Name: NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę NMR 15N do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy. Protokół umożliwia analizę dynamiki resztowej i zrozumienie funkcji molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Melindzie Jaspert i Kevinowi Bochinsky'emu za pomocne dyskusje. N.L. dziękuje Niemieckiej Fundacji Naukowej za dofinansowanie przez Program Heisenberga (grant DFG numer 433700474). Prace te są dodatkowo wspierane przez projekt "Wirusologiczne i immunologiczne uwarunkowania patogenezy COVID-19 - lekcje przygotowujące się na przyszłe pandemie" (KA1-Co-02 "COVIPA"), grant z Funduszu Inicjatyw i Sieci Spółek Helmholtza. Dziękujemy za hojny dostęp do Centrum Biomolekularnego NMR Jülich-Düsseldorf, prowadzonego wspólnie przez Forschungszentrum Jülich i Uniwersytet Heinricha Heinego w Düsseldorfie (HHU).

Protocol for NMR 15N Relaxation and hetNOE Experiments in Protein Dynamics Study

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Protokół ten opisywał konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR 15N przez Lakomka i wsp.69 oraz Stiefa i wsp.70. Skupiliśmy się na sekwencjach impulsów NMR przy użyciu schematu wykrywania HSQC o zwiększonej czułości. Eksperymenty 15N R1 i R1ρ są realizowane zgodnie ze szczegółowym opisem Stief i wsp.70, a eksperyment hetNOE jest opisany przez Lakomka i wsp.69.
Podczas ustawiania eksperymentów relaksacyjnych NMR, 15N R1ρ jest najbardziej krytycznym z nich, ponieważ wybór zbyt długiego maksymalnego okresu relaksacji lub zbyt wysokiej amplitudy RF spin-locka może spowodować uszkodzenie sondy. W przypadku okresu relaksacji pożądane jest pobieranie próbek pełnej krzywej rozpadu równomiernie od intensywności 100% do intensywności 25% (w porównaniu z doświadczeniem referencyjnym). W przypadku powoli rozluźniających się białek, takich jak IDP, o długim 15N T2 razy, często nie będzie możliwe pobranie próbki krzywej rozpadu w pełnym zakresie, ponieważ depozycja mocy w sondzie musi być ograniczona.
W przypadku amplitudy częstotliwości radiowej (RF) 15N teoretycznie im wyższa amplituda RF, νspin-lock, tym lepiej, ponieważ można przeorientować więcej procesów wymiany. Z reguły procesy wymiany wolniejsze niż 1 / (2π νspin-lock ) mogą być ponownie ukierunkowane. Obowiązują jednak ograniczenia mocy RF. Na przykład w naszej dłoni nie przekroczylibyśmy maksymalnego okresu blokady wirowania wynoszącego 65 ms, gdy zastosowana jest amplituda RF 2 kHz, aby pozostać po bezpiecznej stronie. Jednocześnie amplituda RF z blokadą spinową na spektrometrze 600 MHz powinna być wyższa niż 1 kHz, np. 1,4 kHz przy 600 MHz, co okazało się wystarczające dla małego białka globularnego gb369. Aby pokryć szerokości spektralne i uniknąć efektów rezonansowych przy wyższych natężeniach pola, odpowiednia amplituda RF powinna skalować się wraz z polem magnetycznym, np. 1,5 raza wyższa przy 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Musi jednak mieścić się w ograniczeniach sondy. (Zapoznaj się z lokalną listą ograniczeń mocy spektrometru i skontaktuj się z kierownikiem obiektu NMR w celu uzyskania porady.)
Przy wyborze odstępu opóźnień relaksacji między eksperymentem referencyjnym (skrócone opóźnienie) a najdłuższym okresem opóźnienia (określonym przez czynniki omówione powyżej), preferujemy równe odstępy punktów danych opóźnienia relaksacji i wybieramy liczbę 8 (jeśli pozwala na to przydzielony czas pomiaru i sygnał do szumu). Pierwszy przyrost (i kolejne) będzie zdominowany przez najbardziej intensywne (i często najwolniej relaksujące) pozostałości. W związku z tym, w zależności od zakresu dynamicznego białka, sygnały NMR kilku reszt w sekwencji białka mogły już ulec rozpadowi po wybranym maksymalnym okresie relaksacji. Poprzez równomierne rozmieszczenie punktów opóźnienia zapewniamy, że krzywe relaksacji szybko relaksujących się pozostałości zostaną również pokryte przez wystarczającą liczbę punktów danych próbkujących krzywą relaksacji.
Dobry wybór opóźnienia odzyskiwania jest również niezbędny, aby uzyskać dokładne dane dotyczące relaksacji i uniknąć długotrwałego uszkodzenia sondy. Wybieramy opóźnienie powrotu co najmniej D1 = 2 s, aby zapobiec uszkodzeniu sondy. Aby uzyskać dokładne wyniki , należy równieżzapewnić białkom 1 H i 15N polaryzację wzdłużną na powrót do równowagi lub przynajmniej do stabilnego, ustalonego stanu. 1H T1 zwykle waha się między 1 s a 4 s przy 600 MHz dla małego lub średniego białka (do 20 kDa); w przypadku większych białek i wyższych pól, 1H T1 będzie dalej wzrastać. Dla małego białka globularnego gb3 stwierdziliśmy, że D1 = 3,5 s jest wystarczające dla eksperymentów 15N R1 i R1ρ . Dla małego IDP Syb-2 przedstawionego w tym protokole wykazaliśmy niedawno, że D1 = 2 s było odpowiednie70.
15N hetNOE ma najniższą czułość, ponieważ wzbudzenie rozpoczyna się od 15N i nie stosuje się 1 H-15N INEPT na początku sekwencji impulsów. Ponadto okres nasycenia 1H i opóźnienie powrotu 15N powinny wynosić 5 razy 15N T1, aby uzyskać dokładne dane. Podczas gdy dla przedstawionego tutaj IDP Syb-2 wystarczające było 5 s opóźnienia nasycenia/regeneracji plus dodatkowe 2 s opóźnienia odzyskiwania D1 (łącznie 7 s), dla większych białek i/lub białek deuterowanych czas ten może być znacznie dłuższy, np. 10 s lub dłużej. Jeśli jednak dane jakościowe są wystarczająco dobre, można zaakceptować niewielkie systematyczne przesunięcie. W takim przypadku rozsądne wyniki można uzyskać już przy 3 razy 15N T1, ponieważ zostanie osiągnięte 95% nasycenia. W takim przypadku wynikowe wartości hetNOE będą wykazywały systematyczne przesunięcie w stosunku do wyższych wartości.
W tym protokole pracowaliśmy z w pełni protonowanym 15N Syb-2, który jest najbardziej opłacalny. Deuteracja łańcucha bocznego jest zalecana w celu zmniejszenia liczby ścieżek relaksacyjnych i pracy z najbardziej izolowanymi parami spinów amidowych szkieletu 1 H-15N. Jednak porównując 15N2H Syb-2 i 15N syb-2, zauważamy tylko bardzo niewiele różnic między próbkami deuterowanymi i w pełni protonowanymi70. Ze względów praktycznych dane dotyczące relaksacji NMR są często rejestrowane na podwójnie lub potrójnie znakowanych próbkach (15N13C lub 2H15N13C). Omówione sekwencje impulsów NMR są zdolne do przegrupowania ewolucji sprzężenia J między jądrami 13C z 1H lub 15N. Oczywiście, również ścieżki relaksacyjne zwiększą się, gdy zostanie wprowadzone znakowanie 13C. Jednak w naszych rękach, ze względów praktycznych, wprowadzony błąd, jeśli w ogóle, wynosi mniej niż 5% i może być akceptowalny, gdy potrzebne są tylko dane jakościowe.
Podczas pracy z białkami o różnych rozmiarach do detekcji często pojawia się pytanie, czy wybrać eksperymenty wykrywane przez HSQC o zwiększonej czułości70 , czy eksperymenty wykrywane przez TROSY69. W przypadku małych białek eksperymenty NMR z detekcją HSQC o zwiększonej czułości oferują dwukrotny wzrost stosunku sygnału do szumu (pod warunkiem, że można uzyskać dobre tłumienie wody). W przypadku większych białek zwyciężą eksperymenty wykryte przez TROSY. Próg rentowności wynosi około 20 kDa dla pofałdowanych białek. W przypadku IDP, dla których można uzyskać niskie stałe szybkości R2 , które rosną mniej więcej liniowo wraz ze wzrostem długości łańcucha, próg rentowności można przesunąć do wyższych mas cząsteczkowych. Ze względów praktycznych zalecamy wdrożenie zarówno eksperymentów wykrywanych przez HSQC o zwiększonej czułości, jak i wykrywanych przez TROSY w razie wątpliwości. Następnie wybierz ten, który daje najlepszy stosunek sygnału do szumu w pierwszym kroku.
Dyskusja na temat tego, czy wybrać eksperymenty z wykrywaniem HSQC o zwiększonej czułości, czy z detekcją TROSY, ma zastosowanie tylko wtedy, gdy głównym kryterium jest stosunek sygnału do szumu. Gdy wymagana jest najmniejsza szerokość linii i najwyższa rozdzielczość, TROSY zawsze wygrywa. TROSY zawsze oferuje również najlepsze tłumienie wody, ponieważ nie jest wymagana mniejsza liczba impulsów protonów i nie jest wymagane odsprzęganie protonów. W celu szerszego omówienia odsyłamy do wcześniej opublikowanego artykułu69 .
Jeszcze jedna uwaga na temat tłumienia wody. Podczas gdy ustawienie wzmocnienia odbiornika (rg) na 16 może być wystarczające w konsolach Bruker Avance NEO, wzmocnienie odbiornika w zakresie 128-256 jest zwykle pożądane w przypadku (starszych) konsol Bruker Avance. Osiągalne rg (określane przez polecenie rga Brukera) jest często uzyskiwane na podstawie intensywności resztkowego sygnału wody do poziomu hałasu. Złe tłumienie wody zawsze wprowadzi dodatkowy szum w widmach. Tak więc, nawet jeśli rg = 16 można osiągnąć na konsoli Bruker Avance NEO, pozostały sygnał wodny może znacznie przyczynić się do poziomu szumów. W związku z tym stosunek sygnału do szumu zostałby zmniejszony. W związku z tym zalecamy dążenie do poziomu rg 128-256. Prezentowane sekwencje impulsów70 zostały przetestowane na częstotliwościach 600 MHz i 1200 MHz. Oba natężenia pola działają z tym samym ustawieniem gradientu, jak zapisano w sekwencji impulsów. Polecamy je co najmniej jako dobry punkt wyjścia do dalszej optymalizacji.
Jak wspomniano we wstępie, omawiane eksperymenty relaksacyjne NMR obejmują jedynie zakres czasowy od pikosekund do nanosekund. Aby uzyskać wgląd w dynamikę mikrosekund do milisekund, odnosimy się do eksperymentów dyspersji relaksacyjnej, eksperymentów CPMG i rozszerzenia eksperymentów R1ρ ze zmieniającymi się amplitudami spin-lock (lub częstotliwościami nośnymi) 44,46,58,59,60,61,85,86 . Dynamika wolniejsza niż mikrosekundy może być uchwycona 15N CEST (transfer nasycenia wymiany chemicznej) NMR62, spektroskopia wymiany (EXSY, milisekundy na sekundy) lub RT (czas rzeczywisty) NMR (sekundy na godziny)63,64. Efekt PRE (wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej) sond paramagnetycznych, a także szczątkowych sprzężeń dipolarnych (RDC), może być wykorzystany do oceny całego zakresu dynamiki ps do ms 65,66,67,68.
Wszystkie te eksperymenty obejmują tylko dynamikę szkieletu. Aby zbadać dynamikę łańcucha bocznego, Kay i współpracownicy przeprowadzili kolejne mnóstwo eksperymentów NMR, dostarczając informacji na temat dynamiki łańcucha bocznego dla białek do 1 MDa 2,87.
Aby uzyskać bardziej ilościowy wgląd w dynamikę szkieletu białkowego, konieczna jest połączona analiza wszystkich trzech parametrów NMR, 15N R1, R2 i hetNOE - czasami obejmująca nawet dodatkowe parametry, takie jak skorelowane krzyżowo stałe szybkości relaksacji. Opracowano różne zaawansowane metody analizy. Tak zwane podejście bez modelu znalazło szerokie zastosowanie w biomolekularnym NMR 43,88,89,90,91. Również mapowanie gęstości spektralnej może dostarczyć cennych informacji 55,92,93. Chociaż są to potężne metody analizy białek globularnych z dobrze zdefiniowanym czasem korelacji rotacyjnej, ich zastosowanie jest ograniczone w przypadku IDP. Dziedzina zagięta jest niezbędna do zdefiniowania czasu korelacji rotacyjnej39. Można to częściowo obejść, gdy funkcja korelacji C(t) może być modelowana przez sumę funkcji zanikających wykładniczo w przypadku, gdy różne zaangażowane skale czasowe mogą być dobrze oddzielone 23,31,84. W przypadku braku dobrze zdefiniowanego czasu korelacji rotacyjnej alternatywą są alternatywne podejścia obejmujące rozkład czasów korelacji, np. analiza IMPACT94 lub analiza DETECTOR95,96. Co więcej, połączona analiza danych dotyczących relaksacji NMR i symulacji MD jest również obiecująca dla osób wewnętrznie przesiedlonych97; Obecnie nadal mamy do czynienia z ograniczeniami w zakresie próbkowania i pola siłowego dla symulacji pełnych atomów większych IDP 31,98.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr HD Bruker 600 MHz AVANCE III&nbsp;</td><td>Przeprowadzone eksperymenty z NMR</td> <td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html firmy Bruker</td><td></td>&nbsp;</tr></tbody></table>

nmr 15n eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pozwala badać białka w roztworze i w temperaturach fizjologicznych. Często jako reportery dynamiki strukturalnej białek wykorzystuje się zarówno grupy amidowe szkieletu białkowego, jak i grupy metylowe w łańcuchach bocznych. Badanie dynamiki strukturalnej szkieletu białkowego białek globularnych na próbkach znakowanych 15N i w pełni protonowanych zwykle działa dobrze w przypadku białek o masie cząsteczkowej do 50 kDa. Gdy stosuje się deuterację łańcucha bocznego w połączeniu ze spektroskopią zoptymalizowaną pod kątem relaksacji poprzecznej (TROSY), limit ten można zwiększyć do 200 kDa dla białek globularnych i do 1 MDa, gdy nacisk jest położony na łańcuchy boczne. Kiedy badane są białka wewnętrznie nieuporządkowane (IDP) lub białka z wewnętrznie nieuporządkowanymi regionami (IDR), te ograniczenia wagowe nie mają zastosowania, ale mogą znacznie wykraczać. Powodem jest to, że IDP lub IDR, charakteryzujące się dużą elastycznością wewnętrzną, są często dynamicznie rozłączane. Różne metody NMR oferują wgląd w dynamikę strukturalną białek w rozdzielczości atomowej w szerokim zakresie skal czasowych, od pikosekund do godzin. Standardowe pomiary relaksacji 15N obejmują wewnętrzną elastyczność białka i charakteryzują dynamikę szkieletu białka występującą w szybkiej skali czasowej od piko- do nanosekundowej. W tym artykule przedstawiono praktyczny protokół konfiguracji i nagrywania eksperymentów NMR 15N R1, R2 i heterojądrowego efektu Overhausera (hetNOE). Pokazujemy przykładowe dane i wyjaśniamy, jak je interpretować w prosty sposób jakościowo, zanim przejdziemy do bardziej wyrafinowanej analizy.

Poniżej przedstawiono przykładowe dane dotyczące relaksacji NMR zarejestrowane na pęcherzykowym białku SNARE Synaptobrevin-2 (1-96), często nazywanym VAMP2 (białko związane z pęcherzykami 2). Do zapisu danych NMR użyliśmy próbki 171 μM 15N Synaptobrevin-2 (1-96) (nazwanej dalej Syb-2) w buforze 50 mM MES (pH 6,0) zawierającym 150 mM NaCl, 0,1 mM TCEP i 1 mM EDTA. Wszystkie dane eksperymentalne zarejestrowano w temperaturze 278,15 K przy użyciu objętości 250 μl wypełnionej probówką z próbką NMR o średnicy 3 mm. Doświadczenia przeprowadzono na spektrometrze AVANCE III HD firmy Bruker 600 MHz wyposażonym w kriosondę rezonansową poczwórną Bruker 5 mm QCI 1H, 15N, 13C, 31P.
Rysunek 3 przedstawia specyficzne dla pozostałości stałe szybkości relaksacji 15N R1 i R2 dopasowane do krzywych relaksacji NMR uzyskanych z eksperymentów relaksacyjnych NMR. Na osi y wykreślane są odpowiednie stałe szybkości relaksacji dla poszczególnych reszt wzdłuż sekwencji białka (na osi x). Pokazano również wartości 1 H-15N heterojądrowego NOE (hetNOE) wyekstrahowane ze stosunków intensywności nasyconych i nienasyconych (referencyjnych) eksperymentów 1 H-15N heterojądrowego NMR.
Dane heterojądrowe NOE i stałe szybkości 15N R2 są łatwiejsze do interpretacji niż dane 15N R1. Dlatego zaczniemy od nich.
Heterojądrowy NOE: 
Heterojądrowe {1H}-15N NOE są wrażliwe na dynamikę wewnętrzną w szybkiej pikosekundowej skali czasowej (&lt;100 ps, ze względu na zależność od relaksacji krzyżowej), ale także na dynamikę ps - ns (ze względu na zależność od R1) i mogą przyjmować wartości zwykle od 0 do (nieco mniej niż) 1 dla białek pofałdowanych. Na wyższych polach będą one systematycznie wyższe (ale zawsze niższe niż 1).
Opisują wewnętrzną elastyczność białka. Gdy porównuje się wartości hetNOE przy tych samych natężeniach pola, zachodzi zasada: im mniejsza {1H}-15N NOE, tym bardziej dynamiczna jest dana pozostałość. W przypadku IDP obserwuje się zazwyczaj małe specyficzne dla pozostałości {1H}-15N NOE, np. rzędu 0,5 i mniejsze przy 600 MHz. Jednak ujemne {1H}-15N NOE stwierdza się również dla IDP, nawet do -2 na częstotliwości 500 MHz. Dla monomerycznego Syb-2, {1H}-15N NOE mierzony w zakresie 600 MHz między -0,5 dla N-końca i 0,5 dla domeny łącznika C-końcowego. Wartości rosną stopniowo od N- do C-końca, wskazując na stopniowo malejącą elastyczność/rosnącą sztywność (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</silna>
15N R2 stałe szybkości 
15Stałe szybkości N R2 są wrażliwe na dynamikę ps - ns, która moduluje orientację wektora wiązania N-H poprzez ogólne bębnienie białka, ruch płaszczyzn peptydowych i skręcanie kątów dwuściennych kręgosłupa. W odróżnieniu od wartości {1H}-15N NOE i R1, stałe szybkości 15N R2 są zdominowane przez gęstość widmową J(0) związaną z ogólnym (rotacyjnym) wirowaniem białka. Dlatego w przypadku kulistych białek pofałdowanych stałe szybkości 15N R2 są skalowane pod względem wielkości zgodnie z ogólnym zawirowaniem i wielkością białka. W przypadku prawdziwych dostawców tożsamości nie można przypisać globalnego czasu korelacji rotacyjnej. Mimo to, czas powolnej korelacji zależny od długości łańcucha może być dopasowany84, zgodnie z oczekiwaniami dla polimerów, ale dynamika wewnętrzna specyficzna dla pozostałości ma większy wpływ na stałe szybkości 15N R2. W obrębie tego samego białka stałe szybkości 15N R2 pozwalają na dyskryminację struktur i regionów niestrukturalnych o różnej ruchliwości wewnętrznej specyficznej dla reszt. Im mniejsza obserwowana stała szybkości 15N R2, tym bardziej ruchliwa jest dana pozostałość. Wysokie stałe szybkości 15N R2 są charakterystyczne dla drugorzędowych elementów struktury, takich jak α-helisy lub nici β. Niskie stałe szybkości relaksacji R2 są charakterystyczne dla regionów pętlowych i wewnętrznie nieuporządkowanych. W przypadku monomerycznego Syb-2 (1-96) obserwujemy ogólnie niskie stałe szybkości 15N R2 zgodne z jego wewnętrznie nieuporządkowanym charakterem. Sztywność wewnętrzna wzrasta (ruchliwość maleje) od N-końca do domeny łącznika C-końcowego, zanim przejdzie do elastycznego C-końca (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</silna>
15N R1 stałe szybkości 
Tempo relaksacji R1 jest wrażliwe na dynamikę pikosekund (ps) i szybszych nanosekund (ns). Jednak ich bezpośrednia interpretacja dynamiki wewnętrznej jest bardziej złożona niż poprzednie. Istnieje pole T1 (R1) minimum (maksimum), gdy T1 jest wykreślane jako funkcja korelacji rotacyjnej τR: T1min przy τR, min = 1/ ω. W przypadku szybko wirujących cząsteczek o τR &lt; τR, min, np. małych cząsteczek lub małych białek globularnych, niższe stałe szybkości R1 wskazują na zwiększoną dynamikę szkieletu białka (tak samo jak dla R2). W przypadku większych białek, przy τR &gt; τR, min, jest odwrotnie, a wyższe stałe szybkości relaksacji R1 reprezentują zwiększoną dynamikę (przeciwną do R2).
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67088/67088fig03.jpg"> 
Rysunek 3: Dane relaksacyjne NMR. Dane były rejestrowane i oceniane zgodnie z protokołem i przepływem pracy opisanym powyżej. (A) Specyficzne dla reszty stałe szybkości relaksacji 15N R1 wzdłuż szkieletu białkowego Syb2 (1-96). (B) 15N R2 stałe szybkości relaksacji, obliczone na podstawie danych R1ρ i R1 przy użyciu wzoru (1). (C) prędkości transferu hetNOE wzdłuż szkieletu Syb2 (1-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/67088fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Wczytywanie parametrów NMR. Wyświetlany jest interfejs makra rpar. (A) Przegląd wszystkich zestawów parametrów. Czerwone pole oznacza pasek wyszukiwania. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. Kliknij dwukrotnie, aby wybrać zestaw parametrów. (B) Przegląd parametrów, które można zaimportować do bieżącego eksperymentu. Opcje wykonania getprosol lub zachowania określonych parametrów bieżącego eksperymentu są oznaczone czerwonymi polami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Pozycjonowanie klasy 1H częstotliwość nośna dla optymalnego tłumienia wody. Wyświetlany jest interfejs makra gs. Podczas gdy eksperyment jest zapętlony, możliwa jest zmiana różnych parametrów eksperymentu. Znacznik może być tutaj wykorzystany do zmiany wybranego parametru podczas akwizycji. Kliknięcie nad znacznikiem podnosi parametr o wartość określoną w polu "czułość". Przełącznik czułości może być używany do regulacji rozmiaru kroku znacznika. Po prawej stronie widoczny jest FID na żywo. W przypadku kalibracji O1 celem jest zminimalizowanie obszaru FID oznaczonego czerwoną ramką, ponieważ FID jest zwykle zdominowany przez sygnał wodny. Zmniejszenie obszaru FID idzie w parze ze zmniejszonym sygnałem wodnym i lepszym tłumieniem wody. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Bliższe spojrzenie na sekwencję impulsów 1 H-15N HSQC i jej parametry akwizycji. (A) Parametry sekwencji impulsów w eksperymencie 1 H-15N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. Kliknij na "E" aby otworzyć okno edytora programu impulsowego w B. (B) Edytor programów impulsowych eksperymentu 1 H-15N HSQC HSQCFPF3GPPHWG. Skomentowana linia (linia 91) z impulsem 15N 90° pokazuje oryginalną linię dla eksperymentu 1 H-15N HSQC. W linii 92 impuls 15N 90° jest zmieniany na impuls 15N 180°. Ta zmiana sprawia, że eksperyment 1 H-15N HSQC jest programem kalibracyjnym impulsu dla kalibracji twardego impulsu 90° 15N. Aby edytować sekwencje impulsów, najpierw zapisz sekwencję pod nową nazwą. Użyj następującego przepływu pracy: Kliknij Plik, Zapisz jako, wprowadź nową nazwę, kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk Ustaw PULPROG na zestaw danych. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%203.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 4: Ustawianie gradientów. Pokazany jest interfejs makra gpnam do zmiany kształtów, długości i mocy gradientu. Aby otworzyć używany interfejs parametrów sekwencji impulsów, należy wprowadzić wszystkie kształty gradientu GPNAM. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%204.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 5: Ustawianie opóźnień relaksacji. Interfejs makra vplist (identyczny z makrem vclist). (A) Interfejs do wyboru vplist. Klikając na trzy kropki, otworzy się interfejs B. (B) Interfejs, aby wybrać vplist za pomocą DoubleClick lub utworzyć nową listę, klikając Plik i Nowy. (C) Interfejs otwiera się poprzez utworzenie nowej listy lub edycję istniejącej listy. Listę można zapisać, klikając Plik i Zapisz. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%205.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 6: Parametry sekwencji impulsów w eksperymencie 15N R1ρ. (A-D) Wszystkie istotne parametry, które muszą zostać zmienione w protokole, są oznaczone czerwonymi polami i powiązanymi krokami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%206.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 7: Interfejs makra shapetool. I-BURP2 (używany w eksperymentach) jest otwierany jako impuls kształtowy. (A) Parametry wybranego impulsu kształtu. Klikając przycisk Rozpocznij symulację NMR oznaczony czerwonym polem, otworzą się okna parametrów symulacji z parametrami symulacji Długość impulsu kształtowego [μs] (= 2000 μs) i Kąt obrotu [°] (= 180°). Kliknięcie przycisku Start NMR-SIM otwiera okno symulacji (B), które pokazuje szerokość pasma inwersji impulsu I-BURP2. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%207.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 8: Interfejs makra calcpowlev. (A) Okno wprowadzania dla długości impulsu, którego moc ma być obliczona. (B) Okno wejściowe impulsu odniesienia (głównie impulsu twardego 90°). (C) Okno wyników pokazuje różnicę siły impulsu w dB między impulsem o nowej długości impulsu a impulsem o długości impulsu odniesienia. Uwaga: Ta różnica jest ważna tylko wtedy, gdy obie długości impulsów odpowiadają identycznemu impulsowi pod względem kształtu i kąta obrotu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%208.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 9: Przetwarzanie widm NMR: Interfejs narzędzia do konwersji NMRPipe. Kliknięcie przycisku Czytaj parametry powoduje automatyczne odczytanie parametrów eksperymentu. Skrypt konwersji jest pokazany po prawej stronie. Wszystkie parametry można ustawić indywidualnie. Po zmianie parametrów za pomocą Clear Script zalecana jest aktualizacjaskryptu. Kliknij Zapisz skrypt, aby zapisać skrypt pod fid.com, jak pokazano po prawej stronie. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%209.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 10: Plik nmrproc.com do przetwarzania spektralnego. Wyświetlany jest kod używany w pliku nmrproc.com do przetwarzania nieprzetworzonych danych w formacie NMRPipe. Wpis tauValues i wpis idxExpmt muszą być ustawione przed przetworzeniem. Wartości tau odpowiadają wpisom vplist w ms dla eksperymentu 15N R1ρ (wpisy vclist przeliczone w ms dla eksperymentu 15N R1). Jeśli chodzi o długość opóźnienia relaksacji, wpisy idxExpmt odpowiadają kolejności wpisów vplist (wpisy vclist dla eksperymentu 15N R1). W skrypcie pozycje do zmiany fazy widma są oznaczone czerwonymi polami. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2010.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 11: Wyświetlanie widm NMR i wybieranie pików. Pokazano przegląd nmrDraw z otwartym spektrum. Użyj + i -, aby zmienić współczynnik, który idzie w parze ze zmianą poziomu konturu. Zmiana wymiaru Z pozwala na przełączanie się między eksperymentem HSQC z różnymi opóźnieniami relaksacji. Użyj opcji Rysuj, aby ponownie narysować widmo ze zmienionymi parametrami. Suwak P0 i suwak P1 umożliwiają zmiany fazy widma. Te zmiany faz nie zostaną zapisane w przetwarzanych danych; Zmiana fazy musi zostać ręcznie wprowadzona do pliku nmrproc.com, a plik nmrproc.com musi zostać ponownie wykonany. Makro Peak Detection umożliwia wybranie pików widma na ustawionym poziomie konturu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2011.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 12: Półautomatyczne przypisywanie pików NMR za pomocą NMRDraw. Wyświetlany jest kod pliku ass.com, który należy wykonać, aby rozpocząć przypisywanie sygnału NMR. Zmień -assName na szczytową listę wygenerowanych zainteresowań. Ta lista szczytów musi być w tym samym formacie, co dołączona lista szczytów ass.syb2.hn_1200.tab w folderze peaklist (w folderze zip pobranym o https://www.ipb.hhu.de/en/teams/team-lakomek/pulsesequences). Czerwona liczba odnosi się do odpowiedniego kroku w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2012.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 13: Wizualna inspekcja piku NMR i przypisania. Interfejs makra przyporządkowania jest otwierany przez wykonanie ass.com. Użyj lewego przycisku myszy, aby przypisać szczyty, a prawego przycisku myszy, aby cofnąć przypisanie szczytów. Użyj Dalej, aby przejść do następnego aminokwasu i Poprzedni, aby przejść do poprzedniego aminokwasu. Za pomocą + i - poziom konturu można zmienić za pomocą funkcji Draw, która ponownie rysuje widmo. Korzystanie z przepływu pracy: Zakończ, Zapisz i Zakończ powoduje zapisanie przypisania i zakończenie programu. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2013.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 14: Wyodrębnianie stałych szybkości 15N R2 z danych R1ρ i R1. Krok 1. Zostanie wyświetlona zawartość pliku t1rho.tab. Kod oznaczony czerwoną ramką należy dodać przed obliczeniem stawek R2 na podstawie stawek R1ρ. Czerwona liczba odnosi się do odpowiedniego kroku w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2014.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 15: Wyodrębnianie stałych szybkości 15N R2 z danych R1ρ i R1. Krok 2. Zostanie wyświetlona zawartość pliku crtR1p.tcl. Przed wykonaniem wpisy w czerwonym polu muszą zostać zmienione zgodnie z opisem w protokole. Czerwone cyfry odnoszą się do odpowiednich kroków w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67088/Supplementary%20Rysunek%2015.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

Badamy dynamikę strukturalną białek za pomocą spektroskopii NMR, aby lepiej zrozumieć funkcję molekularną. NMR to skrót od angielskiej nazwy nuclear magnetic sonance spectroscopy, czyli spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego. Wykorzystuje efekt, że spiny jądrowe atomów wodoru mogą przechodzić między dwoma energetycznie różnymi stanami w polu elektromagnetycznym.Możemy użyć spektroskopii NMR do badania dynamiki strukturalnej wewnętrznie nieuporządkowanych białek. Białka te są bardzo elastyczne, stale zmieniają kształt i często składają się w stabilną strukturę tylko wtedy, gdy wchodzą w interakcję z innymi cząsteczkami. Używamy eksperymentów relaksacyjnych NMR, aby zbadać, w jaki sposób szkielet białkowy porusza się w bardzo krótkich skalach czasowych, od pikosekund do nanosekund, skupiając się na każdej konkretnej reszcie wzdłuż łańcucha białkowego.Ten protokół poprowadzi Cię krok po kroku przez konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR na spektrometrze NMR. Skierowany do naukowców posiadających podstawową wiedzę na temat NMR, zapewnia szybką i dokładną konfigurację oraz w przystępny sposób wprowadza kluczowe pojęcia z zakresu dynamiki szkieletu białek. Protokół ten sprawia, że sekwencje impulsów relaksacyjnych NMR są łatwo dostępne dla naukowców zajmujących się dynamiką białek.Eksperymenty relaksacyjne NMR dostarczają dynamicznych spostrzeżeń specyficznych dla pozostałości. Korzystając z tego eksperymentalnego podejścia, można lepiej zrozumieć dynamikę szkieletu białek, wpływ interakcji białko-białko na dynamikę strukturalną oraz zmiany strukturalne w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Aby rozpocząć, pobierz programy impulsowe NMR do katalogu na komputerze obsługującym spektrometr NMR i dostosuj wersję TopSpin.Pobierz impulsy w kształcie NMR do katalogu i sprawdź, czy wersja TopSpin jest odpowiednio zaktualizowana. Po określeniu szerokości spektralnych i odpowiednich czasów akwizycji, wpisz EDC w oprogramowaniu TopSpin do nowego katalogu, aby skopiować eksperyment HSQC. Aby otworzyć parametry sekwencji impulsów, wpisz ASED.Kliknij trzy kropki obok parametru prog puli, aby zmienić program impulsowy na eksperyment rzędu azotu 15R1. Kliknij dwukrotnie na program impulsowy, kliknij ustaw PULPROG na zestaw danych i potwierdź przyciskiem OK. Wpisz ASED, aby otworzyć parametry sekwencji impulsów. Wprowadź wszystkie brakujące siły i długości gradientu zgodnie z sekwencją impulsów.Następnie wprowadź dla licznika pętli L3 połowę wpisu azotu 15TD w oknie parametrów akwizycji. Wprowadź dla licznika pętli L6 liczbę zarejestrowanych punktów danych relaksacji w celu dopasowania krzywej relaksacji. Ustaw adiabatyczny impuls tanh/tan half NL jako kształt impulsu azotu 15-SP8.Następnie ustaw adiabatyczny półsekundowy impuls NL tanh/tan jako kształt impulsu azotu 15 SP9. Upewnij się, że długości impulsów są wystarczająco długie, aby zapewnić adiabatyczność przy P8 ustawionym na 3000 mikrosekund. Następnie ustaw opóźnienie odzyskiwania między skanami D1 na co najmniej dwie sekundy lub dłużej.Ustaw fikcyjne skany na co najmniej 64. Jako punkt wyjścia ustaw liczbę skanów na cztery i użyj wielokrotności czterech, jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski. Ustaw O1 na skalibrowaną częstotliwość nośną, O2P na 176 części na milion i skopiuj O3P z eksperymentu HSQC z azotem protonowym 15.Teraz ustaw długość impulsu P7 na skalibrowaną wcześniej długość impulsu 90 stopni. Następnie skopiuj poziom mocy impulsu 90 stopni do PLW3 i PLW7. Następnie ustaw długości impulsów P1 i P19 na długość impulsu protonowego 90 stopni.Ustaw liczbę przyrostów w wymiarze pośrednim TD równa się L6 przez dwa na L6. Następnie ustaw impuls kształtu SP5 na kształt I-BURP2, a długość impulsu P15 na 2000 mikrosekund. Następnie otwórz ekran narzędzia kształtu, klikając E obok impulsu w kształcie I-BURP2 w oknie parametrów sekwencji impulsów TopSpin. Aby zasymulować impuls kształtu, kliknij przycisk rozpocznij symulację NMR.Sprawdź ukształtowaną długość impulsu i kąt obrotu w oknie symulacji i kliknij uruchom NMR SIM, aby kontynuować. Sprawdź zakres wzbudzenia w symulacji i wybierz odpowiednią długość impulsu I-BURP2, aby pokryć dyspersję widmową protonów, unikając jednocześnie wzbudzenia wody. Ustaw P15 na ukształtowaną długość impulsu z okna symulacji z najlepszym impulsem I-BURP2.Teraz ustaw na regulację częstotliwości nośnej impulsu I-BURP2, przesuwając zakres wzbudzenia w lewo lub w prawo, aby uniknąć zakłóceń magnesowania wody. Następnie otwórz narzędzie Kształt Brukera i kliknij rozpocznij symulację NMR, aby określić odpowiedni poziom mocy kształtowanego impulsu. Ustaw długość impulsu I-BURP2 na długość impulsu kształtowego i zwróć uwagę na miękką prostokątną długość impulsu protonowego 90 stopni pokazaną w oknie symulacji.Wpisz CALPOWLEV, aby obliczyć różnicę poziomu mocy w decybelach między twardym impulsem protonowym 90 stopni a miękkim prostokątnym impulsem protonowym 90 stopni. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu protonowego 90 stopni do SPW5 i dostosuj, dodając zapamiętaną różnicę w decybelach. Aby określić poziom mocy wirowania, oblicz odpowiednią długość impulsu azotu 90 stopni 15.Użyj CALPOWLEV, aby obliczyć różnicę mocy w decybelach między mocą spin-lock a twardym impulsem azotu 90 stopni 15. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu azotu 90 stopni 15 do PLW7 i dostosuj poziom mocy spin-lock PLW8, dodając obliczoną różnicę mocy. Skopiuj poziom mocy spin-locka PLW8 do poziomów mocy SPW8 i SPW9.Aby określić poziom mocy odsprzęgania azotu 15, użyj CALPOWLEV do obliczenia różnicy mocy między mocą impulsu odsprzężenia azotu 15 o 90 stopniach a twardym impulsem azotu 15 o 90 stopniach. Skopiuj poziom mocy 90 stopni azotu 15 twardego impulsu PLW7 do poziomu mocy odsprzęgającej PLW31 i wyreguluj, dodając obliczoną różnicę mocy w decybelach. W celu kompensacji temperatury dołącz TEMP_ definiowania linii w programie impulsowym.Ustawić P18 na maksymalny czas trwania wirowania użytego w eksperymencie z rzędem azotu 15 R1. W przypadku próbek znakowanych azotem 15 węgiel 13 należy uwzględnić linię zdefiniowania LABEL_CN w programie impulsowym. Ustaw P4 na obliczoną długość impulsu.Użyj CALPALLEV, aby obliczyć różnicę mocy w decybelach między P4 a twardym impulsem węgla 13. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu węglowego 13 do PLW4 i dodaj obliczoną różnicę mocy w decybelach. Skopiuj PLW4 do PLW2.Aby określić odpowiednie opóźnienia relaksacji dla pobierania próbek, uruchom pierwsze osiem rozpadów swobodnej indukcji lub FID i przetwórz je. Wybierz pozycje na liście VP, w których szczytowa intensywność eksperymentu z najdłuższym opóźnieniem spada do co najmniej jednego powyżej E, ale nie mniej niż 25% w porównaniu z eksperymentem z najkrótszym opóźnieniem. Wpisz RGA w wierszu poleceń, aby określić wzmocnienie odbiornika.Rozpocznij przebieg testowy eksperymentu z rzędem azotu 15R1, wpisując ZG w wierszu polecenia. Sprawdź, czy sygnał wody jest stłumiony dla wszystkich opóźnień. Sprawdź również przyrost dziewiąty, drugi przyrost schematu wykrywania kwadraturowego.

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Celem tego protokołu jest wykorzystanie symulacji dynamiki molekularnej do zbadania dynamicznych zmian strukturalnych, które zachodzą w wyniku aktywacji mutacji białka kinazy EGFR.

Rozszyfrowywanie strukturalnych skutków aktywacji mutacji somatycznych EGFR za pomocą symulacji dynamiki molekularnej

Ten protokół pozwala na przygotowanie przekrojów nasion zbóż (np. ryżu) do analizy morfologii bielma i granulek skrobi za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Przekroje poprzeczne dojrzałego ryżu (Oryza sativa L.) Ziarna do obrazowania w skaningowej mikroskopii elektronowej z wykorzystaniem końcówek do pipet jako wspomagania immobilizacji

gP2S to aplikacja internetowa do śledzenia eksperymentów krioelektromagnetycznych. Opisano jego główne funkcje, a także kroki wymagane do zainstalowania i skonfigurowania aplikacji. Po skonfigurowaniu aplikacja pozwala na dokładne rejestrowanie metadanych związanych z eksperymentami z barwieniem ujemnym i krioEM.

gP2S, system zarządzania informacjami dla eksperymentów krioelektromagnetycznych

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Poznaj metodę NMR 15N do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy. Protokół umożliwia analizę dynamiki resztowej i zrozumienie funkcji molekularnych.

NMR ¹⁵N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Przeglądaj więcej filmów