Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych
1 listopada 2024
Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.
Nasze badania koncentrują się na wykorzystaniu kompetentnie wyprodukowanych funkcjonalizowanych białek jedwabiu pajęczego do stworzenia modeli macierzy zewnątrzkomórkowej, aby stworzyć bardziej podobne warunki in vivo dla komórek. Mamy nadzieję, że dzięki stworzeniu bardziej realistycznych warunków, w których komórki będą rosły w strukturze przypominającej tkankę, tak jak w organizmie, co zaowocuje bardziej realistycznymi modelami. Tak więc główną zaletą stosowania naszych membran FN-silk zamiast dostępnych na rynku plastikowych membran PET jest to, że użytkownik otrzymuje membranę, która faktycznie przypomina natywną membranę podstawną pod względem struktury, grubości, składu biologicznego i elastyczności.
Używając membrany, która jest bliższa naśladowaniu natywnej błony podstawnej, jesteśmy w stanie stworzyć bardziej realistyczne modele tkanek in vitro. Może to przyspieszyć odkrywanie leków i jeszcze bardziej zmniejszyć potrzebę przeprowadzania testów na zwierzętach. Będziemy nadal badać, w jaki sposób membrana FN-silk może jeszcze bardziej poprawić statyczne modele tkanek in vitro, a także włączymy membranę do chipów mikroprzepływowych, aby wystawić komórki na przepływ.
W ten sposób możemy dalej angażować modele in vitro w kierunku warunków bardziej zbliżonych do in vivo. Na początek wyjmij fiolki z jedwabiu FN z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i umieść je w suchym lodzie na czas transportu, przenieś fiolki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i umieść je w stojaku na probówki do mikrowirówek. Po rozmrożeniu odpipetować 550 mikrolitrów roztworu jedwabiu do co drugiego dołka 48-dołkowej płytki.
Umieść pokrywkę na talerzu i umieść go w sterylnym pudełku. Ostrożnie przenieś pudełko z szafy bezpieczeństwa biologicznego i pozostaw je na noc w warunkach otoczenia. Następnego dnia przynieś pudełko zawierające płytkę z membranami z jedwabiu FN i sterylnymi wkładkami do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
Ostrożnie wyjmij płytkę z pudełka. Otwórz pokrywę płytki i wizualnie sprawdź tworzenie się membrany, obserwując zmętnienie w studzienkach. Za pomocą sterylnej pęsety podnieś jedną wkładkę i poprowadź ją w dół na membranę, aż uchwyty dotkną górnej części studzienki.
Po opuszczeniu wszystkich wkładek umieść pokrywkę na talerzu i włóż płytkę z powrotem do sterylnego pudełka. Pozwól membranom przylegać do wkładek przez dwie godziny. Następnie wyjmij talerz z pudełka i otwórz pokrywę.
Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij wkładkę z dołka. Napełnij wkładkę 100 mikrolitrami DMEM/F12 do siewu podstawowego lub 200 mikrolitrami do siewu wierzchołkowego. Przenieść wkładkę do pustego dołka na 24-dołkowej płytce i napełnić studzienkę jednym mililitrem DMEM/F12 Po zebraniu żądanej liczby ludzkich keratynocytów za pomocą pipety P200 odessać od 20 do 50 mikrolitrów zawiesiny komórek.
Skieruj końcówkę pipety w kierunku środka membrany i powoli naciskaj tłok pipety, doprowadzając kroplę do kontaktu z pożywką hodowlaną wewnątrz wkładu. Po przeniesieniu wszystkich błon przesuń płytkę w kształcie ósemki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na błonach. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Za pomocą pęsety wyjmij wkładki z płytki 24-dołkowej, pozostawiając pożywkę hodowlaną w dołkach. Następnie odwróć wkładkę tak, aby strona podstawowa była skierowana do góry. Umieścić odwróconą wkładkę na szalce Petriego, odessać 20 mikrolitrów zawiesiny komórek ludzkich keratynocytów za pomocą pipety P200.
Skieruj końcówkę pipety w stronę środka membrany i powoli naciskaj tłok pipety, aby utworzyć kroplę, która spadnie na membranę. Umieść pokrywkę na szalce Petriego. Przenieść szalkę Petriego i pożywkę zawierającą 24-dołkową płytkę do inkubatora na 30 minut.
Po inkubacji przenieść 24-dołkową płytkę i szalkę Petriego do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pęsety wybierz jedną wkładkę i odwróć ją tak, aby wierzchołkowa strona błony była skierowana do góry, a strona podstawowa do dołu. Za pomocą pipety P200 dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej do wkładki, umieść wkładkę z powrotem w wstępnie napełnionym dołku na 24-dołkowej płytce.
Hoduj wkładki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Keratynocyty hodowane na membranie FN-silk równomiernie pokrywały powierzchnię i wykazywały morfologię bruku już pierwszego dnia. Keratynocyty utworzyły zlewającą się warstwę w trzecim dniu, wskazując na funkcję nabłonka i utworzyły sieć ścisłych połączeń, co wskazuje, że przyjmują fizjologiczne funkcje nabłonka.
Wysoką żywotność komórek zaobserwowano na błonach FN-silk po trzech dniach, bez znaczącej różnicy w żywotności między centrum a obrzeżami. System membran FN-silk wspierał żywotność keratynocytów w sposób podobny lub lepszy niż komercyjne systemy membranowe PET.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorską metodę tworzenia modeli macierzy zewnątrzkomórkowej z wykorzystaniem funkcjonalizowanych białek jedwabiu pająka w roli membran. Membrany te stanowią bardziej biologicznie istotną alternatywę dla tradycyjnych membran plastikowych, usprawniając modele tkankowe in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórkowa
- Inżynieria tkankowa
- Biomateriały
Wstęp
- W hodowlach komórkowych powszechnie stosuje się tradycyjne membrany plastikowe.
- Funkcjonalizowane białka jedwabiu pajęczego mogą naśladować naturalne błony podstawne.
- Udoskonalone modele in vitro mogą usprawnić proces odkrywania leków i ograniczyć testy na zwierzętach.
- Tworzenie realistycznych warunków wzrostu komórek jest niezbędne dla dokładnego modelowania.
Cel badania
- Opracowanie metody wykorzystania membran FN-silk w hodowli komórkowej.
- Ustanowienie bardziej fizjologicznie istotnych modeli tkanek in vitro.
- Zbadanie potencjału membran FN-silk w zastosowaniach mikrofluidycznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie membran FN-jedwab w środowisku sterylnym.
- Wysiew ludzkich keratynocytów na membrany.
- Inkubacja kultur w celu oceny żywotności i morfologii komórek.
- Ocena funkcji nabłonkowej i tworzenia połączeń ścisłych.
Główne wyniki
- Keratynocyty wykazały morfologię brukową i utworzyły warstwę konfluentną do trzeciego dnia.
- Na membranach FN-silk zaobserwowano wysoką żywotność komórek.
- Nie stwierdzono istotnych różnic w żywotności między centrum a obrzeżami membran.
- Membrany FN-silk wspierały funkcje keratynocytów w stopniu zbliżonym lub lepszym niż komercyjne membrany PET.
Wnioski
- Membrany z jedwabiu z FN stanowią obiecującą alternatywę dla membran plastikowych w hodowli komórkowej.
- Membrany te zwiększają istotność fizjologiczną modeli in vitro.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres ich zastosowania w odkrywaniu leków oraz inżynierii tkankowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Replikowanie fizjologicznie istotnych barier tkankowych in vitro jest niezbędne dla predykcyjnego odkrywania leków i badań translacyjnych. Zastosowanie membran z rekombinowanego jedwabiu pająka w insertach do hodowli tkankowych zwiększa wierność biologiczną modeli opartych na komórkach, co bezpośrednio wpływa na screening we wczesnej fazie oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Innowacja ta umożliwia dokładniejszą ocenę kandydatów na leki i zmniejsza zależność od modeli zwierzęcych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia tworzenie modeli tkankowych, które ściśle naśladują architekturę natywnej błony podstawnej.
- Poprawia proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez wspieranie wzrostu i funkcji komórek w warunkach tkankowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad walidacją celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia biologicznie istotne podłoże do zestandaryzowanych testów hodowli komórkowych.
- Zwiększa powtarzalność oraz umożliwia ilościową ocenę żywotności i morfologii komórek.
- Wspiera wiarygodną ewaluację związków poprzez utrzymanie fizjologicznych funkcji nabłonka.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Przybliża modele in vitro do barier tkankowych in vivo, zapewniając ciągłość translacyjną.
- Ogranicza konieczność przeprowadzania testów na zwierzętach dzięki poprawie zdolności prognostycznej modeli.
- Umożliwia integrację z zaawansowanymi systemami, takimi jak chipy mikrofluidyczne, w celu prowadzenia badań dynamicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta technologia membranowa znajduje zastosowanie od wczesnej fazy odkryć po opracowywanie modeli przedklinicznych, wspierając zarówno weryfikację hipotez, jak i późniejsze etapy procesów przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez poprzez zapewnienie macierzy zewnątrzkomórkowej o właściwościach zbliżonych do naturalnych do badań nad zachowaniem komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych platform dla ilościowych odczytów opartych na komórkach.
- Analityka: Umożliwia solidny pomiar żywotności komórek, morfologii oraz funkcji nabłonka w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy istotność in vitro i in vivo, wspierając dopasowanie biomarkerów i podejmowanie decyzji skorygowanych o ryzyko.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielorazową, konfigurowalną platformę, którą można dostosować do różnych modeli tkanek i procesów roboczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad modelami tkankowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki hodowli komórkowych i poprawia powtarzalność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana biegłość w technikach sterylnych oraz prowadzeniu kultur komórkowych.
- Konieczny dostęp do produkcji białek rekombinowanych oraz druku 3D lub komercyjnych wkładów.
- Wymagana standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójności przygotowania i stosowania membran.
- Metoda adaptowalna do różnych typów komórek i modeli tkankowych po optymalizacji protokołu.
- Uzyskanie wiarygodnych wyników jest zależne od integralności i powtarzalności membran.
