Name: Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj mechanizmy kompensacyjne w pasożytach malarii z hipomorficznymi allelami kinaz białkowych przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Badanie pokazuje, że podwójna inhibicja kinaz może zapobiegać lekooporności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie i udogodnienia dostępne za pośrednictwem Centralnego Ośrodka Instrumentacji, Szkoły Nauk Przyrodniczych, JNU. Podziękowania za wsparcie finansowe ze strony Katedry Biotechnologii (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) dla AB są również mile widziane. Dziękujemy Jose-Juanowi Lopezowi-Rubio za dostarczenie plazmidów pL6eGFP i pUF1. Agencja finansująca nie odgrywa żadnej roli w przygotowaniu i podjęciu decyzji o publikacji pracy. MS jest stypendystą JRF-SRF Fellowship przyznawanego przez Radę ds. Badań Naukowych i Przemysłowych.

Identifying Kinases Rewiring in Malaria Parasite: A Chemical Genetics Approach

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Wytwarzanie zmutowanego pasożyta transgenicznego zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 opiera się na danych dotyczących aktywności kinazy in vitro z rekombinowanymi enzymami. Lepiej jest wygenerować jak najwięcej zmutowanych rekombinowanych białek z różnymi resztami strażnika. Ponieważ genom P. falciparum jest wysoce bogaty w AT, ekspresja rekombinowanych białek w E. Bakterie coli mogą wymagać optymalizacji kodonów. Pomoże to w kompleksowej ocenie substytucji strażnika w odniesieniu do aktywności kinazy zmutowanego enzymu. Substytucja strażnika, która powoduje zmniejszenie potencjału transfosforylacji, jest wybierana w celu wytworzenia transgenicznego pasożyta wymiany allelicznej. Równolegle substytucja strażnika, która całkowicie znosi aktywność transfosforylacyjną kinazy, powinna być traktowana jako kontrola ujemna. Kolejną ważną kwestią przy generowaniu pasożyta wymiany alleli jest wprowadzenie mutacji synonimicznej wraz z mutacją testową i kontrolą negatywną. Wytwarzanie pasożyta zawierającego synonimiczną mutację w locus cdpk1 służy jako ważna kontrola wewnętrzna w celu wykluczenia ewentualnych błędów technicznych podczas wprowadzania mutacji testowej. Co więcej, transgeniczny pasożyt przenoszący mutację synonimiczną może być stosowany jako kontrola we wszystkich badaniach porównawczych zamiast pasożyta WT.
Zastosowaliśmy system dwuplazmidowy do generowania zmutowanego pasożytastrażnika 32,35. Jednak skuteczność wprowadzenia SNP do locus docelowego można zwiększyć poprzez zastosowanie systemu z jednym plazmidem zamiast systemu z dwoma plazmidami41. W systemie z pojedynczym plazmidem wszystkie krytyczne elementy, które są wymagane do edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9, są włączone do jednego plazmidu zamiast dwóch. Pojedynczy plazmid koduje endonukleazę Cas9, transkrybuje sgRNA składające się z tracrRNA i przewodnika RNA oraz zawiera ramię homologiczne do naprawy pęknięcia dwuniciowego wprowadzonego przez endonukleazę Cas9 w miejscu docelowym. W układzie dwuplazmidowym pasożyty są współtransfekowane z obydwoma plazmidami. Ponieważ liczba pasożytów otrzymujących oba plazmidy jednocześnie w systemie dwuplazmidowym będzie niska w porównaniu z systemem z jednym plazmidem, wydajność edycji genów za pośrednictwem CRISPR jest niższa w systemie dwuplazmidowym w porównaniu z systemem z jednym plazmidem. Alternatywnie, można również zastosować strategię ratowania samobójstw42, w której ramię homologii jest dostarczane jako fragment liniowy lub w plazmidzie bez markera selekcji leku (plazmid ratunkowy). Endonukleaza Cas9 i przewodnik kodujący sgRNA RNA są dostarczane w plazmidzie zawierającym kasetę wyboru leku (plazmid samobójczy). Ponieważ fragment liniowy lub plazmid bez kasety wyboru leku jest bardziej narażony na utratę podczas replikacji pasożyta, pęknięcie dwuniciowe wprowadzone przez endonukleazę Cas9 w locus docelowym musi być łatwo naprawione przy użyciu ramienia homologicznego, które może być dostępne przez ograniczony czas. Ta strategia ma pewne zalety w porównaniu z systemem dwuplazmidowym, ponieważ jest bardziej wydajna i nie ma potrzeby subklonowania ramienia homologii w innym plazmidzie. Inne warianty edycji genu CRISPR-Cas9 mogą być również brane pod uwagę przy wprowadzaniu SNP w docelowym locus43.
Ręcznie wybraliśmy region przewodni do wprowadzenia podstawiania T145M w locus cdpk1 . Odpowiednią sekwencję prowadzącą do wprowadzenia dwuniciowego łamania w locus docelowym można wybrać za pomocą różnych ogólnodostępnych programów online, takich jak Chopchop44, CRISPOR45, CCTop46, Cas-OFFinder47. Oprogramowanie to, oprócz zapewnienia wydajności każdej sekwencji prowadzącej, zapewnia również wyniki poza celem i swoistości, co zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentu edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9.
Dostępne są różne metody transfekcji pasożytów malarii. Używamy pasożytów w stadium pierścieniowym do eksperymentów transfekcji48,49, jednak wstępne ładowanie erytrocytów plazmidami jest również z powodzeniem stosowane w badaniach transfekcji pasożytów50. W tej metodzie erytrocyty są transfekowane plazmidami pod określonym zestawem parametrów za pomocą elektroporacji, a następnie wykorzystywane do infekcji oczyszczonymi pasożytami w późnym stadium. Pasożyty atakują erytrocyty, które są wstępnie załadowane plazmidami. Podczas ich wzrostu w erytrocytach wstępnie załadowanych plazmidami, pasożyt pobiera plazmidowe DNA poprzez nieznany mechanizm50. Istnieje inna metoda, którą można zastosować do transfekcji pasożytów, która wymaga bardzo dojrzałych, oczyszczonych pasożytów w stadium schizonta do bezpośredniej transfekcji plazmidami. Przyrządem używanym do transfekcji oczyszczonych schizontów jest 4D-nucleofector51. Wybór metody transfekcji różni się w zależności od różnych grup badawczych w zależności od dostępnych zasobów i wskaźnika sukcesu. Dobrym pomysłem jest sprawdzenie, które z trzech metod sprawdzają się w grupie i zastosowanie jej w kolejnych eksperymentach transfekcyjnych. Dwie metody mogą być stosowane kolejno, aby jeszcze bardziej zwiększyć wydajność transfekcji. Na przykład, pierwszy etap transfekcji może wykorzystywać pasożyty w stadium pierścieniowym, a następnie dodawać świeże krwinki czerwone wstępnie załadowane plazmidami.
Wybraliśmy tylko kilka genów do analizy transkryptu u CDPK1T145M pasożytów w porównaniu z kontrolą na podstawie wcześniejszej literatury lub obecności członków rodziny CDPK. Jednak, aby uzyskać kompleksowy wgląd w globalne przeprogramowanie transkrypcji w transgenicznym pasożytze zawierającym hipomorficzny allel CDPK1 , można zastosować takie podejścia, jak RNA-Seq lub mikromacierz.
Metoda zastosowana w tym badaniu może być zastosowana do innych kinaz pasożyta malarii w celu zrozumienia rozwoju mechanizmów kompensacyjnych pod presją leków. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być przydatne w strategicznym wdrażaniu leków skojarzonych w celu uniknięcia rozwoju i rozprzestrzeniania się oporności na leki. Celowanie w dwie lub wiele kinaz, które wykazują funkcjonalną komplementację, jest lepszą strategią niż celowanie w pojedyncze kinazy w celu kontroli i eliminacji malarii.

Malaria jest jedną z głównych chorób zakaźnych, która jest odpowiedzialna za miliony zgonów każdego roku, szczególnie u dzieci poniżej 5 roku życia1. Nie ma klinicznie dostępnej szczepionki przeciwko malarii. Co więcej, Plasmodium falciparum, najbardziej śmiercionośny pasożyt malarii u ludzi, jest znany z tego, że nabył oporność na lek pierwszej linii o nazwie artemizynina2,3,4,5. Istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych celów leków i nowatorskich strategii, które można szybko wdrożyć, aby uniknąć rozprzestrzeniania się oporności na artemizyninę na całym świecie. Lepsze zrozumienie mechanizmu działania leków i molekularnych podstaw szlaków kompensacyjnych może pomóc w opracowaniu lepszych strategii zapobiegania rozwojowi oporności na leki.
Kinazy białkowe należące do rodziny kinaz białkowych zależnych od wapnia (CDPKs) są kluczowe na wielu etapach rozwoju pasożyta w fazie erytrocytowej, płciowej i pre-erytrocytarnej6. Podczas replikacji bezpłciowej P. falciparum, CDPK5 jest znany z tego, że odgrywa kluczową rolę w wychodzeniu merozoitów z dojrzałych schizonts7. Warunkowa delecja CDPK5 nie pozwala schizontom na uwalnianie merozoitów do krwiobiegu, co prowadzi do śmierci pasożyta. Molekularny mechanizm wydostania się pasożyta za pośrednictwem CDPK5 nie jest w pełni zrozumiały i uważa się, że obejmuje kinazę białkową G (PKG) jako regulator wyższego szczebla7,8. CDPK7 jest niezbędny do dojrzewania pasożytów w stadium pierścieniowym do trofozoitu9. CDPK4 to kolejny członek rodziny CDPK, który ma kluczowe znaczenie dla rozwoju etapów płciowych u komarów. Bierze udział w wielu etapach podczas procesu egzflagacji i dlatego ma kluczowe znaczenie dla tworzenia wolnych, ruchliwych, męskich gamet10,11,12,13. CDPK1 fosforyluje składniki kompleksu błony wewnętrznej i rhoptryi14,15. Co więcej, warunkowa delecja CDPK1 powoduje hipofosforylację białek biorących udział w inwazji RBC16. Wykazano, że CDPK1 reguluje wydzielanie organelli wierzchołkowych podczas procesu inwazji17. CDPK1 pomaga również w wydostawaniu się merozoitów z zakażonych RBC poprzez fosforylację proteazy SERA518. Fosforylowany CDPK1 jest preferencyjnie zlokalizowany na wierzchołkowym końcu merozoitu, gdzie może wchodzić w interakcje z innymi białkami pasożytniczymi wymaganymi w procesie inwazji19,20. CDPK1 bierze również udział w tworzeniu męskich i żeńskich gamet, co jest krytycznym etapem dla przenoszenia malarii i rozwoju płciowego pasożyta u komarów21.
Podejście genetyki chemicznej było historycznie używane do identyfikacji funkcjonalnych ról kinaz ssaków22,23. Podejście to wykorzystuje podstawienie reszty w pozycji strażnika aminokwasem o innym łańcuchu bocznym. Zmiana reszty strażnika moduluje rozmiar sąsiedniej kieszeni ATP, co z kolei zmienia dostępność związków chemicznych zwanych inhibitorami kinaz uderzeniowych (BKI) w kierunku zmutowanego enzymu w porównaniu z typem dzikim. Zastąpienie nieporęcznej reszty na stanowisku strażnika mniejszą resztą umożliwia dostęp do BKI, podczas gdy odwrotne podstawienie sprawia, że kinaza staje się oporna na BKI. W niektórych przypadkach substytucja reszty strażnika wiąże się ze spadkiem aktywności kinazy docelowego enzymu, co sprawia, że modyfikacja jest nietolerancyjna dla badań funkcjonalnych24,25. Negatywny wpływ substytucji gatekeepera na aktywność enzymu można odwrócić poprzez generowanie mutacji supresorowej w drugim miejscu w nietolerancyjnej kinase25. Do zbadania funkcji kinaz białkowych Apicomplexanu wykorzystano podejście oparte na genetyce chemicznej. CDPK4 typu dzikiego zawierający mniejszą resztę strażnika był selektywnie hamowany przez inhibitory kinaz uderzeniowych BKI-1 i 1294, co prowadziło do zablokowania męskiej gametogenezy i rozwoju oocyst11,12. Zastąpienie małej reszty strażnika w CDPK4 dużą resztą metioniny doprowadziło do zmniejszenia inhibicji za pośrednictwem BKI w egflagelacji11. Wykazano, że CDPK1 Toxoplasma gondii, pasożyta Apicomplexan blisko spokrewnionego z pasożytem malarii, jest zaangażowany w ruchliwość i inwazję komórek gospodarza przez tachyzoity26,27. Mniejsza kieszeń strażnika TgCDPK1 typu dzikiego została wykorzystana do zaprojektowania specyficznych inhibitorów, które zmniejszały patogenezę choroby w modelach zwierzęcych28,29. Zaangażowanie P. Falciparum Kinaza białkowa G (PKG) w późnym rozwoju schizogonii i tworzeniu gamet została wykazana poprzez hamowanie aktywności enzymu za pomocą specyficznych inhibitorów farmakologicznych30,31. Zastąpienie treoniny na pozycji strażnika glutaminą (T618Q) znacznie zmniejszyło wrażliwość zmutowanego enzymu na inhibitory, co spowodowało prawidłową gametogenezę i progresję schizonta do pierścienia30,31.
Większość poprzednich badań wykorzystywała podejście genetyki chemicznej do funkcjonalnej charakterystyki docelowych kinaz11,12,22,23,26,30,31 Jednak przyjęliśmy to podejście, aby zrozumieć rozwój mechanizmów kompensacyjnych u pasożytów, które są nosicielami hipomorficznego allelu kinazy białkowej. Wcześniej wykazaliśmy, że zastąpienie reszty strażnika typu dzikiego w CDPK1 metioniną (T145M) powoduje ~ 47% spadek potencjału transfosforylacji zmutowanego enzymu 32. Zmutowany pasożyt zawierający hipomorficzny allel cdpk1 (cdpk1t145m) jest wstępnie przystosowany do zmniejszonej aktywności CDPK1 poprzez transkrypcyjne przeprogramowanie innych członków rodziny CDPK. Uważamy, że strategia ta może być ogólnie stosowana do wyjaśnienia mechanizmów kompensacyjnych w zmutowanych pasożytach zawierających hipomorficzne allele niezbędnych kinaz białkowych. Inne kinazy, które częściowo kompensują funkcję kinazy docelowej, mogą być jednocześnie hamowane wraz z kinazą docelową, aby zapobiec rozwojowi oporności na leki przeciwko pojedynczym kinazom. Może to służyć jako lepsza strategia kontroli malarii.

<table><tbody><tr><td>1x koktajl inhibitorów fosforanów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GST</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>ThermoFisher Wirówka Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>(do granulowania komórek bakteryjnych)</td><td>Wirówka ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>(do granulowania/przetwarzania pasożytów)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Sorvall ST 8R (rotor TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS kompetentne komórki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Kompetentne komórki</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,2 cm</td><td>Elektroporator Bio</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP odczynnik chemiluminescencyjny</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutation Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Wolny kwas</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksantyna</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania HD w fuzji</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, defosforylowany</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Żel i mini zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>mesylan p-nitrobenzylu (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max Polimeraza DNA</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania Qiaprep Spin&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL zestaw do mutagenezy ukierunkowanej</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Zestaw do syntezy pierwszej nici</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało estru tiofosforanowego</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

Jednym z mechanizmów osłabiania działania leków przez pasożyta malarii jest zmiana jego transkryptomu. Efekt ten jest bardziej wyraźny w przypadku genów docelowych należących do rodziny wielogenowej. Kinazy białkowe Plasmodium falciparum należące do rodziny CDPK są niezbędne do rozwoju krwi. W związku z tym CDPK są uważane za dobre cele dla rozwoju związków przeciwmalarycznych. Podejście oparte na genetyce chemicznej było historycznie stosowane do wyjaśnienia funkcji kinaz białkowych u wyższych eukariontów. Wymaga to zastąpienia reszty strażnika innym aminokwasem o innym łańcuchu bocznym poprzez manipulację genetyczną. Substytucja aminokwasów w pozycji strażnika moduluje aktywność kinazy białkowej i zmienia jej podatność na określoną klasę związków znanych jako inhibitory kinaz uderzeniowych (BKI), które pomagają w funkcjonalnej identyfikacji docelowego genu. W tym miejscu wykorzystaliśmy podejście genetyki chemicznej, aby zrozumieć mechanizmy kompensacyjne wyewoluowane przez zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1. Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście pomaga w identyfikacji szlaków kompensacyjnych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane w celu zapobiegania rozwojowi lekooporności na poszczególne kinazy.

Rekombinowane białko CDPK1 typu WT jest wyrażane jako białko fuzyjne z N-końcowym znacznikiem Glutathione S-transferase (GST) i oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa GST. Oczyszczone białko CDPK1 wykryto metodą Western blot przy użyciu przeciwciał anty-CDPK1 i anty-GST (Rycina 1). Pozostałość treoninowa gatekeepera (T145) w CDPK1 WT została zastąpiona Met oraz Ser za pomocą mutagenezy celowanej w celu wygenerowania rekombinowanych białek mutantów CDPK1T145M i CDPK1T145S (Rycina 2). Przeprowadzono test kinazowy in vitro, aby ocenić aktywność kinazy wszystkich rekombinowanych białek CDPK1. Aktywność kinazy badano przy użyciu półsyntetycznego podejścia z tagowaniem epitopowym34 poprzez wykrywanie grupy tiofosforanowego estru za pomocą specyficznego przeciwciała w formacie Western blot (Rycina 3). Wpływ substytucji gatekeepera na aktywność autofosforylacji CDPK1 oraz transfosforylację MBP, wykorzystanego jako egzogenny substrat CDPK1, oceniono poprzez kwantyfikację intensywności odpowiednich prążków autofosforylacji i transfosforylacji. Mutant CDPK1 z metioniną w pozycji gatekeepera zachował ~ 53% aktywności transfosforylacji, podczas gdy obecność seryny w pozycji gatekeepera doprowadziła do całkowitego zniesienia transfosforylacji substratu (Rycina 3). SNP prowadzące do substytucji gatekeepera z Thr na Met (T145M) wprowadzono do endogennego locus cdpk1 za pomocą CRISPR-Cas9 z wykorzystaniem systemu dwuplazmidowego (Rycina 4 i Rycina 5). Nie udało się wygenerować mutantów pasożytów z substytucją T145S, co prawdopodobnie wynika z letalnego efektu seryny gatekeepera na aktywność CDPK1. Mutanty pasożytów CDPK1T145M podklonowano metodą rozcieńczeń ograniczających, a substytucję gatekeepera potwierdzono za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera, aby zweryfikować powstanie mutanta pasożyta CDPK1T145M. Poziomy transkrypcji 11 różnych kinaz, w tym 7 członków rodziny CDPK i 4 innych kinaz zaangażowanych w późny rozwój schizogoniczny pasożyta, przetestowano za pomocą real-time PCR (Rycina 6). Poziomy ekspresji 11 różnych kinaz porównano pomiędzy mutantem CDPK1T145M a pasożytami typu dzikiego (WT), normalizując je do genów housekeepingowych. Ekspresja transkrypcyjna członków rodziny CDPK była zmieniona w mutancie CDPK1T145M w porównaniu z pasożytem WT (Rycina 6). Transkrypty wykazujące wyższą ekspresję w mutancie CDPK1T145M mogą kompensować funkcję CDPK1 w mutantcie pasożyta CDPK1T145M.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Charakterystyka pełnowymiarowego rekombinowanego PfCDPK1 typu dzikiego (WT). Pełnowymiarowe białko WT CDPK1 połączone z N-końcowym znacznikiem GST (transferaza S-glutationianu) zostało oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa i rozdzielone w 10% SDS-PAGE. Białko CDPK1 migrowało zgodnie z przewidywaną masą cząsteczkową wynoszącą ~ 87 kDa, co przedstawiono na żelu poliakrylamidowym barwionym Coomassie Brilliant Blue R-250. Rekombinowane białko rozdzielone w SDS-PAGE przeniesiono na membranę PVDF i poddano analizie Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko CDPK1 oraz przeciwciał przeciwko GST. Prążek odpowiadający pełnowymiarowemu rekombinowanemu CDPK1 w SDS-PAGE został wykryty przy użyciu obu przeciwciał, co potwierdziło tożsamość białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Charakterystyka oczyszczonych rekombinowanych białek mutantów gatekeeper CDPK1. (A) Dopasowanie pierwotnej sekwencji aminokwasowej TgCDPK1 i PfCDPK1 (numer dostępu Plasmodb PF3D7_0217500). Treonina w pozycji 145 PfCDPK1 odpowiada glicynie 128, pozycji gatekeeper w TgCDPK1 (zaznaczonej na czerwono). (B) Schematyczne przedstawienie reszty gatekeeper Thr (zaznaczonej na czerwono) kodowanej przez triplet kodon ACC (czarne koło) w CDPK1 typu dzikiego (WT). Podstawienie reszty gatekeeper za pomocą mutogenezy celowanej w celu wytworzenia rekombinowanych białek mutantów CDPK1 z Met (zaznaczoną na żółto) w CDPKT145M oraz Ser (zaznaczoną na niebiesko) w CDPKT145S. (C) Profil SDS-PAGE rekombinowanych białek CDPK1 typu dzikiego i mutantów. Rekombinowane białka WT i mutanty gatekeeper zostały oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa GST i rozdzielone metodą SDS-PAGE. Wszystkie białka rekombinowane są zgodne z oczekiwaną masą cząsteczkową ~87 kDa. M – drabinka mas cząsteczkowych. (D) Charakterystyka rekombinowanych białek CDPK1 typu dzikiego i mutantów za pomocą Western blottingu. Rekombinowane białka CDPK1 typu dzikiego i mutanty gatekeeper zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE i przeniesione na membranę PVDF do analizy Western blotting. Prążki odpowiadające pełnowymiarowym rekombinowanym białkom CDPK1 typu dzikiego i mutantów w SDS-PAGE zostały wykryte za pomocą przeciwciał przeciwko CDPK1 i GST, co potwierdziło tożsamość wszystkich białek rekombinowanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg" /> 
Rycina 3Substytucja pozostałego w pozycji gatekeepera w CDPK1 prowadzi do spadku aktywności kinazy enzymów zmutowanych. (A) Schematyczne przedstawienie półsyntetycznego podejścia do znakowania epitopów w celu wykrywania aktywności kinazy białka CDPK1. Przedstawiono tutaj wyłącznie aktywność transfosforylacji. Białko CDPK1 tiofosforyluje egzogenny substrat (S, zielony kwadrat) w obecności ATP&#947;S (żółty trójkąt wypełniony), źródło przenoszalnej terminalnej grupy tiofosforanowej). Pozostałość tiofosforylowana zostajey alkilowana poprzez traktowanie mesylanem p-nitrobenzylowym (PNBM), co prowadzi do powstania estru tiofosforanu, który następnie jest wykrywany za pomocą przeciwciała specyficznie rozpoznającego alkilowany addukt tiofosforanu. (B) In vitro do oceny wpływu substytucji aminokwasu gatekeepera na potencjał autofosforylacji i transfosforylacji rekombinowanych białek mutantów CDPK1 wykorzystano test aktywności kinazy z zastosowaniem półsyntetycznego podejścia do znakowania epitopowego. Wszystkie białka rekombinowane wykazują wapniozależną aktywność kinazy. Autofosforylacja CDPK1 oraz transfosforylacja egzogennego substratu, jakim jest podstawowe białko mieliny (MBP), były widoczne wyłącznie w obecności chlorku wapnia (CaCl2)2+), natomiast w obecności EGTA, specyficznego chelatora Ca, nie wykryto fosforylacji2+ jony. Mutanty gatekeepera wykazują obniżoną aktywność autofosforylacji, podczas gdy transfosforylacja MBP została całkowicie zniesiona w przypadku CDPK1T145S. CDPK1T145M zachowuje potencjał transfosforylacji (~ 53 %), jak zgłoszono wcześniej32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Konstrukcja plazmidów do wprowadzania SNP w pozycji gatekeeper w locus cdpk1 przy użyciu CRISPR-Cas9. Sekwencja naprowadzająca składająca się z 20 nukleotydów, odpowiadająca pozycji od 432 do 451 bp, została sklonowana w miejscu restrykcyjnym BtgZI w plazmidzie pL6eGFP w celu wygenerowania pL6CK1G. Ramie homologii (421 bp) zawierające pożądane SNP (T145M lub T145S, odpowiadający kodon zaznaczony na zielono) wraz z mutacjami osłonowymi (zaznaczonymi na czerwono) zostało sklonowane w pL6CK1G pomiędzy miejscami restrykcyjnymi AflII i SpeI w celu wygenerowania odpowiednio pL6CK1GT145M i pL6CK1GT145S. Mutacje osłonowe zapobiegają ponownemu przecięciu zmodyfikowanego locus po dokonaniu pożądanej edycji. Endonukleaza Cas9 zakodowana w drugim plazmidzie, pUF1, jest kierowana do miejsca docelowego w locus cdpk1 za pomocą gRNA ekspresowanego z plazmidu pL6CK1GT145M/S. Cas9 wprowadza pęknięcie dwuniciowe w miejscu docelowym po stronie 5' sekwencji PAM. Pęknięcie dwuniciowe jest naprawiane z wykorzystaniem ramienia homologii w plazmidzie pL6CK1GT145M/S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Schematyczne przedstawienie transfekcji P. falciparum plazmidami CRISPR w celu wprowadzenia mutacji gatekeeper (T145M) w locus cdpk1. i) Asynchroniczna hodowla P. falciparum jest poddawana działaniu sorbitolu w celu uzyskania zsynchronizowanych pasożytów w stadium pierścienia. ii) Zsynchronizowane pasożyty w stadium pierścienia przenosi się do kuwety do elektroporacji wraz z plazmidami pL6CK1GT145M/S i pUF1 resuspendowanymi w roztworze buforowym. iii) Pasożyty są elektroporowane przy 310 voltach, 950 µF i nieskończonej rezystancji. iv) Po transfekcji pasożyty przenosi się do kolby T25 zawierającej świeże, kompletne podłoże RPMI (cRPMI) i inkubuje przez 48 h. Po 48 h transfekowane pasożyty przenosi się na cRPMI uzupełnione lekami WR99210 i DSM267 i namnaża w kolbie T75. v) W 14. dniu przygotowuje się szkiełka i barwi je barwnikiem Giemsy. vi) Następnie rozmaz krwi ogląda się pod mikroskopem świetlnym w celu oceny obecności zarażonych RBC. vii) Po wizualizacji pozwala się pasożytom rosnąć w obecności leków. Następnie pasożyty są przetwarzane w celu uzyskania matrycy do PCR i sekwencjonowania DNA dla weryfikacji pożądanej modyfikacji docelowego locus cdpk1. viii) Po weryfikacji uzyskuje się klonalne pasożyty transgeniczne poprzez przeprowadzenie rozcieńczeń ograniczających na płytce 96-dołkowej. ix) Klonalne pasożyty transgeniczne z pozytywnych dołków przenosi się do kolb T25 i pozwala im rosnąć. x) Klonalne pasożyty transgeniczne są dalej walidowane za pomocą PCR oraz potwierdzenia obecności pożądanych SNP w pozycji gatekeeper poprzez sekwencjonowanie DNA i analizę chromatogramu. Rysunek zmodyfikowano na podstawie32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Schematyczne przedstawienie etapów analizy transkrypcji genów docelowych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR). i) Kulturę P. falciparum z przewagą pasożytów w dojrzałym stadium schizontów uzyskuje się poprzez traktowanie sorbitolem w tym samym cyklu. ii) Pasożyty są ostrożnie nakładane na gradient 70/40 Percoll/sorbitol w 15 mL probówce stożkowej w celu wzbogacenia frakcji dojrzałych schizontów. iii) Czarny pierścień na granicy faz 40 % i 70 % Percoll/sorbitol jest przenoszony do nowej probówki 50 mL, przetwarzany i resuspenderowany w cRPMI. Pasożyty wzbogacone w stadium schizontów są inkubowane ze świeżymi RBCs, uprzednio inkubowanymi w 37 °C, w celu inwazji. iv) Pasożyty są hodowane przez 4 h, a następnie traktowane 5 % sorbitolem, aby uzyskać silnie zsynchronizowane pasożyty w stadium pierścienia (0-4 h). v) Pasożyty są dalej hodowane przez dodatkowe 44 h po traktowaniu sorbitolem, aby uzyskać silnie zsynchronizowane pasożyty w stadium schizontów (44-48 h). vi) Zsynchronizowane pasożyty są traktowane saponiną w celu uwolnienia ich z RBCs, a następnie przechowywane w odczynniku do ekstrakcji RNA. Całkowite RNA jest izolowane z resuspenderowanych pasożytów po ekstrakcji RNA. vii) Z wyizolowanego RNA przygotowywane jest cDNA. viii) Eksperyment PCR w czasie rzeczywistym jest przeprowadzany z matrycą cDNA w celu amplifikacji genów docelowych przy użyciu starterów specyficznych dla genów. Płytka jest analizowana w systemie PCR w czasie rzeczywistym. ix) Dane dotyczące ekspresji transkrypcyjnej są analizowane za pomocą oprogramowania analitycznego. Wykres przedstawia różnicowe poziomy ekspresji transkrypcyjnej 11 kinaz w pasożytach CDPK1 T145M w porównaniu z typem dzikim (WT). Rycina zmodyfikowana na podstawie32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa genu</td>
			<td colspan="4">Sekwencja startera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145S_antysensowny</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1T145M_antysensowny</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ck1PRZEWODNIKREW</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ck1f1&#160;</td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ck1r3wt</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista starterów użytych w badaniu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Nazwa genu</td>
			<td colspan="2" >Starter przedni</td>
			<td colspan="2" >Starter odwrotny</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2" >GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2" >ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2" >GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2" >TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2" >CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2" >CAGCGTCCATTGTAAG 
			ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2" >ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2" >CTTATCACTAATTTTTTT 
			GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2" >GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2" >TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2" >CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2" >ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2" >AGTCCTAAAAAAGATATA 
			TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2" >TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PKA (PF3D7_0934800)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2" >AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2" >CTTTTGTTTCTTCTTAAA 
			AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PKG (PF3D7_1436600)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2" >AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2" >CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PKB (PF3D7_1246900)&#160;&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2" >CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2" >GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PI3K (PF3D7_0515300)&#160;&#160;</td>
			<td colspan="2" >CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2" >ATCACATTTGTTATACTT 
			ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2" >GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2" >GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2" >CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2" >TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC&#160;</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Lista genów docelowych (numer identyfikacyjny PlasmoDB) wraz z sekwencjami starterów użytych do analizy real-time PCR.

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

One of the mechanisms for subverting the effect of drugs by&#160;the malaria parasite is through rewiring of its transcriptome. The effect is more ...

Oporność na leki jest poważnym wyzwaniem w walce z malarią. Nasze badanie ma na celu zidentyfikowanie szlaków kompensacyjnych u pasożytów malarii zawierających hipomorficzny allel niezbędnych kinaz białkowych. Celowanie w dwie kinazy jednocześnie może być lepszą strategią, która pozwala uniknąć rozwoju oporności na leki przeciwko pojedynczym kinazom.Edycja genów za pomocą CRISPR-Cas9 przyniosła ogromne korzyści w badaniach nad malarią i odegrała zasadniczą rolę w przeprowadzaniu wymiany allelicznej, endogennego znakowania, warunkowego nokautu i knockdown docelowego genu. Molekularny mechanizm oporności na leki, zrozumienie funkcji genu docelowego i badanie interakcji pasożyta żywiciela mogą być teraz badane z większą łatwością. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują heterologiczną ekspresję białek w E. coli ze względu na duże bogactwo genomu zarodźca.Dodatkowo, celowy efekt CRISPR-Cas9 komplikował interpretację danych i prowadził do błędnych wyników. Niska wydajność transkrypcji w przypadku pasożyta malarii wydłuża czas potrzebny do wygenerowania pożądanej modyfikacji genetycznej. Nasze odkrycia sugerują, że celowanie w pojedynczą kinazę pasożyta malarii może prowadzić do kompensacji nadmiernej ekspresji innych kinaz.Rodzi to nowe pytanie o potencjał oporności adaptacyjnej i o to, czy podwójne hamowanie kinazy może skutecznie zapobiec takiej adaptacji, otwierając możliwości dla skojarzonych strategii terapeutycznych. W przyszłości nasze laboratorium będzie zajmować się innymi niezbędnymi kinazami białkowymi pasożytów malarii przy użyciu genetyki chemicznej. Przeprogramowanie transkrypcji u zmutowanych pasożytów pomoże w identyfikacji szlaków kompensacyjnych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane w celu zapobieżenia rozwojowi oporności na leki przeciwko poszczególnym kinazom.

understanding-development-compensatory-pathways-mutant-malaria

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym wywiadzie George Dimopoulos skupia się na mechanizmach fizjologicznych wykorzystywanych przez komary do zwalczania infekcji wywoływanych przez Plasmodium falciparum oraz wirusa dengi. Wyjaśniono, w jaki sposób identyfikuje się u komarów kluczowe geny refrakcyjne, czyli geny nadające odporność na patogeny wektora, oraz jak tę wiedzę można wykorzystać do stworzenia transgenicznych komarów, które nie są w stanie przenosić pasożyta malarii ani wirusa dengi.

Tworzenie lepszego komara: Identyfikacja genów umożliwiających odporność na malarię i gorączkę dengi u komarów A. gambiae i A. aegypti

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum.  Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Poznaj mechanizmy kompensacyjne w pasożytach malarii z hipomorficznymi allelami kinaz białkowych przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Badanie pokazuje, że podwójna inhibicja kinaz może zapobiegać lekooporności.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych (Wideo) | JoVE Journal

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Przeglądaj więcej filmów