CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem
1 listopada 2024
Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.
Nasz zespół zajmuje się opracowywaniem terapii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, iPSC, dla ciężkich, obecnie nieuleczalnych chorób skóry, takich jak recesywne dystroficzne pęcherzowe oddzielanie się naskórka. Naszym celem jest ustalenie, czy precyzyjna edycja genów w połączeniu z różnicowaniem iPSC w komórki skóry może stanowić realną opcję leczenia tych schorzeń. Edycja genów w komórkach somatycznych i iPSC przy użyciu technologii CRISPR-Cas9 przekształca medycynę regeneracyjną, umożliwiając spersonalizowane terapie różnych chorób, w tym genetycznych chorób skóry.
Obecne wyzwania w inżynierii genetycznej obejmują niezamierzone efekty edytorów genów. Terapia wymaga edytorów genów, które precyzyjnie korygują interesujący nas gen bez zmiany jakichkolwiek innych lokalizacji w genomie. Naszym wyzwaniem jest wykazanie, że edytorzy genów nie wprowadzają niezamierzonych zmian poza genem docelowym.
Protokół CIRCLE-seq umożliwia identyfikację potencjalnych miejsc niedocelowych, które mogą zostać pominięte w innych podobnych technikach. Kompleksowa analiza tych niedocelowych miejsc dostarcza cennych informacji na temat aktywności edytorów genomu, zwiększając bezpieczeństwo terapii genowych, w tym naszej terapii chorób skóry opartej na IPSC. Po wyhodowaniu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przez pięć dni, zbierz komórki przez odwirowanie i zawieś je ponownie w 10 mililitrach PBS.
Wymieszaj sześć mikrolitrów zawiesiny komórkowej z sześcioma mikrolitrami błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Po zliczeniu podwielokrotność dwa razy 10 do potęgi siedmiu komórek na probówkę. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty w temperaturze 25 stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.
Przygotować skoncentrowany ultrasonograf, naprowadzając ramię sterujące. Napełnij zbiornik oczyszczoną, dejonizowaną wodą. Na laptopie stacji sterującej uzyskaj dostęp do wodociągów i kliknij napełnij, aby rozpocząć napełnianie systemu.
Dostosuj temperaturę do 4,5 stopnia Celsjusza. Przenieś 25 mikrogramów genomowego DNA wyizolowanego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do mikroprobówki. Napełnij probówkę do całkowitej objętości 130 mikrolitrów buforem TE.
Ustaw warunki do ścinania DNA do średniej długości 300 par zasad, czasu trwania 10 sekund, mocy szczytowej 70, procentu współczynnika wypełnienia do 20 i pękania cykli do 50. Podziel ścięte genomowe DNA na dwie porcje po 65 mikrolitrów każda. Oczyść próbki, używając 1,8-krotności objętości kulek XP, a następnie oddziel je za pomocą stojaka magnetycznego.
Przenieść supernatant na nową płytkę PCR i zmierzyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru. Na koniec uruchom jeden mikrolitr wspomnianego genomowego DNA ścinającego na stacji taśmowej. Na początek ponownie zawiesić oSQT1288 i adapter spinki do włosów do końcowego stężenia 100 mikromolów w buforze TE.
Do wyżarzania adapterowego wymieszaj 40 mikrolitrów oSQT1288, 10 mikrolitrów 10X STE i 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać całkowitą objętość 100 mikrolitrów. Po wyżarzaniu adaptera wymieszaj 10 mikrolitrów buforu do ligacji 5X, pięć mikrolitrów ligazy DNA i pięć mikrolitrów wyżarzonego adaptera spinki do włosów, Pipetę 20 mikrolitrów mieszanki głównej ligacji adaptera z każdą eluowaną próbką DNA zawierającą kulki. Umieść próbki w termocyklerze w temperaturze 20 stopni Celsjusza na godzinę, a następnie trzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez nieokreśloną czas.
Następnie przenieś 50 mikrolitrów roztworu do rozpylania PEG/NaCl do DNA podwiązanego adapterem. Oczyść próbki za pomocą kulek XP i separacji magnetycznej. Eluować próbki za pomocą 30 mikrolitrów buforu TE o pH ósmym i zdekantować supernatanty na nową płytkę PCR z półspódniczką.
Połączyć próbki i określić ilościowo DNA za pomocą testu dsDNA BR. Aby przygotować główną mieszankę cyrkularyzacyjną, połącz osiem mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, 10 mikrolitrów buforu ligazy DNA 10X TD4 i dwa mikrolitry ligazy DNA T4, aby uzyskać łączną objętość 20 mikrolitrów. Odpipetować 20 mikrolitrów głównej mieszanki cyrkularyzacyjnej do 80 mikrolitrów 500 nanogramów DNA poddanych działaniu PNK użytkownika.
Próbkę inkubować w termocyklerze w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów kulek XP do okrągłego DNA i oczyść próbki, jak pokazano wcześniej. Eluować próbkę za pomocą 38 mikrolitrów buforu TE i zdekantować supernatant na nową płytkę PCR z półspódniczką.
Aby rozszczepić oczyszczone, okrężne genomowe DNA, należy przygotować główną mieszankę rozszczepienia in vitro, łącząc pięć mikrolitrów buforu 10X Cas9, 4,5 mikrolitra Streptococcus pyogenes Cas9 i 1,5 mikrolitra genomowego RNA, co daje łączną objętość 11 mikrolitrów. Inkubować główną mieszankę łupliwości w temperaturze pokojowej przez 10 minut. do tworzenia kompleksów Cas9 gRNA RNP.
Rozcieńczyć 125 nanogramów bezpiecznego dla plazmidu genomowego DNA poddanego działaniu DNazy do końcowej objętości 39 mikrolitrów w wodzie wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 11 mikrolitrów głównej mieszanki rozszczepienia do 39 mikrolitrów DNA, aby uzyskać całkowitą objętość 50 mikrolitrów. Inkubuj mieszaninę w termocyklerze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i utrzymuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez czas nieokreślony.
Po inkubacji dodaj 50 mikrolitrów kulek XP do rozszczepionego DNA in vitro i oczyść DNA na stojaku magnetycznym. Eluować oczyszczone DNA w 42 mikrolitrach buforu TE. Aby przeprowadzić analizę danych sekwencjonowania nowej generacji, zainstaluj język Python w wersji 2.7, Burrows-Wheeler Aligner i SAMtools.
Pobierz genom referencyjny z podanej strony internetowej. Zdefiniuj plik FASTA genomu referencyjnego, katalog wyjściowy do analizy oraz ścieżki do poleceń BWA i SAMtools. Określ sekwencje docelowe i ścieżki do zdemultipleksowanych plików FASTQ zarówno dla próbek rozszczepionych nukleazą, jak i próbek kontrolnych.
Wykonaj standardową analizę opartą na odwołaniach za pomocą następującego polecenia. Podczas wykonywania pełnego potoku znajdź wyniki wyjściowe każdego kroku w odrębnym folderze wyjściowym wyznaczonym dla tego konkretnego kroku.
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono technikę CIRCLE-seq, która służy do identyfikacji miejsc niespecyficznego cięcia (off-target) w edycji genów za pomocą systemu CRISPR-Cas9. Metoda ta zwiększa bezpieczeństwo terapii genowych poprzez mapowanie niezamierzonych zdarzeń cięcia z wysoką czułością.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Edycja genów
- Technologia CRISPR-Cas9
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) są badane pod kątem leczenia ciężkich chorób skóry.
- Efekty poza docelowe (off-target) w edycji genów stanowią istotne wyzwanie.
- Metoda CIRCLE-seq umożliwia identyfikację potencjalnych miejsc efektów poza docelowych.
- Zrozumienie efektów poza docelowych jest kluczowe dla bezpieczeństwa terapii genowych.
Cel badania
- Opracowanie terapii opartych na iPSC w leczeniu genetycznych schorzeń skóry.
- Zapewnienie precyzyjnej edycji genów bez niezamierzonych zmian w genomie.
- Zwiększenie bezpieczeństwa terapii opartych na systemie CRISPR.
Stosowane metody
- Izolacja i przygotowanie genomowego DNA z iPSC.
- Zastosowanie protokołu CIRCLE-seq w celu identyfikacji miejsc off-target.
- Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) dla kompleksowej analizy.
- Analiza danych przy użyciu narzędzi bioinformatycznych, takich jak Python i SAMtools.
Główne wyniki
- Metoda CIRCLE-seq skutecznie identyfikuje zdarzenia cięcia poza celem.
- Kompleksowa analiza dostarcza istotnych informacji na temat bezpieczeństwa edycji genomu.
- Wykazuje potencjał terapii opartych na iPSC w leczeniu chorób skóry.
- Podkreśla znaczenie precyzyjnej edycji genów w medycynie regeneracyjnej.
Wnioski
- CIRCLE-seq jest wartościowym narzędziem zwiększającym bezpieczeństwo technologii CRISPR.
- Zrozumienie efektów off-target jest niezbędne dla opracowania skutecznych terapii genowych.
- Badanie to wspiera rozwój medycyny personalizowanej poprzez zastosowania iPSC.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda CIRCLE-seq umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego rygorystyczną analizę efektów off-target edycji genów CRISPR-Cas9, co stanowi krytyczny punkt zwrotny w rozwoju terapii genowych. Zapewniając wysoką czułość w detekcji niezamierzonych miejsc cięcia w obrębie całego genomu, CIRCLE-seq wspiera pewność predykcyjną oraz mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesach wczesnego odkrywania i badaniach translacyjnych. Zdolność ta jest niezbędna dla podejmowania decyzji dotyczących portfela projektów w medycynie regeneracyjnej oraz rozwoju terapii komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia kompleksowe mapowanie aktywności poza docelowej CRISPR-Cas9 w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez identyfikację niezamierzonych zmian genomowych przed etapem badań przedklinicznych.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych prognoz dotyczących specyficzności edycji genów, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu projektu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane substraty genomowego DNA do późniejszego opracowywania testów i przepływów przesiewowych.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne odczyty zdarzeń cięcia w celu standaryzacji testów.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę specyficzności gRNA dla wielu celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia profilowanie efektów poza docelowych (off-target) z modelami iPSC istotnymi dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój terapii komórkowych z edycją genów poprzez potwierdzenie integralności genomu.
- Usprawnia dopasowanie biomarkerów poprzez powiązanie profili cięcia z wynikami funkcjonalnymi w modelach przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda CIRCLE-seq znajduje zastosowanie na etapie wstępnych odkryć, identyfikacji wiodących kandydatów oraz walidacji przedklinicznej, co umożliwia jej płynną integrację z procesami edycji genów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez ujawnianie efektów poza docelowych CRISPR-Cas9.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny specyficzności gRNA i Cas9.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze dane o miejscach cięcia w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego warunków edycji.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie wierności edycji w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, skalowalny przepływ pracy dla ciągłej oceny bezpieczeństwa edycji genów w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w projektach edycji genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną i skalowalną analizę efektów off-target w celu wdrożenia przez różne zespoły.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio dzięki ograniczaniu ryzyka związanego ze swoistością edycji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów do terapii genowych i komórkowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu genomowego DNA, sekwencjonowaniu nowej generacji oraz analizie bioinformatycznej.
- Wymaga dostępu do ukierunkowanej sonikacji, platform sekwencjonowania Illumina oraz infrastruktury obliczeniowej.
- Konieczna jest standaryzacja procedur przygotowania próbek i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych typów komórek i celów edycji genów poprzez optymalizację protokołu.
- Niezawodna detekcja efektów off-target zależy od jakości sekwencjonowania i dokładności genomu referencyjnego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:23
Cell Culture and DNA Shearing Protocol for Genomic DNA Preparation from Induced Pluripotent Stem Cells
3:28
CIRCLE-Seq Library Preparation for Genomic DNA Circularization and Purification
5:58
In Vitro Cleavage of Circularized Genomic DNA and CIRCLE-Seq Data Analysis
