Name: Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Poznaj neutralny test komety do wykrywania pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich. Ta metoda pozwala ocenić uszkodzenia DNA podczas replikacji i stresu replikacyjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Dungrawala za ich wkład i opinie. Ta praca została sfinansowana z grantu NIH R35GM137800 dla HD.

Ten protokół (Rysunek 1) wykorzystuje głównie przylegające linie komórek rakowych U2OS, ale można go dostosować do szerokiej gamy komórek przylegających i zawiesinowych hodowanych w hodowli tkankowej. Roztwory i użyte w tym badaniu przedstawiono w tabeli 1. Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przed dniem eksperymentu umieść dostarczoną butelkę z niskotopliwą agarozą (1% niskotopliwej agarozy w PBS) w gorącej kąpieli wodnej na 5-10 minut, aby upewnić się, że agaroza całkowicie się rozpuściła. 
	UWAGA: Nie podgrzewaj butelki w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Po stopieniu szybko przesypać 100 μl agarozy do 1,5 ml probówek wirówkowych w zależności od potrzeb i przechowywać probówki w temperaturze 4 °C. Zestaloną agarozę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>W dniu doświadczenia wyjąć wymaganą liczbę probówek wirówkowych z magazynu w temperaturze 4 °C. Rozpuść agarozę, umieszczając probówki w bloku grzewczym lub łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. 
	UWAGA: Umieść probówki w temperaturze 42 °C przed pobraniem komórek, aby upewnić się, że agaroza jest całkowicie stopiona do ponownego zawieszenia (krok 3.7).</li>
	<li>Przygotować świeży bufor do lizy i bufor TAE w dniu doświadczenia i przechowywać je odpowiednio w temperaturze pokojowej i 4 °C do czasu przygotowania do użycia. Ponadto rozmieścić 1x PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i umieścić w lodówce do użycia na etapie ponownego zawieszenia (krok 3.5).</li>
	<li>Zaznacz identyfikatory próbek na oszronionym końcu 2-dołkowych szkiełek kometarnych i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą gotowe do użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przed dniem doświadczenia należy wysiać komórki w 6-dołkowym naczyniu i hodować je przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . W przypadku komórek U2OS wysiewano około 2-3 x 105 komórek dla każdej próbki. 
	UWAGA: Numery komórek mogą wymagać dostosowania w zależności od typu komórki używanej do analiz.</li>
	<li>W dniu eksperymentu należy potraktować komórki warunkami zgodnymi z projektem eksperymentalnym. Jako kontrolę pozytywną, aby wykazać indukcję przerwania zależną od replikacji, potraktuj komórki 1 μM CPT przez 1 godzinę. CPT jest inhibitorem topoizomerazy-1, który indukuje pęknięcia dwuniciowe w sposób zależny od replikacji14.</li>
</ol>
3. Zawieszenie i liza komórek
<ol>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i dwukrotnie przepłukać 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 300 μl trypsyny do każdej studzienki. Inkubować naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2-3 minuty 
	UWAGA: Długotrwała inkubacja w trypsynie może generować fałszywe wyniki podczas analiz komet.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 700 μl pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie zawiesić i przenieść próbki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Zliczanie komórek na tym etapie jest zalecane w celu uzyskania odpowiedniej gęstości komórek w kroku 3.6, aby zmniejszyć częstotliwość nakładania się ogonów podczas analizy.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 3.4 i krok 3.5 dwa razy i ponownie zawieś komórki w zimnym 1x PBS przy gęstości komórek 2 x 105 komórek na ml. 
	UWAGA: Zaleca się ocenę żywotności komórek na tym etapie, aby upewnić się, że obecna jest odpowiednia liczba żywotnych komórek. Zalecana jest co najmniej 90% żywotność.</li>
	<li>Zawiesić ponownie 10 μl zawiesiny komórek w 100 μl podwielokrotności stopionej agarozy i za pomocą tej samej końcówki pipety delikatnie wymieszać i równomiernie rozprowadzić mieszaninę w jednym dołku szkiełka. W razie potrzeby powtórz ten krok dla wszystkich próbek. 
	UWAGA: Unikać natychmiastowego usuwania wszystkich podwielokrotności z łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Zaleca się, aby ten etap był wykonywany w łaźni wodnej, a każda próbka jest ponownie zawieszana i rozprowadzana w sposób rozłożony w czasie. Unikaj wprowadzania pęcherzyków podczas rozprowadzania agarozy na szkiełku, ponieważ kieszenie powietrzne wpłyną na migrację warkoczy komet podczas elektroforezy (krok 4.5) i wprowadzą pęknięcia na etapie suszenia (krok 5.3)</li>
	<li>Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C w ciemności przez 15-20 minut, aby upewnić się, że agaroza całkowicie zastygła (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść szkiełka w słoikach Coplin i zanurz je w buforze do lizy na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Jednokrotnie przepłukać szkiełka zimnym buforem TAE i zanurzyć je w zimnym buforze TAE na 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Elektroforeza
<ol>
	<li>Ustaw komorę elektroforetyczną na płaskiej powierzchni i wypoziomuj system za pomocą czterech pokręteł poziomujących na krawędziach aparatu. Włóż zimne okłady do dolnej komory, aby roztwór był zimny podczas elektroforezy.</li>
	<li>Wlej około ~850 ml zimnego buforu 1x TAE do aparatu.</li>
	<li>Wyjąć szkiełka z temperatury 4 °C i umieścić je na tacy do elektroforezy we właściwej orientacji, aby umożliwić migrację uszkodzonego DNA. 
	UWAGA: Taca mieści dziesięć szkiełek 2-dołkowych. Umieść szkiełka na środku tacy, jeśli pracujesz z mniejszą liczbą próbek. Jeśli pracujesz z nieparzystą liczbą slajdów, dołącz pusty slajd, tak aby każde dołek mieścił 2 slajdy.</li>
	<li>Delikatnie umieść dostarczoną nakładkę tacy na suwaki na górze tacy, aby zakryć szkiełka. 
	UWAGA: Dla poprawnego działania aparatu, objętość bufora TAE nie powinna być mniejsza niż dolna powierzchnia nakładki i nie powinna przekraczać górnej powierzchni nakładki.</li>
	<li>Po podłączeniu przewodów należy ustawić zasilanie na 21 V i wykonać elektroforezę (1 V/cm) przez 40 min. 
	UWAGA: Czas elektroforezy może wymagać dostosowania w zależności od typu ogniwa używanego do analiz. Długie ogony w próbkach niepoddanych działaniu substancji wskazują na zbyt długi czas pracy. I odwrotnie, krótkie ogony w próbkach kontroli dodatniej mogą odzwierciedlać niewystarczający czas pracy.</li>
</ol>
5. Barwienie
<ol>
	<li>Po zakończeniu elektroforezy należy wyjąć szkiełka z aparatu i zanurzyć je w roztworze wytrącającym DNA na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór do wytrącania DNA i zanurz szkiełka w 70% roztworze etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć 70% roztwór etanolu. Wyjmij szkiełka i wysusz je w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 45 °C przez 30 minut w ciemności (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Szkiełka można pozostawić na noc w ciemnym, suchym miejscu do etapu suszenia.</li>
	<li>Inkubować studzienki ze 100 μl 1x SYBR Green roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Zdekantować roztwór SYBR Green, przechylając szkiełka i usuwając nadmiar, delikatnie przecierając krawędź studzienki niestrzępiącą się chusteczką.</li>
	<li>Umieść szkiełka w szufladzie i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie slajdów.</li>
</ol>
6. Obrazowanie i analizy
<ol>
	<li>Ustaw mikroskop do celów obrazowania. 
	UWAGA: Wszystkie obrazy zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego. Zastosowano 10-krotne powiększenie z aperturą numeryczną 0,45 z czasem naświetlania 1/40s i wzmocnieniem +6dB. Wykorzystano tryb przechwytywania monochromatycznego 8-bitowego z binningiem 2 x 2 i korekcją balansu czerni.</li>
	<li>Umieść szkiełka na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie za pomocą filtra FITC. 
	UWAGA: Najpierw użyj niepoddanej działaniu substancji próbki, aby przetestować czas ekspozycji. Większość komórek nie wykazuje warkoczy komet, ponieważ DNA jest bardziej zwarte. Przełącz się na studzienkę z komórkami poddanymi działaniu CPT i zobrazuj przy użyciu tego samego czasu ekspozycji. Warkocze komety o zwiększonej długości będą obserwowane w tej próbce ze względu na migrację uszkodzonych końców DNA.</li>
	<li>Uzyskanie obrazów dla co najmniej 100 komet z próbki przy użyciu tego samego czasu naświetlania w trzech kontrpróbach technicznych. 
	UWAGA: Warkocze komet na końcach szkiełek nakrywkowych mają tendencję do nierównomiernej migracji i działają jako wartości odstające w rozkładzie próby. Większość komet uchwyconych do analiz znajduje się blisko środka szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3).</li>
	<li>Eksportuj obrazy i oceniaj komety ręcznie (za pomocą Obrazu J) lub za pomocą bezpłatnego oprogramowania do oceny komet. Komety, które są indywidualnie rozróżnialne i w pełni zawarte w polu widzenia, są wybierane do punktacji. Nakładające się na siebie lub częściowo widoczne komety nie są brane pod uwagę w dalszych analizach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Użytkownicy mogą oceniać komety na obrazie J za pomocą następującej wtyczki: https://cometbio.org/index.html. Szczegółowe informacje na temat oceny komet za pomocą oprogramowania CometScore znajdują się w Rysunek 5.</li>
	<li>Wykreśl momenty końcowe uzyskane z analiz jako wykresy pudełkowe i wąsy przedstawiające wartości 10-90 percentyla. Wykonaj testy normalności, aby określić, czy do analiz statystycznych należy stosować testy parametryczne czy nieparametryczne. 
	UWAGA: W większości przypadków testy nieparametryczne stosuje się przy użyciu testu Manna-Whitneya w przypadku porównywania tylko dwóch próbek lub testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna w przypadku porównywania trzech lub więcej prób.</li>
</ol>

Investigating the Extent of DNA Breaks Occurring During DNA Replication 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten przedstawia test NC do oceny pęknięć DNA w komórkach ludzkich poddawanych aktywnej replikacji. Protokół jest stosunkowo prosty do wykonania, a naukowcy mogą go łatwo dostosować do warunków wysokiego pH do analiz alkalicznych8. Obejmuje on dwa krytyczne kroki, zgodnie z opisem w krokach 3.7 i 4.5. W kroku 3.7 konieczne jest równomierne rozprowadzenie stopionej agarozy wraz z komórkami w poprzek studni, aby zapobiec nakładaniu się komet podczas analizy. Upewnij się, że agregaty komórkowe zostały rozpuszczone przed ponownym zawieszeniem komórek w agarozie. Zapobieganie uwalnianiu się końcówki pipety podczas rozprowadzania agarozy pomoże zminimalizować wprowadzanie pęcherzyków. Warunki do elektroforezy są kluczowe dla osiągnięcia odpowiedniej migracji warkocza komety do obrazowania i analizy. Badacze powinni wziąć pod uwagę naturę linii komórkowych użytych do analizy, ponieważ zakres migracji ogona i odsetek komórek wykazujących warkocze komety różnią się w zależności od typu komórek (ryc. 9). Dlatego zaleca się empiryczne określenie czasu trwania elektroforezy przed eksperymentowaniem.
Jeżeli w próbkach kontroli pozytywnej (komórki poddane działaniu CPT) nie zaobserwuje się warkoczy komety, skuteczność leku należy potwierdzić równolegle przy użyciu alternatywnych metod, takich jak barwienie immunologiczne markera uszkodzenia DNA γH2AX. Ekstensywna migracja ogona może uniemożliwić analizę indukcji zerwania. Zminimalizowanie czasu elektroforezy i ocena morfologii komórki przed analizą może zapobiec uzyskaniu zbyt długich warkoczy komet. Niedostateczne wysuszenie szkiełek może skutkować rozmytymi i zamglonymi obrazami komet. Upewnij się, że agaroza na szkiełku komety jest równomiernie wysuszona i spłaszczona przed zabarwieniem 1x roztworem SYBR. Jeśli zakres indukcji krotności jest wąski, wykonanie krzywej dawka-odpowiedź za pomocą CPT może pomóc w określeniu optymalnego zakresu roboczego do celów eksperymentalnych. Zastosowanie tych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów pomoże zmaksymalizować wyniki tych testów.
Ta metodologia testu jest opłacalna i bardzo czuła w porównaniu z innymi technikami stosowanymi do badania indukcji pękania DNA, takimi jak test Halo29,30, test TUNEL31 i elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym32. Obecna technika oznaczania ma jednak pewne ograniczenia. Nie podaje dokładnej liczby uszkodzeń DNA, ale oferuje względne oszacowanie akumulacji pęknięć w porównaniu z komórkami nieuszkodzonymi. Ponadto nie może ocenić indukcji przerwania, która zachodzi w sposób zależny od cyklu komórkowego. Aby wykluczyć zmiany w indukcji pęknięć spowodowane różnicami w progresji cyklu komórkowego, analizy cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej powinny być wykonywane równolegle.

Test kometa to metoda elektroforezy żelowej używana do wykrywania pęknięć DNA na poziomie pojedynczej komórki. Opiera się na zasadzie, że otwarte pęknięcia DNA migrują w warunkach elektroforetycznych, podczas gdy nienaruszone DNA pozostaje w dużej mierze statyczne. Uszkodzone DNA migruje, ponieważ pęknięcia powodują relaksację superskręconego DNA, powodując jego stopniowe przestrzenne przemieszczenie w kierunku anody w komorze elektroforetycznej, co skutkuje wyglądem podobnym do komety obserwowanym przez immunofluorescencję1,2. Zakres uszkodzenia DNA jest następnie mierzony poprzez ilościowe określenie ilości uszkodzonego DNA, które migrowało w stosunku do zwartego DNA.
Dwie najczęściej używane metody testowania komet to test komet alkalicznych (AC) i test neutralnych komet (NC). Test AC przeprowadza się w warunkach denaturacji przy użyciu roztworu o wysokim zasadowym pH, podczas gdy test NC przeprowadza się w roztworze o neutralnym pH. Zarówno testy NC, jak i AC mogą niezawodnie wykrywać pęknięcia DNA, które występują w jądrze. Jednak wersja alkaliczna jest również korzystna do wykrywania miejsc nieporażnych alkalicznie3. Oba formaty testu wymagają zastosowania warunków lizy w celu zapewnienia, że DNA jest wolne od białek przed elektroforezą.
Ten test jest prostą metodą wykrywania pęknięć DNA i oferuje kilka unikalnych zalet do określania uszkodzeń DNA komórkowego. Metoda jest stosunkowo łatwa do skonfigurowania i wymaga odczynników, które można przygotować w laboratorium lub zakupić od komercyjnych dostawców. Jako technika rozdzielczości pojedynczej komórki, test wymaga bardzo małej ilości materiału wyjściowego. Warto zauważyć, że test NC może mierzyć przerwy z wysoką czułością, według doniesień wykrywa od 50 do 10 000 pęknięć na komórkę4. O wszechstronności tej techniki świadczy szeroki zakres jej zastosowań, w tym ekotoksykologia5, biomonitoring ludzi6 oraz badania genotoksyczności7. Test może być również niezawodnie stosowany w różnych typach komórek i dostosowany do testów o wysokiej przepustowości8 oraz do oceny pęknięć w określonych regionach genomu9. W związku z tym test ten służy jako szybka i niezawodna technika badania powstawania pęknięć na poziomie pojedynczej komórki.
Proces replikacji DNA jest nieustannie kwestionowany przez kilka endogennych i egzogennych czynników stresogennych10,11. Zatrzymanie replikosomów z powodu takich zmian może powodować pęknięcia DNA i skutkować zwiększoną niestabilnością genomu. Pęknięcia DNA często pojawiają się również jako produkty pośrednie replikacji, aby ułatwić naprawę DNA12. Ponadto kilka chemioterapeutyków indukuje zależne od replikacji dwuniciowe pęknięcia (DSB), takie jak kamptotecyna (CPT)13,14,15i inhibitory PARP16,17. W związku z tym test ten służy jako potężna metodologia do badania natury zmian DNA, oceny przetwarzania widełek replikacyjnych i badania potencjału terapeutycznego czynników uszkadzających DNA. Adaptacje testu, które obejmują znakowanie nowo zsyntetyzowanego DNA za pomocą BrdU, były przydatne do badania fenotypów stresu związanego z replikacją18,19,20,21. Warto zauważyć, że test NC jest wiarygodną metodą badania indukcji pękania DNA w kontekście replikacji, jak wykazano w badaniach obejmujących charakterystykę białek widelc22,23, analiza produktów pośrednich replikacji24,25, oraz badanie konfliktów transkrypcji-replikacji w utrzymaniu genomu26,27. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół testu NC w celu ilościowego określenia pęknięć DNA podczas replikacji w komórkach ludzkich. Protokół ten może być łatwo wdrożony przez naukowców zainteresowanych oceną uszkodzeń związanych ze stresem replikacyjnym w szerokiej gamie dzielących się komórek ludzkich.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R& Systemy D</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy CometAssay II</td><td>R& Systemy D</td><td>4250-050-ES</td><td>Zawiera zbiornik do elektroforezy, pokrywę bezpieczeństwa,, tacki na suwaki 2/20 dołków i nakładkę na tacę ślizgową</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CometScore</td><td>TriTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& Systemy D</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td>Mikroskop epifluorescencyjny <td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Komórki hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksymocznik</td><td>Milipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna płytka do hodowli tkankowej poddana obróbce powierzchniowej</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS komórki</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; Inkubator hybrydyzacji HB-1000</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie pęknięć dna w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

Replikacja DNA jest nieustannie kwestionowana przez szeroką gamę endogennych i egzogennych stresorów, które mogą uszkadzać DNA. Takie zmiany napotkane podczas duplikacji genomu mogą zatrzymać replikosomy i przekształcić widełki replikacyjne w pęknięcia dwuniciowe. Jeśli nie zostaną naprawione, te toksyczne pęknięcia DNA mogą wywołać rearanżacje chromosomów, prowadząc do zwiększonej niestabilności genomu i zwiększonego prawdopodobieństwa transformacji komórkowej. Ponadto komórki nowotworowe wykazują utrzymujący się stres replikacyjny, co sprawia, że celowanie w podatności widełek replikacyjnych w komórkach nowotworowych jest atrakcyjną strategią chemioterapii. Wysoce wszechstronną i potężną techniką badania pęknięć DNA podczas replikacji jest test kometowy. Ta technika elektroforezy żelowej niezawodnie wykrywa indukcję i naprawę pęknięć DNA na poziomie pojedynczej komórki. W niniejszym artykule przedstawiono protokół, który pozwala badaczom zmierzyć zakres uszkodzeń DNA w mitotycznie dzielących się komórkach ludzkich przy użyciu środków zatrzymujących widełki w wielu typach komórek. Połączenie tego z automatyczną oceną komet ułatwia szybką analizę i zwiększa wiarygodność w badaniu indukcji pęknięć DNA.

Analiza indukcji pęknięć przez odczynniki wywołujące stres replikacyjny 
Komórki U2OS traktowano DMSO, 4 mM hydroksymocznikiem (HU) lub 100 nM CPT przez 4 h, a następnie przeanalizowano akumulację pęknięć za pomocą testu NC (Rycina 6A). Podczas gdy CPT indukuje pęknięcia w fazie S poprzez blokowanie topoizomerazy 113, wywołane przez HU wyczerpanie pul nucleotide'ów powoduje zatrzymanie widełek replikacyjnych, które są stopniowo przekształcane w DSB28. Dane wskazują, że ekspozycja na HU lub CPT wyzwala indukcję pęknięć w fazie S, co jest wykrywalne za pomocą testu NC.
Analiza indukcji pęknięć z porównaniem lizy w różnych temperaturach 
Nieleczone komórki U2OS inkubowano w buforze do lizy w temperaturze pokojowej (RT) lub w 4 °C przed analizą indukcji pęknięć (Ryc. 6B). Wyniki wskazują, że temperatura, w której przeprowadzana jest liza, ma minimalny wpływ na migrację ogonów w teście.
Analiza czasowa pęknięć wywołanych hydroksymocznikiem (HU) 
Komórki U2OS pozostawiono bez obróbki lub poddano działaniu 4 mM HU przez 4 h i 8 h przed analizą indukcji pęknięć za pomocą testu NC (Rysunek 7). Wyniki wskazują, że przedłużone zatrzymanie widełek replikacyjnych przez HU powoduje ich zapadnięcie się i powstanie DSBs.
Analiza zależna od dawki pęknięć wywołanych kamptotecyną 
Komórki U2OS traktowano zwiększającymi się dawkami CPT przez 1 h, a następnie zebrano w celu analizy pęknięć z wykorzystaniem testu NC (Rysunek 8). Podczas gdy akumulacja pęknięć w komórkach nietraktowanych CPT jest minimalna, stopień indukcji pęknięć stopniowo wzrasta wraz ze zwiększeniem dawki CPT, co demonstruje użyteczność tego testu w badaniu efektów zależnych od dawki w zakresie akumulacji pęknięć podczas replikacji DNA.
Analiza porównawcza pęknięć w wielu typach komórek 
Bazowe poziomy pęknięć DNA oceniono w trzech rozbieżnych typach komórek mitotycznych: unieśmiertelnionych komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki hTERT (hTERT-RPE-1), ludzkich komórkach embrionalnej nerki wykazujących ekspresję dużego antygenu T wirusa SV40 (HEK293T) oraz komórkach osteosarkoma kości (U2OS) (Rysunek 9). Każda linia komórkowa wykazała zróżnicowaną migrację momentów ogona w warunkach braku dodanego stresu replikacyjnego, co może wynikać z różnic w rozkładzie cyklu komórkowego, organizacji chromatyny lub liczby aktywnych widełek replikacyjnych. Każdy typ komórek został również poddany działaniu 1 µM CPT przez 1 h w celu potwierdzenia wzrostu liczby zależnych od replikacji pęknięć DNA.
Analiza indukcji pęknięć metodą AC 
Komórki U2OS poddano działaniu DMSO, 4 mM HU, 1 µM CPT lub 10 µM inhibitora PARP (PARPi) Olaparib, a następnie przeanalizowano indukcję pęknięć (Rycina 10). Komórki inkubowano z DMSO, HU i PARPi przez 2 h, natomiast z CPT przez 1 h. Wyniki wskazują, że narażenie na stres replikacyjny powoduje akumulację pęknięć, co jest możliwe do zaobserwowania za pomocą metody AC.
<img alt="Schemat procesu testu kometowego; od hodowli komórek do elektroforezy; etapy oceny uszkodzeń DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg testu NC. (A) Wymagana liczba komórek jest wysiewana dzień wcześniej do płytki 6-dołkowej. (B) Po traktowaniu lekami komórki są trypsynizowane i zbierane do zimnego PBS. (C) Komórki są delikatnie resuspendowane w stopionej agarozie w stosunku 10:1 (10 µL agarozy na 1 µL zawiesiny komórkowej) za pomocą końcówki pipety. (D) Zawiesina komórkowa jest przenoszona do dołka na szkiełku za pomocą końcówki pipety i rozprowadzana równomiernie, aby całkowicie pokryć powierzchnię dołka agarozą. (E) Po inkubacji w 4 °C szkiełka są zanurzane w buforze lizującym, a następnie w zimnym buforze 1x TAE. (F) Próbki są poddawane elektroforezie przy użyciu odpowiedniej aparatury. (G) Następnie szkiełka są zanurzane w roztworze do precypitacji DNA, a potem w 70% roztworze etanolu. (H) Po wysuszeniu dołki są barwione roztworem 1x SYBR Green. (I) Szkiełka są obrazowane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy w żelu agarozowym: widok z boku procesu od zestalania do suszenia, układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Widok z boku agarozy w dołkach szkiełka do testu komet. (A) Po inkubacji w 4 °C (krok 3.8) zestalona agaroza ma postać „bąbelka” o wypukłym kształcie. (B) Po suszeniu w 45 °C (krok 5.3) agaroza w dołku wydaje się spłaszczona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy w testcie komet podkreślający migrację DNA i technikę losowego próbkowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie i analiza komet. (A) Do analizy wybierane są komety znajdujące się w obrębie wewnętrznego okręgu dołka (zaznaczone na niebiesko). Komety położone bliżej zewnętrznej krawędzi dołka są wykluczane ze względu na nietypowo dłuższe momenty ogonów, co klasyfikuje je jako wartości odstające. (B) Z obszaru zaznaczonego kolorem niebieskim losowo wybiera się co najmniej 100 reprezentatywnych komet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat testu kometowego; analiza uszkodzeń DNA, mikroskopia fluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny obraz komet uzyskany w analizie NC. Prawy panel przedstawia reprezentatywne pole widzenia dla jąder barwionych SYBR Green, natomiast lewy panel zaznacza obszar (zielona obwódka) wykorzystany do oceny komet. Jądra widoczne częściowo lub nałożone na siebie (czerwona obwódka, prawy panel) nie są wliczane do analizy. Komety wybrane do oceny powinny być od siebie wyraźnie odróżnialne, w całości mieścić się w polu widzenia i wykazywać jednorodną intensywność barwienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu testu kometowego z analizą programową w celu oceny uszkodzeń DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywna ocena komet uzyskanych w badaniu NC. (A) Pojedyncze jądra są obrysowane przy użyciu oprogramowania CometScore. (B) Aktywowano widok pełnego spektrum (lewy panel), a próg (pasek odcięcia) został dostrojony w celu uzyskania optymalnej intensywności sygnału przy minimalnym tle. Sygnał „pełnego spektrum” powinien odpowiadać obrazowi „pojedynczej barwy” (górny obraz, prawy panel) i nie może wykraczać poza obrys (dolny obraz, prawy panel). (C) Pionowa żółta linia w ramce jest wyrównana do środka głowy komety, przyjmując najszerszą część głowy komety jako punkt odniesienia dla zapewnienia spójności. (D) Wynik dla każdej analizowanej komety jest podany w prawym górnym rogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy momentu ogona dla komórek U2OS, test uszkodzeń DNA, wartości p dla porównania warunków DMSO, CPT, HU, RT, 4°C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza indukcji pęknięć przez odczynniki wywołujące stres replikacyjny. (A) Komórki U2OS poddano działaniu DMSO, 100 nM kamptotecyny (CPT) lub 4 mM hydroksymocznika (HU) przed analizą indukcji pęknięć. Reprezentatywny wykres pokazuje zwiększoną akumulację pęknięć w komórkach traktowanych CPT lub HU. (B) Nieleczone komórki U2OS wysiano na szkiełka do elektroforezy kometowej i inkubowano w celu lizy (krok 3.9) w temperaturze pokojowej (RT) lub 4 °C, aby porównać wpływ temperatury lizy. Momenty ogona z analiz przedstawiono na wykresach pudełkowych obrazujących wartości od 10. do 90. percentyla, gdzie mediany są reprezentowane przez poziome linie wewnątrz pudełek. Wartości P obliczono przy użyciu testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna (próg istotności p = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy ilustrujący uszkodzenia DNA w komórkach U2OS; moment ogona w zależności od czasu ekspozycji na HU, analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Analiza czasowa pęknięć wywołanych hydroksymocznikiem. Komórki U2OS pozostawiono nieleczone lub traktowano 4 mM HU przez 4 h lub 8 h przed analizą indukcji pęknięć. Reprezentatywny wykres przedstawia stopniowy wzrost akumulacji pęknięć w komórkach traktowanych HU. Momenty ogona z analiz przedstawiono na wykresach pudełkowych obrazujących wartości z 10. do 90. percentyla, przy czym wartości mediany zaznaczono poziomymi liniami wewnątrz pudełek. Wartości P obliczono za pomocą testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna (próg istotności p = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy analizy momentu ogona, komórki U2OS traktowane CPT; zależne od dawki uszkodzenia DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Analiza zależna od dawki pęknięć wywołanych kamptotecyną. Komórki U2OS traktowano DMSO lub zwiększającymi się stężeniami CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM i 1 µM) przez 1 h przed analizą pęknięć. Momenty ogona z analiz przedstawiono na wykresach pudełkowych obrazujących wartości percentylowe 10–90, gdzie wartości mediany są reprezentowane przez poziome linie wewnątrz pudełek. Reprezentatywny wykres pokazuje zależny od dawki wzrost liczby pęknięć wywołanych przez CPT. Wartości P obliczono za pomocą testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna (próg wartości p wynoszący 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy wyników testu kometowego, analiza uszkodzeń DNA, porównanie traktowania DMSO i CPT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Analiza porównawcza pęknięć w wielu typach komórek. Komórki hTERT-RPE-1, HEK293T oraz U2OS traktowano DMSO lub 1 µM CPT przez 1 h. Reprezentatywny wykres przedstawia względny zakres uszkodzeń DNA w trzech typach komórek w obecności lub przy braku CPT. Momenty ogona z analiz przedstawiono na wykresach pudełkowych obrazujących wartości od 10. do 90. percentyla, przy czym wartości mediany zaznaczono poziomymi liniami wewnątrz pudełek. Wartości P obliczono za pomocą testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna (próg istotności p = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres pudełkowy przedstawiający uszkodzenia DNA w komórkach U2OS pod wpływem różnych czynników; zawarto analizę statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Analiza indukcji pęknięć za pomocą testu AC. Komórki U2OS przed analizą indukcji pęknięć poddano działaniu DMSO, 4 mM HU, 1 µM CPT lub 10 µM inhibitora PARP Olaparib. Komórki traktowano DMSO, HU oraz inhibitorem PARP przez 2 h, natomiast CPT przez 1 h. Reprezentatywny wykres wykazuje zwiększoną akumulację pęknięć w komórkach traktowanych CPT, HU lub inhibitorami PARP. Momenty ogonów z analiz przedstawiono na wykresach pudełkowych z wąsami, obrazujących wartości od 10. do 90. percentyla, przy czym wartości mediany zaznaczono poziomymi liniami wewnątrz pudełek. Wartości P obliczono za pomocą testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna (próg istotności p = 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Roztwór roboczy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do lizy</td>
			<td>0,5% SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor TAE 1x</td>
			<td>40 mM Tris (zasada), 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8,45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roztwór do precypitacji DNA</td>
			<td>1 M octan amonu, 87% etanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% roztwór etanolu</td>
			<td>70% etanol w wodzie destylowanej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x roztwór SYBR Green</td>
			<td>1x SYBR Green w buforze 1x TAE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka hodowlana DMEM</td>
			<td>DMEM z 7,5% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka hodowlana DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 z 7,5% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do rozwijania alkalicznego (do zastosowania w alkalicznym teście kometowym)</td>
			<td>200 mM NaOH, 1 mM EDTA w pH&gt;13</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista buforów i roztworów.

Ten protokół jest przeznaczony do badania zakresu uszkodzeń DNA występujących podczas replikacji DNA. W neutralnych warunkach indukcję pęknięć DNA można łatwo ocenić w krótkim czasie. Dodatkowo protokół można dostosować do innych typów komórek i różnych odczynników stresu replikacyjnego.

Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

Głównym celem naszego laboratorium jest badanie mechanizmów sprzyjających duplikacji genomu w komórkach ludzkich. Nasz projekt koncentruje się na zrozumieniu, w jaki sposób remodelery chromatyny działają na widełkach replikacyjnych, aby promować syntezę DNA. Widły przechodzą wiele zdarzeń przetwarzania, gdy są narażone na stres związany z replikacją.Zdarzenia te powodują powstawanie produktów pośrednich replikacji, które mogą przekształcić się w toksyczne przerwy, jeśli nie zostaną naprawione. Ostatnie badania pokazują, że obecność jednoniciowych luk w powstającym DNA może powodować niestabilność genomu i jest wyznacznikiem wrażliwości na chemioterapię. Nasza praca dotyczy roli konserwatywnego remodelera nukleosomów, SNF2L, w syntezie DNA.SNF2L podróżuje z widełkami replikacyjnymi, ale mechanizm działania jest słabo scharakteryzowany. Korzystanie z protokołu testu komety pozwala nam ocenić konsekwencje dla stabilności wideł, gdy SNF2L jest nieobecny.

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Tutaj opisujemy dwie modyfikacje testu włókien DNA w celu zbadania jednoniciowych luk w DNA podczas replikacji DNA po indukcji zmiany. Test włókien S1 umożliwia wykrycie luk poreplikacyjnych za pomocą endonukleazy S1 specyficznej dla ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk umożliwia wizualizację i ilościowe określenie naprawy luki.

Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Prezentujemy montaż i zastosowanie urządzenia w skali molekularnej zasilanego białkiem topoizomerazą. Konstrukcja ta stanowi biomolekularny czujnik, który znakuje dwa główne rodzaje pęknięć DNA w przekrojach tkanek poprzez przyłączenie dwóch różnych fluoroforów do ich końców.

In vitro montaż półsztucznej maszyny molekularnej i jej zastosowanie w detekcji uszkodzeń DNA

Poznaj neutralny test komety do wykrywania pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich. Ta metoda pozwala ocenić uszkodzenia DNA podczas replikacji i stresu replikacyjnego.

Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety

Przeglądaj więcej filmów