NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy
1 listopada 2024
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.
Badamy dynamikę strukturalną białek za pomocą spektroskopii NMR, aby lepiej zrozumieć funkcję molekularną. NMR to skrót od angielskiej nazwy nuclear magnetic sonance spectroscopy, czyli spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego. Wykorzystuje efekt, że spiny jądrowe atomów wodoru mogą przechodzić między dwoma energetycznie różnymi stanami w polu elektromagnetycznym.
Możemy użyć spektroskopii NMR do badania dynamiki strukturalnej wewnętrznie nieuporządkowanych białek. Białka te są bardzo elastyczne, stale zmieniają kształt i często składają się w stabilną strukturę tylko wtedy, gdy wchodzą w interakcję z innymi cząsteczkami. Używamy eksperymentów relaksacyjnych NMR, aby zbadać, w jaki sposób szkielet białkowy porusza się w bardzo krótkich skalach czasowych, od pikosekund do nanosekund, skupiając się na każdej konkretnej reszcie wzdłuż łańcucha białkowego.
Ten protokół poprowadzi Cię krok po kroku przez konfigurację eksperymentów relaksacyjnych NMR na spektrometrze NMR. Skierowany do naukowców posiadających podstawową wiedzę na temat NMR, zapewnia szybką i dokładną konfigurację oraz w przystępny sposób wprowadza kluczowe pojęcia z zakresu dynamiki szkieletu białek. Protokół ten sprawia, że sekwencje impulsów relaksacyjnych NMR są łatwo dostępne dla naukowców zajmujących się dynamiką białek.
Eksperymenty relaksacyjne NMR dostarczają dynamicznych spostrzeżeń specyficznych dla pozostałości. Korzystając z tego eksperymentalnego podejścia, można lepiej zrozumieć dynamikę szkieletu białek, wpływ interakcji białko-białko na dynamikę strukturalną oraz zmiany strukturalne w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Aby rozpocząć, pobierz programy impulsowe NMR do katalogu na komputerze obsługującym spektrometr NMR i dostosuj wersję TopSpin.
Pobierz impulsy w kształcie NMR do katalogu i sprawdź, czy wersja TopSpin jest odpowiednio zaktualizowana. Po określeniu szerokości spektralnych i odpowiednich czasów akwizycji, wpisz EDC w oprogramowaniu TopSpin do nowego katalogu, aby skopiować eksperyment HSQC. Aby otworzyć parametry sekwencji impulsów, wpisz ASED.
Kliknij trzy kropki obok parametru prog puli, aby zmienić program impulsowy na eksperyment rzędu azotu 15R1. Kliknij dwukrotnie na program impulsowy, kliknij ustaw PULPROG na zestaw danych i potwierdź przyciskiem OK. Wpisz ASED, aby otworzyć parametry sekwencji impulsów. Wprowadź wszystkie brakujące siły i długości gradientu zgodnie z sekwencją impulsów.
Następnie wprowadź dla licznika pętli L3 połowę wpisu azotu 15TD w oknie parametrów akwizycji. Wprowadź dla licznika pętli L6 liczbę zarejestrowanych punktów danych relaksacji w celu dopasowania krzywej relaksacji. Ustaw adiabatyczny impuls tanh/tan half NL jako kształt impulsu azotu 15-SP8.
Następnie ustaw adiabatyczny półsekundowy impuls NL tanh/tan jako kształt impulsu azotu 15 SP9. Upewnij się, że długości impulsów są wystarczająco długie, aby zapewnić adiabatyczność przy P8 ustawionym na 3000 mikrosekund. Następnie ustaw opóźnienie odzyskiwania między skanami D1 na co najmniej dwie sekundy lub dłużej.
Ustaw fikcyjne skany na co najmniej 64. Jako punkt wyjścia ustaw liczbę skanów na cztery i użyj wielokrotności czterech, jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski. Ustaw O1 na skalibrowaną częstotliwość nośną, O2P na 176 części na milion i skopiuj O3P z eksperymentu HSQC z azotem protonowym 15
.Teraz ustaw długość impulsu P7 na skalibrowaną wcześniej długość impulsu 90 stopni. Następnie skopiuj poziom mocy impulsu 90 stopni do PLW3 i PLW7. Następnie ustaw długości impulsów P1 i P19 na długość impulsu protonowego 90 stopni.
Ustaw liczbę przyrostów w wymiarze pośrednim TD równa się L6 przez dwa na L6. Następnie ustaw impuls kształtu SP5 na kształt I-BURP2, a długość impulsu P15 na 2000 mikrosekund. Następnie otwórz ekran narzędzia kształtu, klikając E obok impulsu w kształcie I-BURP2 w oknie parametrów sekwencji impulsów TopSpin. Aby zasymulować impuls kształtu, kliknij przycisk rozpocznij symulację NMR.
Sprawdź ukształtowaną długość impulsu i kąt obrotu w oknie symulacji i kliknij uruchom NMR SIM, aby kontynuować. Sprawdź zakres wzbudzenia w symulacji i wybierz odpowiednią długość impulsu I-BURP2, aby pokryć dyspersję widmową protonów, unikając jednocześnie wzbudzenia wody. Ustaw P15 na ukształtowaną długość impulsu z okna symulacji z najlepszym impulsem I-BURP2.
Teraz ustaw na regulację częstotliwości nośnej impulsu I-BURP2, przesuwając zakres wzbudzenia w lewo lub w prawo, aby uniknąć zakłóceń magnesowania wody. Następnie otwórz narzędzie Kształt Brukera i kliknij rozpocznij symulację NMR, aby określić odpowiedni poziom mocy kształtowanego impulsu. Ustaw długość impulsu I-BURP2 na długość impulsu kształtowego i zwróć uwagę na miękką prostokątną długość impulsu protonowego 90 stopni pokazaną w oknie symulacji.
Wpisz CALPOWLEV, aby obliczyć różnicę poziomu mocy w decybelach między twardym impulsem protonowym 90 stopni a miękkim prostokątnym impulsem protonowym 90 stopni. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu protonowego 90 stopni do SPW5 i dostosuj, dodając zapamiętaną różnicę w decybelach. Aby określić poziom mocy wirowania, oblicz odpowiednią długość impulsu azotu 90 stopni 15.
Użyj CALPOWLEV, aby obliczyć różnicę mocy w decybelach między mocą spin-lock a twardym impulsem azotu 90 stopni 15. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu azotu 90 stopni 15 do PLW7 i dostosuj poziom mocy spin-lock PLW8, dodając obliczoną różnicę mocy. Skopiuj poziom mocy spin-locka PLW8 do poziomów mocy SPW8 i SPW9.
Aby określić poziom mocy odsprzęgania azotu 15, użyj CALPOWLEV do obliczenia różnicy mocy między mocą impulsu odsprzężenia azotu 15 o 90 stopniach a twardym impulsem azotu 15 o 90 stopniach. Skopiuj poziom mocy 90 stopni azotu 15 twardego impulsu PLW7 do poziomu mocy odsprzęgającej PLW31 i wyreguluj, dodając obliczoną różnicę mocy w decybelach. W celu kompensacji temperatury dołącz TEMP_ definiowania linii w programie impulsowym.
Ustawić P18 na maksymalny czas trwania wirowania użytego w eksperymencie z rzędem azotu 15 R1. W przypadku próbek znakowanych azotem 15 węgiel 13 należy uwzględnić linię zdefiniowania LABEL_CN w programie impulsowym. Ustaw P4 na obliczoną długość impulsu.
Użyj CALPALLEV, aby obliczyć różnicę mocy w decybelach między P4 a twardym impulsem węgla 13. Skopiuj poziom mocy twardego impulsu węglowego 13 do PLW4 i dodaj obliczoną różnicę mocy w decybelach. Skopiuj PLW4 do PLW2.
Aby określić odpowiednie opóźnienia relaksacji dla pobierania próbek, uruchom pierwsze osiem rozpadów swobodnej indukcji lub FID i przetwórz je. Wybierz pozycje na liście VP, w których szczytowa intensywność eksperymentu z najdłuższym opóźnieniem spada do co najmniej jednego powyżej E, ale nie mniej niż 25% w porównaniu z eksperymentem z najkrótszym opóźnieniem. Wpisz RGA w wierszu poleceń, aby określić wzmocnienie odbiornika.
Rozpocznij przebieg testowy eksperymentu z rzędem azotu 15R1, wpisując ZG w wierszu polecenia. Sprawdź, czy sygnał wody jest stłumiony dla wszystkich opóźnień. Sprawdź również przyrost dziewiąty, drugi przyrost schematu wykrywania kwadraturowego.
Przegląd
Ten artykuł dotyczy zastosowania spektroskopii rezonansowego magnetycznego jąder (NMR) do badania dynamiki strukturalnej białek. Koncentracja jest na zrozumieniu, jak białka o wewnętrznie nieuporządkowanej strukturze zachowują się na bardzo krótkich skalach czasowych, dostarczając wglądu w ich funkcje molekularne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia strukturalna
- Biofizyka
Tło
- Spektroskopia NMR charakteryzuje dynamikę strukturalną białek.
- Zezwala na analizę zachowań białek w szczegółach dotyczących poszczególnych resztek.
- Białka o wewnętrznie nieuporządkowanej strukturze są bardzo elastyczne i dynamiczne.
- Zrozumienie tej dynamiki jest kluczowe dla wyjaśnienia funkcji molekularnych.
Cel badania
- Zbadanie dynamiki strukturalnej białek za pomocą spektroskopii NMR.
- Dostarczenie protokołu eksperymentów relaksacyjnych NMR.
- Zwiększenie zrozumienia interakcji i stabilności białek.
Stosowane metody
- Eksperymenty relaksacyjne NMR 15N R1 i R2.
- Eksperymenty heteronuklearnego efektu Overhausera (hetNOE) {1H}-15N.
- Analiza ruchów szkieletu białka na skalach czasowych od pikosekund do nanosekund.
- Skupienie się na dynamice poszczególnych resztek wzdłuż łańcucha białka.
Główne wyniki
- Szczegółowe informacje o elastyczności białek o wewnętrznie nieuporządkowanej strukturze.
- Charakteryzacja dynamiki białek na krótkich skalach czasowych.
- Demonstracja skuteczności spektroskopii NMR w badaniu struktury białek.
- Dostarczony protokół przeprowadzania eksperymentów NMR.
Wnioski
- Spektroskopia NMR jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Zrozumienie dynamiki strukturalnej pomaga w rozszyfrowaniu funkcji molekularnych.
- Dostarczony protokół może ułatwić dalsze badania w tej dziedzinie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
NMR 15N relaxation experiments provide atomic-resolution insights into protein backbone dynamics on the picosecond to nanosecond timescale, directly informing early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. These measurements enable quantitative assessment of internal flexibility, supporting predictive confidence in protein function and stability across diverse molecular weights and structural classes. Integrating such dynamic data strengthens portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions for both globular and intrinsically disordered proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein backbone flexibility to clarify functional hypotheses.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing rigid from highly dynamic regions.
- Provides predictive confidence for target engagement and downstream assay development.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated protein systems with characterized dynamic profiles.
- Delivers quantitative relaxation parameters (R1, R2, hetNOE) for assay standardization and reproducibility.
- Enables robust screening of compounds targeting dynamic or disordered protein regions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns dynamic measurements with disease-relevant protein states, especially for IDPs and IDRs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by tracking structural flexibility.
- Reduces translational risk by providing atomic-level evidence of protein behavior under physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
NMR 15N relaxation experiments are positioned at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational dynamic data for both globular and intrinsically disordered proteins.
- Discovery Biology: Quantitative relaxation outputs clarify backbone mobility and inform target selection.
- Screening: Standardized dynamic profiles enable reproducible compound evaluation and assay transferability.
- Analytics: R1, R2, and hetNOE measurements support statistical comparison of protein states and conditions.
- Translational Research: Dynamic insights bridge discovery and preclinical studies, especially for flexible or disordered targets.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable across protein classes and molecular weights, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable dynamic measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of both structured and disordered protein targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy and protein sample preparation.
- Demands access to high-field NMR instrumentation and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of data acquisition and interpretation protocols.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and structural classes, including IDPs and IDRs.
- Practical limitations may include sample solubility, labeling efficiency, and instrument time allocation.
