizy i oceń ich istotność statystyczną. Po zakończeniu projektu średni wynik treści znacznie wzrósł z 63,7% do 80,4%, co wskazuje na lepsze zrozumienie przez uczniów pojęć biologii molekularnej i klonowania.Średnia pewność siebie terminu znacznie wzrosła z 3,52 do 3,87, przy czym duży rozmiar efektu świadczy o lepszym zrozumieniu przez uczniów terminów biologii molekularnej. Pewność siebie przeciętnego studenta w wykonywaniu technik laboratoryjnych znacznie wzrosła z 3,82 do 4,33, co świadczy o zwiększonym komforcie z technikami biologii molekularnej. Liczba odpowiedzi wskazujących na znajomość terminu montaż Gibsona znacznie wzrosła od kwestionariusza przed i po, ze znaczącym wzrostem liczby osób, które potrafiły wyjaśnić ten termin.Pewność siebie w wykonywaniu techniki montażu Gibsona poprawiała się przy większości odpowiedzi, przechodząc od neutralnego lub niezgadzającego się przed sesją do zgadzania się lub zdecydowanego zgadzania się po. Pewność siebie uczniów w zakresie ogólnych zagadnień biologicznych nie wykazała statystycznie istotnych zmian. W przeciwieństwie do tego, zaufanie do specjalistycznych pytań montażowych Gibsona znacznie wzrosło.

improving-student-outcomes-with-an-adaptable-molecular-cloning-course

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Prezentujemy podejścia do biofizycznej i strukturalnej charakterystyki glikoprotein z fałdowaniem immunoglobulin za pomocą interferometrii biowarstwowej, izotermicznej kalorymetrii miareczkowej i krystalografii rentgenowskiej.

Charakterystyka glikoprotein z fałdem immunoglobulinowym za pomocą krystalografii rentgenowskiej i technik biofizycznych

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Celem tego protokołu jest wykorzystanie symulacji dynamiki molekularnej do zbadania dynamicznych zmian strukturalnych, które zachodzą w wyniku aktywacji mutacji białka kinazy EGFR.

Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej

Poznaj metodę Gibson Assembly w kursie badawczym CURE na studiach licencjackich. Studenci zwiększyli zrozumienie klonowania molekularnego i pewność siebie w pracy laboratoryjnej dzięki praktycznemu doświadczeniu.

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego (Wideo) | JoVE Journal

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

Przeglądaj więcej filmów