Name: CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę CIRCLE-seq do identyfikacji miejsc cięcia poza celem w edycji genów CRISPR-Cas9. Technika ta zwiększa bezpieczeństwo terapii genowych poprzez precyzyjne mapowanie niezamierzonych efektów w genomie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażam najgłębszą wdzięczność za wsparcie finansowe udzielone przez National Institutes of Health (R01AR078551 i T32AR007411), Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) Austria, Gates Grubstake Fund i Gates Frontiers Fund.

Detecting Off-Target CRISPR-Cas9 Cleavage Events with CIRCLE-Seq

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Frangoul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+editing+for+sickle+cell+disease+and+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and beta-thalassemia.</a> N Engl J Med. 384 (3), 252-260 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+treatment+inserted+directly+into+the+body+for+first+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR treatment inserted directly into the body for first time.</a> Nature. 579 (7798), 185(2020).</li>
<li>Gillmore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+in+vivo+gene+editing+for+transthyretin+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis.</a> N Engl J Med. 385 (6), 493-502 (2021).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
<li>Hong, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+base+editing+and+prime+editing+of+COL7A1+mutations+in+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic base editing and prime editing of COL7A1 mutations in recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Mol Ther. 30 (8), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+prime+editing+via+xrRNA+motif-joined+pegRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancement of prime editing via xrRNA motif-joined pegRNA.</a> Nat Commun. 13 (1), 1856(2022).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+editing+with+genuine+Cas9+nickases+minimizes+unwanted+indels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels.</a> Nat Commun. 14 (1), 1786(2023).</li>
<li>Howe, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+combined+with+acquired+somatic+mutations+causes+leukemogenesis+following+gene+therapy+of+SCID-X1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3143-3150 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li>
<li>Has, C., Kiritsi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapies+for+inherited+skin+fragility+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Therapies for inherited skin fragility disorders.</a> Exp Dermatol. 24 (5), 325-331 (2015).</li>
<li>Murnane, J. P., Yezzi, M. J., Young, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+events+during+integration+of+transfected+DNA+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Recombination events during integration of transfected DNA into normal human cells.</a> Nucleic Acids Res. 18 (9), 2733-2738 (1990).</li>
<li>Hsieh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndrome+unrelated+to+lentiviral+vector+in+a+patient+treated+with+gene+therapy+for+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndrome unrelated to lentiviral vector in a patient treated with gene therapy for sickle cell disease.</a> Blood Advances. 4 (9), 2058-2063 (2020).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 187-197 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Lensing, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSBCapture%3A+In+situ+capture+and+sequencing+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DSBCapture: In situ capture and sequencing of DNA breaks.</a> Nat Methods. 13 (10), 855-857 (2016).</li>
<li>Crosetto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-resolution+DNA+double-strand+break+mapping+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.</a> Nat Methods. 10 (4), 361-365 (2013).</li>
<li>Yan, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLISS+is+a+versatile+and+quantitative+method+for+genome-wide+profiling+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks.</a> Nat Commun. 8, 15058(2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digenome-seq%3A+Genome-wide+profiling+of+CRISPR-Cas9+off-target+effects+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Digenome-seq: Genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.</a> Nat Methods. 12 (3), 237-243 (2015).</li>
<li>Cameron, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+genomic+landscape+of+CRISPR-Cas9+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.</a> Nat Methods. 14 (6), 600-606 (2017).</li>
<li>Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+detection+with+DISCOVER-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).</li>
<li>Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1143157(2023).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Lazzarotto, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+CRISPR-Cas9+genome-wide+nuclease+activities+with+CIRCLE-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.</a> Nat Protoc. 13 (11), 2615-2642 (2018).</li>
<li>Butterfield, K. T., McGrath, P. S., Han, C. M., Kogut, I., Bilousova, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+with+the+constitutive+EGFP+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line with the constitutive EGFP reporter.</a> Methods Mol Biol. 2155, 11-21 (2020).</li>
<li>Hayashi, H., Kubo, Y., Izumida, M., Matsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+viral+delivery+of+Cas9+into+human+safe+harbor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient viral delivery of Cas9 into human safe harbor.</a> Sci Rep. 10 (1), 21474(2020).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nat Commun. 9 (1), 745(2018).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+The+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).</li>
<li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nat Protoc. 16 (1), 10-26 (2021).</li>
<li>Cromer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+CRISPR+off-target+discovery+tools+following+ex+vivo+editing+of+CD34%28%2B%29+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of CRISPR off-target discovery tools following ex vivo editing of CD34(+) hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Mol Ther. 31 (4), 1074-1087 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym przypadku wykazano, że CIRCLE-seq jest bezstronną i bardzo czułą techniką identyfikacji DSB indukowanych nukleazą w całym genomie, wynikającą z celowania w locus AAVS1 w gDNA pochodzącym z iPSC. Miejsce AAVS1 w iPSC jest dobrze znane jako locus bezpiecznej przystani, który jest często używany jako miejsce integracji genów egzogennych przy użyciu CRISPR-Cas928. W naszym ostatnim raporcie zbadaliśmy potencjał iPSC znakowanych EGFP, przeprowadzając integrację za pośrednictwem CRISPR konstytutywnie wyrażonego reportera EGFP z miejscem AAVS1 , co umożliwia znakowanie i śledzenie zarówno iPSC, jak i zróżnicowanych iPSC ze względu na utrzymywanie się EGFP w całej linii komórki27. Ta linia iPSC może być stosowana in vivo do oceny rozmieszczenia komórek pochodzących z iPSC w organizmie po przeszczepie. Ponieważ ta linia komórkowa została zmodyfikowana za pomocą CRISPR i jest również wykorzystywana do testowania klinicznego zastosowania iPSC, konieczne jest, aby potencjalne miejsca poza miejscem docelowym AAVS1 zostały poznane i zbadane w celu zapewnienia bezpieczeństwa i skuteczności, co czyni ją idealnym miejscem do testowania CIRCLE-seq.
Zauważalną różnicą między Butterfieldem i wsp., wcześniej opublikowanym badaniem27 a tym było zastosowanie zmodyfikowanego gRNA do celowania w locus AAVS1. GRNA można zaprojektować w celu poprawy dokładności edycji genomu24. Sekwencja prowadząca jest najważniejszym czynnikiem, który wpływa na wydajność po osiągnięciu i poza celem. Dlatego wybrane gRNA zostało przetestowane w porównaniu z kilkoma innymi przewodnikami i stwierdzono, że ma lepszą wierność. Ponadto artykuł dotyczący metod przeprogramowania ludzkich fibroblastów potwierdził odkrycie, że syntetyczne mRNA z czapeczką zawierające zmodyfikowane zasady nukleinowe czerpią korzyści z niskiej aktywacji odpowiedzi przeciwwirusowych29,30. Chociaż niska immunogenność może nie być istotna w teście in vitro, staje się kluczowa, gdy ostatecznym celem jest opracowanie klinicznie istotnej terapii, którą można zastosować w żywych komórkach.
CIRCLE-seq ma wiele zalet w porównaniu z podobnymi metodami. Na przykład, sekwencja Digenome-seq sekwencjonuje zarówno gDNA rozszczepione nukleazą, jak i nierozszczepione, używając ~ 400 milionów odczytów21. Powoduje to wysokie tło, co utrudnia odfiltrowanie miejsc cięcia o niskiej częstotliwości w dobrej wierze. CIRCLE-seq wykorzystuje tylko ~ 3-5 milionów odczytów ze względu na wzbogacenie gDNA rozszczepionego nukleazą, co skutkuje niskim tłem. Dodatkowo, Digenome-seq i podobna metoda, SITE-seq, opierają się na sekwencjonowaniu pojedynczego końca DNA rozszczepionego nukleazą. W przeciwieństwie do tego, odczyty CIRCLE-seq obejmują oba końce miejsca cięcia, umożliwiając identyfikację miejsc poza celem bez konieczności stosowania odniesienia 21,22,26.
Zaletą CIRCLE-seq jest jego większa czułość w porównaniu z metodami opartymi na hodowli komórkowej, takimi jak GUIDE-seq. Po porównaniu obu metod, zespół projektu CIRCLE-seq był w stanie uchwycić wszystkie miejsca wykryte przez GUIDE-seq poza celem i odkrył dodatkowe niezamierzone miejsca rozszczepienia, które zostały pominięte przez GUIDE-seq. Zauważalna różnica polega jednak na tym, że GUIDE-seq może być utrudniony przez krajobraz epigenetyczny, podczas gdy CIRCLE-seq może uzyskać dostęp do całego genomu.
Jako test in vitro , CIRCLE-seq ma kilka ograniczeń, z których pierwszym jest wykrywanie wyników fałszywie dodatnich. Podczas gdy epigenetyka będzie utrudniać aktywność nukleazy w niektórych miejscach in vivo, ultradźwięki usuwają te przeszkody in vitro, umożliwiając aktywność poza celem w miejscach, które normalnie mogą być niedostępne w kontekście komórkowym. Ponadto Cas9 jest obecny w wysokich stężeniach w tym teście in vitro , co pozwala na rozszczepienie, które w innym przypadku nie byłoby możliwe in vivo. Test ten wymaga również stosunkowo dużej ilości wyjściowego gDNA, co, w zależności od dostępnych zasobów, może zanegować użycie tego protokołu. Wreszcie, możliwe jest, że niektóre miejsca poza celem mogą być niewykrywalne ze względu na ograniczenia obecnych technologii sekwencjonowania nowej generacji.
W niedawnym badaniu wykorzystano podejście in silico , w którym algorytm zidentyfikował szereg istotnych parametrów, z którymi można porównać różne metody charakteryzacji nukleaz, w tym CIRCLE-seq i GUIDE-seq31. Dwa z istotnych parametrów to "wzbogacenie miejsca cięcia" i "% wyników fałszywie dodatnich". Co ciekawe, odsetek wyników fałszywie dodatnich w przypadku CIRCLE-seq obliczono na poziomie 88%, ale wzbogacenie w miejsca cięcia było wielokrotnie wyższe niż w przypadku innych metod in vitro . Analizy porównawcze każdej z metod wykazały, że GUIDE-seq okazał się najskuteczniejszy, ponieważ wykazał największą swoistość w odniesieniu do celu przy zaledwie umiarkowanym odsetku wyników fałszywie dodatnich32. Nie unieważnia to CIRCLE-seq, ale raczej sugeruje możliwość wykorzystania CIRCLE-seq i GUIDE-seq w tandemie, potwierdzając wyniki CIRCLE-seq za pomocą GUIDE-seq, ponieważ pierwsza z nich ma wyższą czułość, podczas gdy druga jest metodą opartą na komórkach o wysokim wzbogaceniu miejsca cięcia. Dane wskazują również, że sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) oparte na amplikonach powinno być preferowaną metodą identyfikacji rzeczywistych modyfikacji niedocelowych w potencjalnych lokalizacjachkandydujących 31. Dane te sugerują potencjalną strategię wykorzystania CIRCLE-seq, następnie GUIDE-seq, a następnie NGS opartego na amplikonie w celu zbadania efektów off-target.

Inżynieria genomu odnotowała znaczący postęp w ciągu ostatnich dwudziestu lat, z głównym kamieniem milowym jakim było odkrycie w 2012 roku zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-Cas91. Wykorzystując programowalny charakter endonukleaz bakteryjnego DNA, technologia CRISPR-Cas9 umożliwia precyzyjne celowanie i modyfikację niemal każdej sekwencji DNA. Od samego początku system został zoptymalizowany tak, aby opierał się wyłącznie na endonukleazie Cas9 i przewodnikowym RNA (gRNA) do edycji określonych regionów genomu. Potencjał CRISPR-Cas9 jako terapii leczniczej został wykazany w badaniach klinicznych dotyczących różnych schorzeń, takich jak między innymi wrodzona ślepota Lebera, amyloidoza transtyretynowa i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa2,3,4.
CRISPR-Cas9 indukuje dwuniciowe przerwy (DSB), które zazwyczaj są rozwiązywane przez jeden z dwóch mechanizmów: podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub bardziej precyzyjną naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), pod warunkiem, że dostępna jest matryca DNA. Tendencja CRISPR-Cas9 do powodowania insercji i delecji (indelii) związanych z NHEJ, wraz z rozszczepieniem w niezamierzonych miejscach genomu, ogranicza jego zastosowanie w warunkach klinicznych5,6,7,8,9,10. Dodatkowo, niezamierzone modyfikacje genomu mogą tworzyć tajemnicze miejsca splicingu, mutacje nonsensowne lub missense, indukować chromothripsis lub nadawać potencjał onkogenny komórkom - wyniki, które zaobserwowano w kilku próbach edycji genomu11,12,13,14,15. Podsumowując, dokładna identyfikacja niezamierzonej aktywności CRISPR-Cas9 ma kluczowe znaczenie dla jego zastosowań klinicznych, szczególnie w ogólnoustrojowych terapiach genowych, które mogą zmienić miliardy komórek.
Różne metody mogą być stosowane do identyfikacji miejsc cięcia CRISPR-Cas9 poza celem, w tym Genome-wide Unbiased Identification of Double-stranded breaks (GUIDE)-seq16, który wykorzystuje dwuniciowe oligodeoksynukleotydy do oznaczania DSB w żywych komórkach. Niemniej jednak krytyka tej metody polega na tym, że fałszywe alarmy mogą wynikać z losowych DSB lub artefaktów PCR, które należy odrzucić, wykluczając przechwycone witryny, które wykazują słabe podobieństwo do witryn docelowych. Metoda oparta na użyciu wektora lentiwirusowego z wadą integrazy (IDLV) jest mniej czuła i prawdopodobnie pominie wiele miejsc poza celem17. Inne metody in situ, takie jak DSBCapture, BLESS i BLISS18,19,20 obejmują stałe komórki i bezpośrednio oznaczają DSB, jednak są ograniczone przez ich zależność od natychmiastowego wychwytywania DSB i brak egzogennego DNA. Digenome-seq21, metoda in vitro, oraz Selektywne wzbogacanie i identyfikacja oznaczonego genomowego DNA kończy się sekwencjonowaniem (SITE-seq)22 zapewniają rozwiązania do sekwencjonowania, ale mają swoje ograniczenia odpowiednio w szumie tła i analizie pojedynczego końca. Wykrywanie in situ Cas off-targets i weryfikacja za pomocą sekwencjonowania (Discover-Seq)23 oferuje identyfikację in vivo i in situ aktywności Cas9 poprzez wiązanie MRE11, ale wykrywa tylko DSB, które istnieją w momencie przygotowania próbki24. Wreszcie, Wnioskowanie o edycjach CRISPR (ICE) wykorzystuje podejście bioinformatyczne do solidnej analizy edycji CRISPR przy użyciu danych Sangera25.
Ten artykuł opisuje szczegółową procedurę cyrkularyzacji dla In Vitro Reporting of Cutavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq): technika in vitro, która z wyczuciem i bezstronnością mapuje aktywność nukleazy Cas9 w całym genomie poza celem w kompleksie z interesującym gRNA26. Podejście to rozpoczyna się od hodowli komórek będących przedmiotem zainteresowania i wyizolowania DNA, po czym następuje losowe ścinanie za pomocą zogniskowanych ultradźwięków, a następnie leczenie egzonukleazą i ligazą. Proces ten ostatecznie wytwarza koliste dwuniciowe cząsteczki DNA, które są następnie oczyszczane poprzez bezpieczne dla plazmidu traktowanie DNazą. To koliste DNA jest następnie wystawiane na działanie kompleksu Cas9-gRNA, który rozszczepia się zarówno w zamierzonych, jak i niezamierzonych miejscach cięcia, pozostawiając odsłonięte końce DNA, które działają jako substraty do ligacji adaptera Illumina. W wyniku tego procesu powstaje zróżnicowana biblioteka genomowego DNA (gDNA) zawierająca oba końce każdego DSB indukowanego nukleazą, zapewniając, że każdy odczyt zawiera wszystkie informacje niezbędne dla każdego miejsca rozszczepienia. Pozwala to na zastosowanie sekwencjonowania Illumina z niższymi wymaganiami dotyczącymi pokrycia sekwencjonowania, co odróżnia CIRCLE-seq od innych podobnych metod wymienionych powyżej. Należy zauważyć, że chociaż CIRCLE-seq ma wyższą czułość poza celem niż inne protokoły jako metoda in vitro, odbywa się to kosztem większej liczby wyników fałszywie dodatnich ze względu na brak krajobrazu epigenetycznego, który jest obecny w innych metodach, takich jak GUIDE-seq16. Dodatkowo, naprawa DNA DSB i związana z nią maszyneria nie są obecne w CIRCLE-seq, znosząc indele lub prawidłową naprawę, która w przeciwnym razie zostałaby zaobserwowana.
Oprócz opisu krok po kroku protokołu do wykonania CIRCLE-seq, protokół jest weryfikowany poprzez identyfikację niezamierzonych miejsc cięcia CRISPR-Cas9 w całym genomie, które występują podczas modyfikacji locus AAVS1, jako przykład. Ten łatwy do naśladowania protokół zawiera szczegółowe instrukcje, od hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i izolacji gDNA po krążenie gDNA, szczepienie Cas9-gRNA, przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie i analizę rurociągu. Biorąc pod uwagę niskie wymagania dotyczące pokrycia sekwencjonowaniem, CIRCLE-seq jest dostępny dla każdego laboratorium z dostępem do sekwencjonowania nowej generacji.

<table><tbody><tr><td>Probówki cienkościenne i płaskie 0,2 ml Kaseta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB1114</td><td></td></tr><tr><td>1,5% PippinHT</td><td>Sage Science</td><td>HTC1510</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>12567603</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>FisherScientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 150 x 25 mm&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki 25 mL&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>2138127C</td><td></td></tr><tr><td>2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipety serologiczne&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>FisherScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>50x bufor do elektroforezy TAE&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Odczynnik Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP, 60 ml</td> Mikrowirówka <td>stołowa Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5400002</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer QX1</td><td>Qiagen</td><td>20912</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza Cas9, Streptococcus Pyogenes&nbsp; </td><td>New England BioLabs</td><td>M0386M</td><td></td></tr><tr><td>CIRCLE-seq Przygotowanie biblioteki i NGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) do hodowli iPSC</td></tr><tr><td>ddPCR SuperMix do sond&nbsp;</td><td></td> Uchwyt na kartridże <td>Bio-Rad</td> 1863010 <td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Wkłady Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Uszczelki Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>Made by Invitrogen</td></tr><tr><td>Olej do sond Droplet Generation&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Olejek do czytnika kropelek&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0, bez RNaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>Made by Invitrogen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Mieszalnik termiczny&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, czysta</td> egzonukleaza <td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>I&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293L</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki</td><td></td><td></td><td></td>do pipet z filtrem</tr><tr><td>, skoncentrowane ultradźwięki&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>ME220</td><td></td></tr><tr>Izolacja <td></td><td></td><td></td><td>genomowego DNA</td></tr><tr><td>Genomowe ścinanie</td><td></td><td></td><td></td>DNA</tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Core Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>158043</td><td></td></tr><tr><td>gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS Trójgazowy nawilżany inkubator kultur tkankowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51030411</td><td>Potrzeba hodowli i ekspansji iPSC (37 &deg; C/5% CO2/5% O2)</td></tr><tr><td>Taśma do przesiewania DNA o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki HTP&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8235</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>Cytiva</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>IDTE pH 8,0 (1x roztwór TE)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>11050204</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td></td><td></td> odwrócony <td>Potrzeba obrazowania kolonii iPS w jasnym polu i kanałach fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Kultura</td><td></td><td></td><td></td>iPSC</tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Egzonukleaza&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262L</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania, 10 sztuk</td><td>Agilent</td><td>5067-5599</td><td></td></tr><tr><td>Magnum FLX Enhanced Uniwersalna płyta magnetyczna&nbsp;</td><td>Alpaqua</td><td>A00400</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>31104051</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap&nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 5x Suplement</td><td>StemCell Technology</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)</td><td>StemCell Technology</td><td>85851</td><td>Pożywka do utrzymania iPSC w hodowli</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop 8000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multipleks Oligos dla Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Zestaw podkładów Dual Index</td></tr> 1 <tr><td>Nasadki do tub optycznych, 8 pasków</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Paski tub optycznych, 8 pasków</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do płytek PCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>Numer modelu PX1</td></tr><tr><td>Roztwór PEG/NaCl SPRI&nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0536L</td><td></td></tr><tr><td>Folia przebijalna zgrzewana&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczna plazmidowa DNaza zależna od ATP&nbsp;</td><td>Epicentrum</td><td>E3110K</td><td></td></tr><tr><td>Startery, adaptery i sondy</td><td>Sekwencje IDT</td><td></td><td>są wymienione w Tabeli 1</td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td>Zestaw do ekstrakcji żelu <td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;</td>System analizy żeli <td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAxcel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do oznaczania kubitów</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA BR&nbsp;</td>Zestaw testowy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR&nbsp;</td>Zestaw testowy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS&nbsp;</td>Fluorometr kubitowy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Cyfrowy system PCR kropelkowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td>Zawiera generator kropel QX200 i czytnik kropel QX200</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Półspódniczkowa płytka PCR&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>SeqPlaque GTG Agaroza&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50110</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny żel do barwienia DNA&nbsp;</td><td>Ligaza DNA ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Kolby&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>7202000</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler z programowalną funkcją krokowania temperatury</td><td>Bio-Rad C1000 Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR Plate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E951020346</td><td>96 studzienek, częściowo listwowych, zielona</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz&nbsp;</td><td>Enzym użytkownika ThermoFisher</td><td>Scientific 10977015</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M5505L</td><td></td></tr></tbody></table>

circle-seq do badania edycji genów poza celem

CIRCLE-Seq for Interrogation of Off-Target Gene Editing

Circularization for In Vitro Reporting of Cutavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) to nowatorska technika opracowana do bezstronnej identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia CRISPR-Cas9 poprzez ukierunkowane sekwencjonowanie DNA rozszczepionego CRISPR-Cas9. Protokół obejmuje krążenie genomowego DNA (gDNA), które jest następnie traktowane białkiem Cas9 i przewodnikiem RNA (gRNA) będącym przedmiotem zainteresowania. Po poddaniu działaniu substancji rozszczepione DNA jest oczyszczane i przygotowywane jako biblioteka do sekwencjonowania Illumina. Proces sekwencjonowania generuje odczyty sparowanych końców, oferując kompleksowe dane na temat każdego miejsca rozszczepienia. CIRCLE-seq zapewnia kilka zalet w porównaniu z innymi metodami in vitro, w tym minimalne wymagania dotyczące głębokości sekwencjonowania, niskie tło i wysokie wzbogacenie gDNA rozszczepionego Cas9. Te zalety zwiększają czułość w identyfikowaniu zarówno zamierzonych, jak i niezamierzonych zdarzeń związanych z dekoltem. Badanie to zapewnia kompleksową, krok po kroku procedurę badania niezamierzonej aktywności CRISPR-Cas9 przy użyciu CIRCLE-seq. Na przykład protokół ten jest weryfikowany poprzez mapowanie niezamierzonych miejsc rozszczepienia CRISPR-Cas9 w całym genomie podczas modyfikacji locus AAVS1. Cały proces CIRCLE-seq można zakończyć w ciągu dwóch tygodni, co daje wystarczająco dużo czasu na wzrost komórek, oczyszczenie DNA, przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie Illumina. Wprowadzanie danych sekwencjonowania do potoku CIRCLE-seq ułatwia usprawnioną interpretację i analizę miejsc rozszczepienia.

W niniejszej procedurze zastosowano metodę CIRCLE-seq w celu zbadania miejsc cięcia indukowanych przez nukleazę Cas9 w kompleksie z gRNA zaprojektowanym do celowania w miejsce integracji wirusa towarzyszącego adenowirusom 1 (AAVS1), przy użyciu DNA wyizolowanego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). Ten gRNA został wcześniej opisany w naszej publikacji27. Z iPSCs wyizolowano około 25 μg gDNA, który poddano fragmentacji za pomocą ukierunkowanej sonikacji, a następnie selekcji rozmiaru poprzez oczyszczanie kuletkami AMPure XP, aby uzyskać fragmenty o długości ok. 300 bps. Z tych 25 μg DNA pomyślnie scyklizowano ok. 2-5 ng DNA do cięcia Cas9:gRNA in vitro. Cała procedura została przedstawiona na Rysunku 1.
Po przeprowadzeniu procedury CIRCLE-seq i analizie z wykorzystaniem naszego schematu obliczeniowego, wizualizacja wszystkich wykrytych miejsc cięcia w obrębie celu (on-target) i poza celem (off-target) została przedstawiona na Rysunku 2A. Potok CIRCLE-seq dostarczył również „złączonych odczytów” (merged reads), które przeanalizowano za pomocą oprogramowania statystycznego R, aby uzyskać wykres Manhattan ukazujący wykryte miejsca cięcia indukowane przez nukleazę, zmapowane wzdłuż każdego chromosomu (Rysunek 2B).
<img alt="Schemat procedury CIRCLE-seq: hodowla komórkowa, izolacja gDNA, cięcie, cyrkularyzacja, sekwencjonowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury CIRCLE-seq. Wskazano główne etapy protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza edycji genu AAVS1; wykres dopasowania sekwencji i wykres liczby odczytów CIRCLE-seq w podziale na chromosomy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67069/67069fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Wizualizacja CIRCLE-seq i wykres Manhattan. (A) Dopasowanie miejsc poza celowych (off-target) do zamierzonego celu dla locus AAVS1. Sekwencja docelowa znajduje się na górze, a miejsca off-target są uszeregowane według liczby odczytów w kolejności malejącej. Różnice w oryginalnych sekwencjach docelowych są zaznaczone kolorowymi nukleotydami. Przedstawiono próbkę najwyżej ocenianych niezamierzonych miejsc cięcia dla locus AAVS1. (B) Wykres Manhattan ilustrujący wykryte niezamierzone miejsca cięcia dla locus AAVS1. Wysokość słupków reprezentuje liczbę odczytów dla każdej pozycji chromosomowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67069/67069fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter</td>
			<td>Sekwencja (5'-3')</td>
			<td>Komentarze/Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pojedyncze przewodnie RNA (sgRNA) dla AAVS1</td>
			<td>GGGGCCACUAGGGACAGGAU</td>
			<td>Dla knock-inu białka fluorescencyjnego w locus AAVS1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter bezpośredni AAVS1</td>
			<td>GCTCTGGGCGGAGGAATATG</td>
			<td>Do testu cięcia gRNA in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krajowy primer wsteczny AAVS1</td>
			<td>ATTCCCAGGGCCGGTTAATG</td>
			<td>Do testu cięcia gRNA in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1288</td>
			<td>/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT</td>
			<td>adapter spinka do metody CIRCLE-seq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1274</td>
			<td>AATGATACGGCGACCACCGAG</td>
			<td>TruSeq F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1275</td>
			<td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT</td>
			<td>TruSeqF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1310</td>
			<td>/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/</td>
			<td>sonda TruSeq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oSQT1311</td>
			<td>/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/</td>
			<td>sonda TruSeq</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje gRNA i starterów użytych do analizy CIRCLE-seq locusu AAVS1.

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing (CIRCLE-seq) is a novel technique developed for the impartial identification of ...

Nasz zespół zajmuje się opracowywaniem terapii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, iPSC, dla ciężkich, obecnie nieuleczalnych chorób skóry, takich jak recesywne dystroficzne pęcherzowe oddzielanie się naskórka. Naszym celem jest ustalenie, czy precyzyjna edycja genów w połączeniu z różnicowaniem iPSC w komórki skóry może stanowić realną opcję leczenia tych schorzeń. Edycja genów w komórkach somatycznych i iPSC przy użyciu technologii CRISPR-Cas9 przekształca medycynę regeneracyjną, umożliwiając spersonalizowane terapie różnych chorób, w tym genetycznych chorób skóry.Obecne wyzwania w inżynierii genetycznej obejmują niezamierzone efekty edytorów genów. Terapia wymaga edytorów genów, które precyzyjnie korygują interesujący nas gen bez zmiany jakichkolwiek innych lokalizacji w genomie. Naszym wyzwaniem jest wykazanie, że edytorzy genów nie wprowadzają niezamierzonych zmian poza genem docelowym.Protokół CIRCLE-seq umożliwia identyfikację potencjalnych miejsc niedocelowych, które mogą zostać pominięte w innych podobnych technikach. Kompleksowa analiza tych niedocelowych miejsc dostarcza cennych informacji na temat aktywności edytorów genomu, zwiększając bezpieczeństwo terapii genowych, w tym naszej terapii chorób skóry opartej na IPSC. Po wyhodowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przez pięć dni, zbierz komórki przez odwirowanie i zawieś je ponownie w 10 mililitrach PBS.Wymieszaj sześć mikrolitrów zawiesiny komórkowej z sześcioma mikrolitrami błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Po zliczeniu podwielokrotność dwa razy 10 do potęgi siedmiu komórek na probówkę. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Przygotować skoncentrowany ultrasonograf, naprowadzając ramię sterujące. Napełnij zbiornik oczyszczoną, dejonizowaną wodą. Na laptopie stacji sterującej uzyskaj dostęp do wodociągów i kliknij napełnij, aby rozpocząć napełnianie systemu.Dostosuj temperaturę do 4,5 stopnia Celsjusza. Przenieś 25 mikrogramów genomowego DNA wyizolowanego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do mikroprobówki. Napełnij probówkę do całkowitej objętości 130 mikrolitrów buforem TE.Ustaw warunki do ścinania DNA do średniej długości 300 par zasad, czasu trwania 10 sekund, mocy szczytowej 70, procentu współczynnika wypełnienia do 20 i pękania cykli do 50. Podziel ścięte genomowe DNA na dwie porcje po 65 mikrolitrów każda. Oczyść próbki, używając 1,8-krotności objętości kulek XP, a następnie oddziel je za pomocą stojaka magnetycznego.Przenieść supernatant na nową płytkę PCR i zmierzyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru. Na koniec uruchom jeden mikrolitr wspomnianego genomowego DNA ścinającego na stacji taśmowej. Na początek ponownie zawiesić oSQT1288 i adapter spinki do włosów do końcowego stężenia 100 mikromolów w buforze TE.Do wyżarzania adapterowego wymieszaj 40 mikrolitrów oSQT1288, 10 mikrolitrów 10X STE i 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 100 mikrolitrów. Po wyżarzaniu adaptera wymieszaj 10 mikrolitrów buforu do ligacji 5X, pięć mikrolitrów ligazy DNA i pięć mikrolitrów wyżarzonego adaptera spinki do włosów, Pipetę 20 mikrolitrów mieszanki głównej ligacji adaptera z każdą eluowaną próbką DNA zawierającą kulki. Umieść próbki w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza na godzinę, a następnie trzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez nieokreśloną czas.Następnie przenieś 50 mikrolitrów roztworu do rozpylania PEG/NaCl do DNA podwiązanego adapterem. Oczyść próbki za pomocą kulek XP i separacji magnetycznej. Eluować próbki za pomocą 30 mikrolitrów buforu TE o pH ósmym i zdekantować supernatanty na nową płytkę PCR z półspódniczką.Połączyć próbki i określić ilościowo DNA za pomocą testu dsDNA BR. Aby przygotować główną mieszankę cyrkularyzacyjną, połącz osiem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 10 mikrolitrów buforu ligazy DNA 10X TD4 i dwa mikrolitry ligazy DNA T4, aby uzyskać łączną objętość 20 mikrolitrów. Odpipetować 20 mikrolitrów głównej mieszanki cyrkularyzacyjnej do 80 mikrolitrów 500 nanogramów DNA poddanych działaniu PNK użytkownika.Próbkę inkubować w termocyklerze w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów kulek XP do okrągłego DNA i oczyść próbki, jak pokazano wcześniej. Eluować próbkę za pomocą 38 mikrolitrów buforu TE i zdekantować supernatant na nową płytkę PCR z półspódniczką.Aby rozszczepić oczyszczone, okrężne genomowe DNA, należy przygotować główną mieszankę rozszczepienia in vitro, łącząc pięć mikrolitrów buforu 10X Cas9, 4,5 mikrolitra Streptococcus pyogenes Cas9 i 1,5 mikrolitra genomowego RNA, co daje łączną objętość 11 mikrolitrów. Inkubować główną mieszankę łupliwości w temperaturze pokojowej przez 10 minut. do tworzenia kompleksów Cas9 gRNA RNP.Rozcieńczyć 125 nanogramów bezpiecznego dla plazmidu genomowego DNA poddanego działaniu DNazy do końcowej objętości 39 mikrolitrów w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki rozszczepienia do 39 mikrolitrów DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 50 mikrolitrów. Inkubuj mieszaninę w termocyklerze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez czas nieokreślony.Po inkubacji dodaj 50 mikrolitrów kulek XP do rozszczepionego DNA in vitro i oczyść DNA na stojaku magnetycznym. Eluować oczyszczone DNA w 42 mikrolitrach buforu TE. Aby przeprowadzić analizę danych sekwencjonowania nowej generacji, zainstaluj język Python w wersji 2.7, Burrows-Wheeler Aligner i SAMtools.Pobierz genom referencyjny z podanej strony internetowej. Zdefiniuj plik FASTA genomu referencyjnego, katalog wyjściowy do analizy oraz ścieżki do poleceń BWA i SAMtools. Określ sekwencje docelowe i ścieżki do zdemultipleksowanych plików FASTQ zarówno dla próbek rozszczepionych nukleazą, jak i próbek kontrolnych.Wykonaj standardową analizę opartą na odwołaniach za pomocą następującego polecenia. Podczas wykonywania pełnego potoku znajdź wyniki wyjściowe każdego kroku w odrębnym folderze wyjściowym wyznaczonym dla tego konkretnego kroku.

circle-seq-for-interrogation-of-off-target-gene-editing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Dostarczanie edytorów genomu jako RNA jest szczególnie skuteczną metodą modyfikacji genomów komórek pierwotnych ssaków i linii komórkowych. Celem tego protokołu jest dostarczenie edytorów genomu jako mRNA do pierwotnych komórek ssaków i linii komórkowych, po którym następuje ukierunkowane sekwencjonowanie i analiza Illumina w celu ilościowego określenia wyników edycji.

Edycja genomu w pierwotnych komórkach ssaków poprzez elektroporację edytora RNA

Poznaj metodę CIRCLE-seq do identyfikacji miejsc cięcia poza celem w edycji genów CRISPR-Cas9. Technika ta zwiększa bezpieczeństwo terapii genowych poprzez precyzyjne mapowanie niezamierzonych efektów w genomie.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Przeglądaj więcej filmów