Name: Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę kokultury pierwotnych mikrogleju i neuronów mysich do badania interakcji komórkowych w układzie nerwowym. Model ten umożliwia obserwację ochronnych mechanizmów mikrogleju w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JP dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii oraz University of Saskatchewan College of Medicine. YD dziękuje za wsparcie finansowe ze strony University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant (1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant (6368) oraz Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant. Rysunki 1A, Rysunki 2A i Rysunki 3A zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu były trzymane i traktowane za zgodą Uniwersyteckiego Komitetu Opieki nad Zwierzętami (UACC) Uniwersytetu Saskatchewan i Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). W tym badaniu wykorzystano w tym badaniu samce i samice myszy CD1 w dniach pourodzeniowych 0-2 oraz zarodki embrionalne 16-18 dni (E16-18) od ciężarnych myszy CD1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Pierwotna hodowla mikrogleju
UWAGA: Kluczowe jest, aby mieszany glej i hodowle neuronów były tak dobrane, aby mikroglej był dojrzały i gotowy do zbioru w ciągu 2 dni po umieszczeniu neuronów na 96-dołkowej płytce.
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzej kompletną pożywkę do hodowli gleju, która zawiera zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny z 2,92 mg/ml L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 1x aminokwasy endogenne i 20 mM HEPES w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać 5 ml bromowodorku poli-L-ornityny (PO) o stężeniu 10 μg/ml do każdej kolby T-75. Delikatnie obracać kolbą, aby upewnić się, że PO całkowicie zakrywa dno kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 przez co najmniej 1 h. 
		UWAGA: Ten etap powlekania jest wymagany, aby ułatwić przyleganie komórek do kolb T-75.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mózgów od nowonarodzonych myszy P0-P2 
	UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania i utrzymuj sterylność odczynników. Upewnij się, że przez cały czas przestrzegasz technik aseptycznych.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem sekcji spryskaj blat 70% etanolem lub sprayem dezynfekującym w miejscu, w którym będzie miała miejsce sekcja. Ustaw mikroskop preparacyjny i umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Wlej 20 ml pożywki L-15 Leibovitz na szalkę Petriego. Pokrywę szalki Petriego należy założyć, gdy mikroskop nie jest używany, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.</li>
		<li>Połóż kilka warstw ręcznika papierowego i dokładnie spryskaj ręczniki papierowe 70% etanolem. Przygotuj narzędzia do preparowania (nożyczki do preparowania, parę mikrokleszczy i kleszczyki do tkanek), dokładnie spryskując je 70% etanolem i kładąc narzędzia na ręcznikach papierowych.</li>
		<li>Przenieś mysz 0-2 dni po porodzie na ręczniki papierowe i dokładnie spryskaj mysz 70% etanolem. Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
		<li>Delikatnie trzymając głowę, wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki, zaczynając od szyi do nosa. Oderwij czaszkę za pomocą kleszczy tkankowych, aby odsłonić mózg.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy tkankowych delikatnie zgarnij mózg, wkładając kleszcze pod mózg i podnieś mózg z głowy. Natychmiast umieść mózg na szalce Petriego zawierającej 20 ml pożywki L-15 Leibovitza.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń pień mózgu i opony mózgowe za pomocą pary mikrokleszczy. Zbierz mózgi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja mózgu, wysiew i utrzymanie mieszanej kultury gleju 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Zmiel mózgi na około 1 mm2 kawałki za pomocą sterylnego jednorazowego ostrza skalpela. Ostrożnie przenieś zmielone mózgi do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Do zmielonych mózgów dodać końcowe stężenie 0,25% trypsyny i inkubować tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut. Co 2-3 minuty mieszaj roztwór, delikatnie odwracając rurkę, aby wspomóc dysocjację tkanek.</li>
		<li>Z inkubatora o stężeniu 5% CO2 przenieść kolby T-75 zawierające 5 ml PO do komory bezpieczeństwa biologicznego. Wyrzucić PO i przepłukać kolby 3 razy sterylnym 1x roztworem buforu fosforanowego (PBS). Upewnij się, że kolby zostały dokładnie wypłukane, ponieważ nadmiar PO jest toksyczny dla komórek.</li>
		<li>Przetrawioną tkankę przenieść z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do komory bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki do hodowli gleju, aby zneutralizować trypsynę. Delikatnie wymieszać zawiesinę tkankową za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Umieść sterylne sitko z nylonową siatką o grubości 70 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż siatkę, wlewając około 5 ml L-15. Ostrożnie zdekantować zawiesinę komórek przez sitko do komórek. Wyjąć tłok ze sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml, zmielić tkankę na siatkę za pomocą tłoka, aby pozbyć się grudek tkanek i wytworzyć homogenizowaną zawiesinę komórkową.</li>
		<li>Okresowo wlewaj około 5 ml podłoża L-15 firmy Leibovitz do siatki nylonowej o grubości 70 μm i kontynuuj mielenie tkanki na siatce za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Gdy na siatce pozostaje niewiele widocznej tkanki lub nie ma jej wcale, wyrzuć siatkę i odłóż zawiesinę komórek na bok.</li>
		<li>Wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując w górę i w dół. Do każdej kolby dodać równe objętości zawiesiny komórkowej zawierającej 1-2 mózgi z pożywką do hodowli gleju do końcowej objętości 15 ml.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc. Następnego dnia umyj kolby dwukrotnie sterylnym 1x PBS, aby usunąć nieprzyłączone komórki i zanieczyszczenia.</li>
		<li>Dodać do kultury 15 ml świeżej, kompletnej pożywki do hodowli gleju i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Po 3 dniach zmień połowę pożywki na 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 40 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF). 
		UWAGA: Następnie połowę pożywki zastępuje się 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 40 ng/ml MCSF co 3 dni. Kultura jest utrzymywana przez 8-10 dni przed zbiorem mikrogleju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pierwotna hodowla neuronów
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Rozmrozić B-27 plus suplement z B-27 plus system hodowli neuronów. Wstępnie ogrzane podłoże neurobaseal plus z systemu hodowli neuronów B-27 plus, 1x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) i inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Pokryć kolby T-25 5 ml 10 μg/ml PO i inkubować kolby przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przygotować narzędzia i materiały do sekcji. 
		UWAGA: Ten etap powlekania ułatwia przyleganie komórek do kolb T-25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mózgu z zarodków myszy E16-E18 
	UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparowania i utrzymuj sterylność odczynników. Upewnij się, że przez cały czas przestrzegasz technik aseptycznych.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem sekcji spryskaj blat 70% etanolem lub sprayem dezynfekującym w miejscu, w którym będzie miała miejsce sekcja. Ustaw mikroskop preparacyjny i umieść szalkę Petriego pod mikroskopem. Wlej 20 ml 1x HBSS na szalkę Petriego. Pokrywę szalki Petriego należy założyć, gdy mikroskop nie jest używany, aby zmniejszyć zanieczyszczenie.</li>
		<li>Połóż kilka warstw ręcznika papierowego i dokładnie spryskaj ręczniki papierowe 70% etanolem. Przygotuj narzędzia do preparowania (nożyczki sprężynowe, parę mikrokleszczy i kleszczyki do tkanek), dokładnie spryskując je 70% etanolem i kładąc narzędzia na ręcznikach papierowych.</li>
		<li>Znieczulić ciężarną mysz między 16 a 18 dniem ciąży za pomocą izofluranu i poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
		<li>Połóż mysz na plecach na kawałku ręcznika papierowego nasączonego 70% etanolem. Zdezynfekuj okolice brzucha 70% etanolem. Podnieś skórę dolnej części brzucha za pomocą kleszczy tkankowych i wykonaj nacięcie w kształcie litery V od tego miejsca do dolnej klatki piersiowej za pomocą nożyczek preparacyjnych.</li>
		<li>Chwyć rogi macicy zawierające zarodki za pomocą kleszczyków tkankowych i delikatnie usuń zarodki z jamy brzusznej. Krótko zdezynfekuj rogi macicy zawierające zarodki 70% etanolem.</li>
		<li>Wypreparuj jeden zarodek z jego pojedynczego woreczka na raz. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w linii środkowej na szczycie czaszki, zaczynając od tyłu szyi do nosa. Następnie unieś czaszkę z dala od miejsca nacięcia, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij mózg kleszczami tkankowymi i przenieś mózg na 10 cm szalkę Petriego zawierającą 15 ml 1x HBSS.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń pień mózgu i opony mózgowe po obu stronach kory mózgowej za pomocą pary mikrokleszczy. Przenieś korę mózgową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml 1x HBSS i umieść na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja mózgu i wysiewanie neuronów korowych w hodowli komórkowej 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Zmiel mózgi na około 1 mm2 kawałki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml ze sterylnym jednorazowym ostrzem skalpela. Przenieś zmielone mózgi do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dodaj trypsynę do probówki o końcowym stężeniu 0,25%. Zanurz probówkę w gorącej łaźni wodnej o temperaturze 35-38 °C na 15 minut i delikatnie mieszaj probówkę w celu homogenizacji tkanki co 2-3 minuty.</li>
		<li>Wyjmij rurkę z gorącej kąpieli wodnej. Delikatnie pipetuj zawiesinę tkankową w górę iw dół, aby jeszcze bardziej dysocjować komórki, a następnie dodaj 0,5 ml inaktywowanego termicznie FBS do homogenizowanej zawiesiny, aby zneutralizować aktywność trypsyny. Unikaj pęcherzyków powietrza, aby zminimalizować toksyczność dla komórek neuronalnych.</li>
		<li>Umieść sterylne sitko do komórek z nylonowej siatki o wielkości 70 μm na sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilż siatkę, dodając około 5 ml pożywki neuropodstawnej. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z siatki nylonowej o średnicy 70 μm. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml delikatnie zmielić tkankę na sitko do komórek. Okresowo wlewaj około 5 ml 1x HBSS, kontynuując mielenie, aby umyć sitko do komórek.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie rozcieńczyć suplement B-27 plus w pożywce neurobasel plus do 1x końcowego stężenia, aby użyć jako kompletnej pożywki neurobazalnej.</li>
		<li>Wyrzucić PO do kolb T-25 i przepłukać kolby trzykrotnie 5 ml 1x PBS.</li>
		<li>Ostrożnie zdekantować w celu usunięcia supernatantu i ponownego zawieszenia osadu komórkowego, delikatnie pipetując w górę iw dół 2-3 ml kompletnego podłoża neuropodstawnego. Określ stężenie komórek i całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Spodziewaj się do 1,0 x 107 komórek na zarodek.</li>
		<li>Umieścić komórki w kolbach T-25 pokrytych PO około 2,0 x 107 komórek na kolbę w 5 ml kompletnego podłoża neuropodstawowego. Inkubować hodowlę komórkową w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
		<li>Wykonuj połówkową wymianę pożywki co 2-3 dni, zastępując 2,5 ml pożywki z kolby hodowlanej świeżo przygotowanym kompletnym podłożem nerwowo-podstawnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Współkultura pierwotnych neuronów i mikrogleju
UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Wysiewanie neuronów w 96-dołkowych płytkach
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl 10 μg/ml PO do studzienki i inkubować kolby przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu pokrycia studzienek PO. Umyj płytkę 1x PBS 3 razy przed wysiewem komórek i odessaj pozostały płyn po ostatnim myciu.</li>
		<li>Neurony wyhodowane w kolbach T-25 są zbierane do wspólnej hodowli po 2-5 dniach w hodowli. Zastąp pożywkę 5 ml 1x roztworu Versene z 0,25% trypsyną i 1 mg/ml DNazy I, aby odłączyć neurony od kolby. Umieść kolby w inkubatorze na 5-6 minut w celu roztrawienia i delikatnie obracaj kolbę co 2-3 minuty, aby ułatwić oddzielenie komórek.</li>
		<li>Wyjąć kolbę z inkubatora i sprawdzić, czy komórki są oderwane pod mikroskopem. Dodaj 0,5 ml inaktywowanego termicznie FBS, aby zneutralizować trypsynę i DNazę I. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przemyj kolbę 5 ml kompletnego podłoża neurobazalnego raz, aby zmaksymalizować zebrane neurony. Zbierz wszystkie komórki w tej samej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2-3 ml kompletnego podłoża nerwowo-podstawowego.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i dodaj kompletne podłoże neuropodstawne, aby osiągnąć końcowe stężenie 7,5 x 105 neuronów / ml. Zasiać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka w 96-dołkowej płytce pokrytej PO, aby uzyskać 7,5 x 104 neuronów / dołek. Oczekuje się, że wydajność wyniesie 5-6 milionów neuronów na kolbę.</li>
		<li>Inkubuj neurony na 96-dołkowej płytce przez noc. Następnego dnia dodać 100 μl kompletnych pożywek neurobazalnych do każdego dołka. 
		UWAGA: Gdy neurony wykazują odpowiedni wzrost procesu neurytowego (około 3-4 dnia po wysianiu na 96-dołkowych płytkach), są gotowe do kohodowli z mikroglejem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i kokultura mikrogleju i neuronów
	<ol>
		<li>Między 8-10 dniami mieszanej hodowli gleju należy zebrać mikroglej, delikatnie myjąc kolby T-75 pożywką do hodowli gleju w każdej kolbie za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść komórki i pożywkę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ponownie umyć kolby 10 ml świeżej pożywki do hodowli gleju w celu odłączenia dodatkowego mikrogleju od kolb i zebrania pożywki. Oczekuje się wydajności 7,5 x 105 mikrogleju z kolby.</li>
		<li>Do każdej kolby dodać 20 ml świeżej pożywki do hodowli gleju uzupełnionej 20 ng/ml MCSF. Mikroglej można zbierać jeszcze raz lub dwa razy, jeśli zachowana jest mieszana kultura gleju.</li>
		<li>Odwirować zbiór komórek przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 2 ml kompletnego podłoża nerwowo-podstawowego.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Dodać kompletne podłoże neurobazalne do końcowego stężenia 2,5 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Z 96-dołkowej płytki hodowli neuronalnej usuń 100 μl pożywki neuropodstawowej i dodaj 100 μl zawiesiny komórek 2,5 x 105 komórek/ml do wysiewu 2,5 x 104 mikrogleju na dołek 7,5 x 104 neuronów. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić osiedlenie się mikrogleju. Kokultura może być teraz wykorzystywana do dalszych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

 Primary Microglia and Neuron Co-Culture Protocol for CNS Interaction Studies

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W artykule opisano protokół izolacji i hodowli pierwotnych neuronów myszy i pierwotnego mikrogleju, które są następnie wykorzystywane do ustanowienia kokultury mikrogleju i neuronów, którą można wykorzystać do badania, w jaki sposób interakcje mikrogleju i neuronów regulują ich zdrowie i funkcję komórkową. To stosunkowo proste i przystępne podejście może dostarczyć krytycznych informacji na temat mechanizmów i funkcjonalnych wyników interakcji neuronów mikrogleju w OUN.
Aby osiągnąć optymalną kokulturę, kilka krytycznych aspektów tego protokołu wymaga dodatkowej ostrożności. Podczas izolacji mózgu (etapy 1.2.6 i 2.2.7) opony mózgowe przyczepione do powierzchni zarówno mózgu embrionalnego, jak i pourodzeniowego powinny zostać całkowicie usunięte przed pobraniem tkanek. Podobnie jak w przypadku innych protokołów neurogleju, niecałkowite usunięcie opon mózgowych może spowodować zanieczyszczenie hodowli komórkowej komórkami śródbłonka lub komórkami pochodzącymi z krwi 40,41,42. Dodatkowo, podczas hodowli neuronów pierwotnych (kroki 2.3.7 i 3.1.4), ważne jest, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową i uniknąć grudek komórek przed wysiewem neuronów do kolb lub 96-dołkowych płytek. Agregaty neuronalne nie będą prawidłowo przylegać do kultury i doprowadzą do nadmiernego stresu neuronalnego i śmierci komórki. Ponadto, przedłużone leczenie neuronów trypsyną podczas próby oddzielenia ich od kolb T-25 może spowodować niepożądaną śmierć komórki (krok 3.1.2). Aby temu zapobiec, neurony mogą być bezpośrednio umieszczane na 96-dołkowych płytkach o pożądanej gęstości komórek po dysocjacji od embrionalnych mózgów (krok 2.3.7). Co więcej, w tym protokole wybrano stosunek neuronów do mikrogleju 3:1, aby częściowo reprezentować podwyższoną ilość mikrogleju, który może być obecny w mikrośrodowisku OUN podczas zapalenia nerwów. Alternatywnie, stosunek komórek w kokulturze można dostosować do potrzeb eksperymentalnych. Ponadto punkt czasowy wybrany dla neuronów współkulturowych może zostać wydłużony, jeśli dąży się do oceny bardziej dojrzałych stanów neuronalnych.
Warto zauważyć, że podczas dysocjacji neuronów z kolb T-25 na płytki 96-dołkowe, użycie samej trypsyny może spowodować niepełną dysocjację i tworzenie się grudek komórek zamiast hodowli jednowarstwowej na płytkach 96-dołkowych (ryc. 2D). Aby rozwiązać ten problem, neurony można oddzielić od kolby T-25 za pomocą 1x roztworu Versene zawierającego 1 mg / ml DNazy I. Inne czynniki przyczyniające się do agregacji neuronów i zmniejszonej żywotności obejmują niepełne roztarcie zawiesiny komórkowej, niewystarczającą neutralizację trypsyny za pomocą inaktywowanego termicznie FBS, nadmierne wirowanie lub przedłużone tworzenie osadów komórkowych. Dlatego zapewnienie prawidłowej dysocjacji tkanek i wytworzenie zawiesiny pojedynczej komórki ma kluczowe znaczenie dla ustanowienia zdrowej kokultury mikrogleju i neuronów.
Protokół ten ma na celu podsumowanie interakcji mikrogleju i neuronów in vitro, aby lepiej zrozumieć funkcjonalne znaczenie ich interakcji w OUN. Podczas gdy opracowano inne rodzaje systemów kohodowli, takie jak hodowla pojedynczych populacji komórek na różnych powierzchniach, aby umożliwić niezależną obróbkę dwóch populacji komórek43,44, ten mieszany system hodowli umożliwia bezpośredni i bliski kontakt mikrogleju i neuronów. Ponadto, przy prawidłowym utrzymywaniu poprzez połówkową wymianę pożywki co 3 dni, ten mieszany system hodowli może pozostać zdrowy od 12 dni (ryc. 3F) do potencjalnie 3 tygodni, co pozwala na długoterminowe badania interakcji neuronalno-mikroglejowych45.
Chociaż względna prostota systemu kohodowli jest korzystna dla dostępności, kluczowym ograniczeniem tego podejścia jest to, że dwuwymiarowa hodowla komórkowa nie reprezentuje w pełni środowiska tkankowego OUN. Rzeczywiście, wykazano, że trójkultura mikrogleju, neuronów i astrocytów naśladuje odpowiedź neurozapalną in vivo bardziej niezawodnie niż mikroglej lub kokultura astrocytów i neuronów46,47. Co więcej, najnowsze osiągnięcia w układach organoidów mózgowych z mikroglejem i innymi komórkami glejowymi, w tym astrocytami i oligodendrocytami, są bardziej odpowiednie do badania trójwymiarowej (3D) architektury tkanek i interakcji OUN48. Podobnie, wykazano, że ludzki system trikultury 3D składający się z neuronów, mikrogleju i astrocytów jest skuteczny w modelowaniu stanu choroby Alzheimera49. Inne kokultury ludzkiego mikrogleju i neuronów mogą być bardziej fizjologicznie istotne dla badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Na przykład wspólna hodowla mikrogleju i neuronów ruchowych pochodzących z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych50 może być przydatna do badania chorób, takich jak stwardnienie zanikowe boczne51. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę względną obfitość i niski koszt generowania pierwotnych neuronów i mikrogleju od myszy, ocena kokultury mikrogleju i neuronów na 96-dołkowych płytkach może być podejściem o wysokiej przepustowości do badania mechanizmów i funkcjonalnych implikacji interakcji mikrogleju z neuronami. Dalsze testy mogą obejmować obrazowanie żywych komórek w celu określenia zmian funkcjonalnych komórki w czasie rzeczywistym, sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian transkrypcji komórkowej, mikroskopię immunofluorescencyjną w celu określenia komórkowych zmian fenotypowych, spektrometrię mas w celu określenia zmian komórkowych i proteomicznych lub test immunoenzymatyczny i western blot do pomiaru białka wydzielanego do supernatantu z kokulturą.
Ponieważ mikroglej jest ważnym mediatorem zdrowia i chorób OUN, ta kokultura może być również wykorzystana do zbadania wpływu cząsteczek i związków związanych z chorobą na dwukierunkową komunikację mikrogleju i neuronów. W kontekście stwardnienia rozsianego aktywowany mikroglej może odgrywać destrukcyjną rolę, przyczyniając się do pogorszenia patologii52,53. Na przykład mogą wydzielać cytokiny prozapalne i reaktywne formy tlenu, a także promować aktywację astrocytów45. Protokół ten może pomóc w dalszym badaniu szkodliwej roli mikrogleju poprzez leczenie mikrogleju w kokulturze z cytokinami zapalnymi, które są podwyższone w stwardnieniu rozsianym i ocenę wyników zdrowia neuronów. Alternatywnie, ta kokultura mikrogleju i neuronów została wykorzystana do wykazania ochronnego wpływu mikrogleju na neurony w odpowiedzi na utlenioną fosfatydylocholinę, produkt utleniający odkryty w MS54. Co więcej, apoptoza neuronalna przebudowuje ekspresję genu mikrogleju podczas rozwoju, promując przeżycie mikrogleju i fagocytozę55. Dlatego protokół ten może również pomóc w określeniu wpływu śmierci neuronów na fenotyp i funkcję mikrogleju.
Podsumowując, protokół ten opisuje wytwarzanie i wspólną hodowlę pierwotnych neuronów pochodzących od myszy i mikrogleju in vitro. Kokultura mikrogleju i neuronów umieszczona na 96-dołkowych płytkach może być wysokoprzepustowym podejściem do badania mechanizmów i funkcji interakcji mikrogleju z neuronami w kontekście zdrowia i choroby OUN, w tym stwardnienia rozsianego.

Mikroglej to makrofagi rezydujące w tkankach, które ułatwiają nadzór immunologiczny i homeostazę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1,2,3. Pochodzą one z erytromieloidalnych komórek progenitorowych woreczka żółtkowego, które kolonizują mózg podczas rozwoju embrionalnego4,5,6 i są utrzymywane przez cały okres życia organizmu poprzez samoodnowę, która obejmuje proliferację i apoptozę7. W stanie stacjonarnym spoczynkowe mikroglej ma rozgałęzioną morfologię i angażuje się w nadzór nad tkankami8,9,10.
Mikroglej wykazuje ekspresję licznych receptorów na powierzchni komórek, co umożliwia im szybkie reagowanie na zmiany w OUN 11,12 oraz promowanie reakcji zapalnych w przypadku infekcji lub uszkodzenia tkanek12,13,14, a także podczas chorób neurodegeneracyjnych9,15, takie jak stwardnienie rozsiane (SM)16,17. Mikroglej wyraża również receptory dla różnych neuroprzekaźników i neuropeptydów18,19,20, co sugeruje, że mogą również reagować i regulować aktywność neuronalną21,22. Rzeczywiście, mikroglej i neurony oddziałują na siebie w różnych formach komunikacji dwukierunkowej8,23, takich jak bezpośrednie interakcje, w których pośredniczą białka błonowe lub pośrednie interakcje za pośrednictwem czynników rozpuszczalnych lub komórek pośrednich23,24.
Na przykład, różne neuroprzekaźniki wydzielane przez neurony mogą modulować neuroprotekcyjne lub zapalne działanie mikrogleju25,26,27. Dodatkowo, bezpośrednie interakcje między neuronami a mikroglejem pomagają utrzymać mikroglej w stanie homeostatycznym28. I odwrotnie, bezpośrednie interakcje mikrogleju z neuronami mogą kształtować obwody neuronalne29 i wpływać na sygnalizację neuronalną30,31,32. Ponieważ zakłócenia tych interakcji wywołują nadpobudliwość neuronów30 i reaktywność mikrogleju33,34, rozregulowane interakcje mikrogleju i neuronów są uważane za czynnik przyczyniający się do chorób neurologicznych33,35. Rzeczywiście, psychotyczne23,26 i choroby neurodegeneracyjne zostały opisane jako wykazujące dysfunkcyjne interakcje mikrogleju i neuronów33. Chociaż obserwacje te podkreślają znaczenie komunikacji mikroglej-neuronalnej w OUN, konkretne mechanizmy regulujące te interakcje regulujące funkcje mikrogleju i neuronów w zdrowiu i chorobie są stosunkowo nieznane.
W tak złożonym środowisku, jak OUN, wiele czynników środowiskowych może wpływać na interakcje mikrogleju z neuronami, co ogranicza możliwość badania przejściowych interakcji komórkowych in vivo. W tym miejscu przedstawiamy system kohodowli mikrogleju i neuronów in vitro, który można wykorzystać do badania bezpośrednich interakcji komórkowych między mikroglejem a neuronami. Protokół ten opisuje wytwarzanie pierwotnego mikrogleju i neuronów z kory nowonarodzonych myszy odpowiednio między dniami po urodzeniu 0-2 i embrionalnymi myszami 16-18. Neurony i mikroglej są następnie hodowane wspólnie na 96-dołkowych płytkach w celu przeprowadzenia eksperymentów o wysokiej przepustowości. Wcześniej zastosowaliśmy to podejście, aby wykazać, że fagocytoza mikrogleju chroni neurony przed utlenioną śmiercią komórkową za pośrednictwem fosfatydylocholiny37, co sugeruje, że ta metoda może pomóc w zrozumieniu roli mikrogleju w kontekście neurodegeneracji i stwardnienia rozsianego. Podobnie, kokultury mikrogleju i neuronów mogą być również przydatne do badania wpływu przesłuchów mikrogleju i neuronów w innych kontekstach, takich jak infekcje wirusowe38 lub uszkodzenie i naprawa neuronów39. Ogólnie rzecz biorąc, systemy kohodowli mikrogleju i neuronów in vitro umożliwiają naukowcom badanie interakcji mikrogleju i neuronów w kontrolowanym i manipulowanym środowisku, co uzupełnia modele in vivo.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego 10 cm&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>07-202-011</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>1x Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus System do hodowli neuronów&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A3653401</tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca&nbsp;</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 Średni (1x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21083027</tr><tr><td>Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mikrokleszowe</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td>Autoklawowane/sterylne</td></tr><tr><td>aminokwasy endogenne</td><td>Cytiva</td><td>SH3023801</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>103780-16</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>RWD</td><td>S11008-42</td><td>Autoklawowane/sterylne</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>Feather</td><td>08-916-5D</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>kolby T-25</td><td>Kolby Fisher</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>T-75&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek</td><td>Codman</td><td>30-4218</td><td>Autoklawowane/sterylne</td></tr><tr><td>nożyczki do tkanek</td><td>RWD</td><td>S12052-10</td><td>Autoklawowane/sterylne</td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp;</td><td>Thermofisher Sci&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (2,5%)</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop immunofluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Mikroglej to rezydujące w tkankach makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN), pełniące liczne funkcje wspierające zdrowie neuronów i homeostazę OUN. Są główną populacją komórek odpornościowych związanych z aktywnością choroby OUN, przyjmując reaktywne fenotypy, które potencjalnie przyczyniają się do uszkodzenia neuronów podczas przewlekłych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM). Odrębne mechanizmy, za pomocą których mikroglej reguluje funkcje neuronów i przetrwanie podczas zdrowia i choroby, pozostają ograniczone ze względu na wyzwania związane z rozwiązaniem złożonych interakcji in vivo między mikroglejem, neuronami i innymi czynnikami środowiskowymi OUN. W związku z tym podejście in vitro polegające na jednoczesnej hodowli mikrogleju i neuronów pozostaje cennym narzędziem do badania interakcji mikrogleju z neuronami. Tutaj przedstawiamy protokół generowania i wspólnej hodowli pierwotnego mikrogleju i neuronów od myszy. W szczególności mikroglej wyizolowano po 9-10 dniach in vitro z mieszanej kultury gleju utworzonej z homogenatów mózgu pochodzących od noworodków myszy między 0-2 dniami po urodzeniu. Komórki neuronalne wyizolowano z kory mózgowej zarodków myszy między 16. a 18. dniem embrionalnym. Po 4-5 dniach in vitro komórki neuronalne wysiewano na 96-dołkowych płytkach, a następnie dodawano mikroglej w celu utworzenia kokultury. Staranny czas ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu, ponieważ oba typy komórek muszą osiągnąć dojrzałość eksperymentalną, aby ustanowić kokulturę. Ogólnie rzecz biorąc, ta kokultura może być przydatna do badania interakcji mikrogleju i neuronów i może zapewnić wiele odczytów, w tym mikroskopię immunofluorescencyjną, obrazowanie na żywo, a także testy RNA i białek.

Schemat blokowy przedstawiający kluczowe etapy hodowli mieszanej gleju w celu pozyskania mikrogleju znajduje się na Rysunku 1A. Ogólnie, w 1. dniu spodziewane jest wystąpienie nielicznych komórek oraz nadmiaru debris komórkowego (Rysunek 1B). Do 4. dnia powinna zostać zaobserwowana zwiększona liczba komórek, zwłaszcza w wyniku generowania adherentnych astrocytów, co objawia się ich wydłużoną morfologią (Rysunek 1C). Nieliczne komórki mikrogleju mogą być widoczne na powierzchni astrocytów lub jako małe, okrągłe komórki pływające w pożywce. Do 8. dnia sfałdowana warstwa astrocytów utworzy adherentne warstwy komórkowe, natomiast mikroglej będzie widoczny jako okrągłe i jasne komórki, które są częściowo przytwierdzone do astrocytów lub pływają w pożywce (Rysunek 1D). Jeśli w 8. dniu gęstość mikrogleju jest niska, hodowlę można inkubować przez dodatkowe dni przed zbiorem.
Schemat blokowy przedstawiający kluczowe etapy hodowli neuronów znajduje się na Rysunku 2A. W zdrowej hodowli neurony przytwierdzą się i utworzą wypustki neurytowe po 1-3 dniach in vitro (Rysunek 2B). Podobnie, po wysianiu neuronów na płytkę 96-dołkową, początkowo będą one okrągłe, lecz do 3. dnia neurony powinny stać się adherentne i utworzyć wypustki neurytowe łączące się z sąsiednimi neuronami (Rysunek 2C). Z kolei niezdrowe hodowle neuronów będą zawierać skupiska komórek i szczątki komórkowe, co może być wynikiem niewłaściwej dysocjacji komórek lub błędów w obsłudze neuronów (Rysunek 2D).
Schemat blokowy przedstawiający kluczowe etapy protokołu kokultury mikrogleju i neuronów znajduje się w Rycina 3APo dodaniu 2,5 x 104 mikroglej do 7,5 x 104 neurony, okrągłe i duże mikrogleje powinny znajdować się nad neuronami lub pomiędzy neuronami a wypustkami neurytowymi (Rysunek 3B). Aby dodatkowo zobrazować kokulturę mikrogleju i neuronów, mikroglej i neurony (oddzielnie lub w kokulturze) znakowano przeciwciałami przeciwko cząsteczce adaptorowej wiążącej jony wapnia 1 (IBA-1, kolor czerwony) oraz tubulinie βIII (TUJ1, kolor zielony).37 do mikroskopii immunofluorescencyjnej (Rycina 3C-F).
<img alt="Proces hodowli komórek neuronalnych; schemat etapów izolacji i inkubacji; obrazy mikroskopowe, morfologia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd pierwotnej hodowli mikrogleju. (A) Schemat kluczowych etapów tworzenia mieszanej hodowli glejowej. (B-D) Reprezentatywne obrazy z mikroskopu w polu jasnym (powiększenie 10x) mieszanej hodowli glejowej w dniu 1. (B), dniu 4. (C) i dniu 8. (D). Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat hodowli neuronów embrionalnych myszy; analiza w kolbie T-25 i płytce 96-dołkowej w dniach 1-3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przegląd pierwotnej hodowli neuronów. (A) Schemat blokowy kluczowych etapów generowania neuronów. (B) Reprezentatywne obrazy z mikroskopu w świetle przechodzącym (powiększenie 10x) przedstawiające neurony hodowane w kolbach T-25. (C) Reprezentatywny obraz z mikroskopu w świetle przechodzącym (powiększenie 10x) neuronów hodowanych na płytce 96-dołkowej. (D) Reprezentatywny obraz z mikroskopu w świetle przechodzącym (powiększenie 10x) niezdrowego skupiska neuronalnego na płytce 96-dołkowej. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces izolacji i hodowli mikrogleju; obrazy mikroskopowe po 24 h, 48 h; analiza immunofluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przegląd kokultury mikrogleju i neuronów. (A) Schemat blokowy kluczowych kroków kokultury mikrogleju i neuronów. (B) Reprezentatywne obrazy z mikroskopu w świetle przechodzącym (powiększenie 10x) kokultury mikrogleju i neuronów w płytkach 96-dołkowych. Paski skali: 100 µm. (C,D) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej samych neuronów (C), samego mikrogleju (D), 2-dniowej kokultury neuronów i mikrogleju (E) lub 12-dniowej kokultury neuronów i mikrogleju (F) w płytce 96-dołkowej. Mikroglej i neurony zostały oznakowane odpowiednio za pomocą IBA-1 (czerwony) i tubuliny βIII (zielony). Jądra komórkowe wybarwiono DAPI (niebieski). Obrazy immunofluorescencyjne uzyskano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem do immersji w wodzie o powiększeniu 25x i aperturze NA 0,8. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

Nasze badania mają na celu zbadanie interakcji między neuronami a mikroglejem podczas stanów chorobowych, takich jak stwardnienie rozsiane. Naszym celem jest podsumowanie interakcji neuronalnych mikrogleju in vitro, aby lepiej zrozumieć ich funkcjonalne znaczenie w OUN. Wcześniej wykazaliśmy, że fagocytoza mikrogleju chroni neurony przed utlenioną śmiercią komórkową za pośrednictwem fosfatydylocholiny z tą kokulturą.Chociaż stosowane są również inne systemy kohodowli, ten mieszany system hodowli umożliwia bezpośredni i bliski kontakt między mikroglejem a neuronami. Ponadto może pozostać zdrowy od 12 dni do potencjalnie trzech tygodni, co pozwala na długoterminowe badania interakcji neuronalnych mikrogleju. Nasz protokół oferuje prostą i dostępną metodę wspólnej hodowli neuronów mikrogleju, które są łatwe do manipulowania i mogą być dalej wykorzystywane w dalszych testach w celu określenia zmian funkcjonalnych komórek.

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Film demonstruje technikę hodowli pierwotnych astrocytów z kory szczura. Kora jest mechanicznie dysocjowana w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek glejowych, która jest następnie powlekana na płytkach pokrytych polipeptydami w celu promowania selektywnej proliferacji astrocytów. Następnie astrocyty są enzymatycznie dysocjowane od płytek i przenoszone na świeże podłoża, co pozwala na hodowlę czystych astrocytów.

Generowanie pierwotnej kultury astrocytów z mózgu szczeniaka szczura

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) mają silne właściwości immunomodulacyjne, przydatne w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym. Pokazujemy, jak izolować i hodować mysie AdMSC i pierwotny mieszany glej, stymulować AdMSC do zwiększania poziomu genów przeciwzapalnych i czynników wzrostu, oceniać migrację AdMSC i kohodować AdMSC z pierwotnym mieszanym glejem zakażonym prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Poznaj metodę kokultury pierwotnych mikrogleju i neuronów mysich do badania interakcji komórkowych w układzie nerwowym. Model ten umożliwia obserwację ochronnych mechanizmów mikrogleju w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Przeglądaj więcej filmów