Name: Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę eSPAN do analizy depozycji histonów podczas replikacji DNA w komórkach drożdży i mysich komórek macierzystych. Technika ta ujawnia mechanizmy dziedziczenia epigenetycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) oraz Hormel Startup Fund (C.Y.).

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykrywanie białek związanych z wiodącymi i opóźniającymi się niciami replikacyjnymi jest istotne dla zrozumienia mechanizmów replikacji chromatyny i związanych z nimi procesów, które są bezpośrednio istotne dla badań nad rakiem u ludzi oraz mechanizmów oporności na leki. Do badania replikacji DNA i powiązanych procesów, takich jak natywna chromatynowa immunoprecipitacja (nChIP), iPOND oraz wczesne wychwytywanie chromatyny 29,30,31, zostało zastosowanych do badania replikacji DNA i powiązanych proc...

U organizmów eukariotycznych duplikacja genomu inicjuje się z wielu miejsc zwanych początkami replikacji, gdzie kompleks rozpoznawczy pochodzenia (ORC) wiąże się i inicjuje mechanizm rekrutacji białka, w tym helikazę CMG, aby zainicjować replikację DNA1. Mechanizm odpowiadający w każdym punkcie punktu początkowym replikacji tworzy dwa rozwidlenia replikacyjne, które poruszają się dwukierunkowo 2,3. Podwójne widły replikacyjne replikują dwie macierzyste nici DNA poprzez ciągłą syntezę wiodącej nici oraz nieciągłą syntezę opóźniającej nici. Ze względu na asymetryczny charakter każdej widełki replikacyjnej, komponenty replikacyjne, w tym polimerazy DNA na wiodącej i opóźnionej nici, są różne. Wcześniejsze analizy genetyczne oparte na mutantnych polimerazach DNA wykazały, że DNA Pol ε i DNA Pol δ są głównymi polimerazami odpowiedzialnymi za replikację wiodących i opóźnionych nici, odpowiednio 4,5. Opracowano kilka metod wykrywania preferencji nici polimerazy DNA, w tym Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 oraz emRiboSeq lub RiboSeq 9,10. Te metody genetyczne do analizy specyficzności nici ograniczają się do polimeraz DNA i wymagają wprowadzenia mutacji na każdym białku 4,5,11,12. Śledzenie powiązania dowolnego docelowego białka z wiodącymi i opóźniającymi się łańcuchami replikacji DNA dostarczy cennych informacji na temat replikacji DNA. W ramach tych działań najpierw opracowaliśmy technikę eSPAN (wzbogacanie i sekwencjonowanie DNA powiązanego z białkiem, Rysunek 1) w komórkach drożdży. Jako badanie dowodu zasady najpierw wykazaliśmy, że δ Pol i δ Pol są wzbogacane odpowiednio na nici prowadzące i opóźnione. Odkryliśmy także preferencje nici kluczowych komponentów replikacji DNA, w tym helikazy replikacyjnej DNA, białka wiążącego DNA z pojedynczą nicią (białko replikacyjne A) oraz lampy proliferającego antygenu jądrowego komórki (PCNA) i jej czynnika replikacyjnego ładowającego C (RFC)13. Co ważne, my i inni wykorzystywaliśmy tę metodę do odkrywania mechanizmów transferu histonów przez rodziców, procesu, który przez ponad 4 dekady był trudny do rozwiązania(14,15,16,17).
Metoda eSPAN obejmuje dwa kolejne etapy: wzbogacenie docelowego białka o ChIP18 lub CUT&Tag19 oraz wzbogacenie powstającego DNA związanego z białkiem poprzez immunoprecipitację BrdU. W standardowym szczepie drożdży (W303 lub S288C) zewnętrzny BrdU lub EdU nie może wniknąć do komórek i włączyć się do chromosomów. Te szczepy nie mają odpowiedniego transportera nukleozydowego do pobierania tymidyny oraz kinazy tymidynowej potrzebnej do fosforylacji tymidyny do TMP, która przekształca BrdU (lub EdU) w BrdUMP (EdUMP). Ekspresja ludzkiego równoważącego transportera nukleozydowego 1 (hENT1) oraz kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (HSV-TK) zwiększa pobieranie tymidyny oraz konwersję BrdU (lub EdU) do BrdUMP (EdUMP)20. Dlatego, aby przeprowadzić eksperyment eSPAN na drożdżach, szczepy musiały zostać wprowadzone ze strukturą BrdU-Incorporating (BrdU-Inc) (HSV-TK i hENT1)13,21.
Wcześniej dostarczaliśmy protokół eSPAN dla białek replikacji DNA u drożdży22. Niedawno zintegrowaliśmy metodę CUT&Tag z protokołem eSPAN w komórkach ssaków, aby rozwiązać technicznie wymagające etapy wymagające optymalizacji, takie jak sieciowanie, ścinanie chromatyny oraz zminimalizować liczbę komórek początkowych17,23. Tutaj udostępniliśmy histonowy eSPAN do wizualizacji przy użyciu komórek drożdży (Rysunek 2). Metoda ta jest przede wszystkim stosowana do analizy rozkładu zmodyfikowanych form histonów na replikujących się niciach DNA. Podczas testowania kilku znaków histonowych użyliśmy H3K4me3, znaku na histonie rodzicielskim H3, jako przykład. Aby przeanalizować niektóre składniki i czynniki zaangażowane w naprawę DNA na rozwidlach replikacyjnych, zalecamy rozcięcie chromatyny na małe fragmenty za pomocą sonikacji, jak opisano w naszej pierwszej publikacji22. Dla komórek ssaków przyjęliśmy zmodyfikowane procedury Cut&Tag, aby zastąpić krok ChIP opisany u drożdży23. Ta modyfikacja zmniejsza ilość materiału wyjściowego (komórek) i, co najważniejsze, umożliwia generowanie bibliotek eSPAN do sekwencjonowania bez użycia zestawów do przygotowania jednoniciowego DNA. W przypadku protokołu drożdżowego zdecydowaliśmy się nie stosować metody Cut&Tag, ponieważ ilość materiału startowego była wystarczająca. Co ważniejsze, odkryliśmy, że procedury Cut&Tag nie były konsekwentnie skuteczne dla komórek drożdży w naszych dłoniach.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL niskowiążących rurek DNA&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor ampligazy</td><td>Lucygen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 cala. BD PrecisionGlid Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1S PLUS ZESTAW BIBLIOTECZNY DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>10009817</td><td>zestaw do przygotowania bibliotek ssDNA i niskowejściowych DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 bioanalizator&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>2100 bioanaliza</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucygen</td><td>A0110K</td><td>Obchodz się z paraformaldehydem ostrożnie, jest łatwopalny i niebezpieczny.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP SPRI Reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-BrdU&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw H3K4me3 & nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek&nbsp;, model TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidyna chlorowodorek&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Ciała stałe palne</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Traktuj BrdU ostrożnie, ponieważ może być potencjalnym mutagenem i teratogenem.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator hodowli komórkowych &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific &nbsp; model Forma serii II inkubator CO2 z wodną płaszczyznką</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Medium hodowlane komórek &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; Rozmiar siatki suchej 400</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne koraliki powlekane Concanavalin A (ConA) &</td><td>Nauki polinaukowe</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli &nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Obchodz się z etanolem ostrożnie, jest łatwopalny</td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Ostrożnie obchodz się z izoproponolem, jest łatwopalny</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td>Ostrożnie obchodz się z KOH, jest</td></tr><tr><td>Próżnia przy niskich prędkościach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokowa &nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR MinElute&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Mini-bijak do koralików</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-wirówka &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Wieloplatformowy shaker</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Wieloplatformowy inkubator shakera</td><td>Benchmark</td><td>SHAKER INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy wielotermiczny&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Termomieszacz C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroksymetyl)metyl]-3-aminopropanosulfonowy kwas nbsp; (STUKANIE)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; Rozmiar siatki suchej 400</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Traktuj NaOH ostrożnie, jest</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&razy; PCR master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Thermo Scientific</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Obchodz się z paraformaldehydem ostrożnie, jest łatwopalny i niebezpieczny.</td></tr><tr><td>enzym pA-Tn5 i nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol fenol-chloroform-izoamyl &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P1000, P200, P20 i P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka koktajlowa inhibitora proteazy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Białko G-sepharozowe koraliki&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wytrącenia białek</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wytrącenia białek</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Ostrożnie obchodz się z KOH, jest</td></tr><tr><td>Roztwór wytrącania białek&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr &nbsp;</td><td>Termo naukowe.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs, &nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici dna poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody dna powiązanego z białkiem

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Duplikacja genomu jest realizowana przez białka rerespondsome, w tym helikazy, które rozwijają podwójne DNA na poszczególne antyrównoległe pojedyncze nici, z których każda wymaga odrębnych trybów replikacji: ciągłej (prowadzącej) i nieciągłej (opóźnienia). Zrozumienie interakcji białek związanych z chromatyną z replikującymi się nici DNA in vivo jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów składania chromatyny i naprawy DNA w związku z replikacją DNA. Protokół ten przedstawia metodę wzbogacania i sekwencjonowania DNA związanego z białkiem (eSPAN), zaprojektowaną do ilościowego określania względnych poziomów białek na początkujących i opóźniających nici DNA na rozwidlach replikacyjnych. Procedura eSPAN rozpoczyna się od immunoprecipitacji chromatyny (ChIP, u drożdży) lub rozszczepienia pod celami oraz tagmentacji (CUT&Tag; w komórkach ssaków) interesującego białka, po czym następuje wzbogacenie nowo powstałego DNA powiązanego z białkiem poprzez immunoprecipitację bromodeoksyurydyny (BrdU). Sekwencjonowanie nowej generacji specyficzne dla nici jest stosowane do izolowanego ssDNA. Technika ta może być stosowana do określenia, czy białko jest wzbogacone na wiodących lub opóźnionych widełkach replikacyjnych. eSPAN zapewnia preferencję dla białek związanych z chromatyną w całym genomie, w tym histonów na rozwidlach replikacji.

eSPAN może być wykorzystywany do pozyskiwania informacji specyficznych dla włókna dotyczącego docelowego białka, takich jak histony i modyfikacje histonów. W tym reprezentatywnym wyniku przeprowadzono pobieranie próbek i procesy eSPAN według schematu przedstawionego na Rysunku 2, wykorzystując system drożdży pączkowych. Leczenie i pobieranie próbek odbywa się zgodnie z wczesnym warunkiem leczenia hydroksymoczowcem w fazie S, zgodnie z tym protokołem. Zastosowano dwa szczepy drożdży: WT (typ ...

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

Nasze badania koncentrują się na mechanizmie dziedziczenia epigenetycznego. Konkretnie, proces replikacji DNA sprzężał się z recyklingiem histonów rodzicielskich, który stanowi pierwszy etap emisji w dziedziczeniu epigenetycznym. Wielokrotne składanie histonów u rodziców, które są zaangażowane w replikację DNA, zostało uznane za odgrywające ważną rolę w recyklingu histonów rodzicielskich.Obejmuje to kompleks helikazy D, polimerazę DNA oraz kompleks replikacji ochronnej. Tradycyjne podejścia genetyczne i biochemiczne były stosowane w tej dziedzinie badawczej. Tradycyjnie stosuje się metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, aby zrozumieć proces transferu histonów rodzicielskich.Przed opracowaniem wzbogacania i sekwencjonowania DNA związanego z białkiem, czyli metody eksperymentalnej, badanie procesu transferu histonów rodzicielskich było wyzwaniem. Metoda eksperymentu była potężnym narzędziem do rozwiązywania tych podstawowych pytań. Na początek spiłuj granulki z komórek drożdżowych i ponownie je zawiesz poprzez delikatne wirowanie.Następnie myję to samo 0,4 mililitra buforu lizywnego CHIP zawierającego inhibitory proteazy oraz mieszankę antybiotyków, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnym. Wiruj mieszankę w 5 000 G przez minutę. Następnie do pelletu dodaj 0,1 mililitra buforu lizycznego CHIP z inhibitorami proteazy i mieszanką antybiotyków.Następnie około 100 mikrolitrów szklanych kulek o pojemności 0,5 milimetra. Lizuj komórki przez koraliki przez trzy cykle w chłodni, chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Używając gorącej igły 16 gauge, wybij otwory na dnie rurki.Zbieraj lizat, wkładając przebitą rurkę do pustej rurki DNA o niskiej więździe o pojemności 1,5 mililitra, a następnie wiruj w 1 600 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zasysaj supernatant, nie poruszając granulatu. Frakcja resztek komórkowych zawiera chromatynę.Ponownie zawiesij pellety komórkowe, pipetując w 0,35 mililitra uzupełnionej nukleazy mikrokokowej, czyli buforu trawienia MNazy. Następnie dodaj 10 jednostek MNase do zawieszenia. Delikatnie mieszaj, odwracając cztery do sześciu razy, i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.Schłodzić trawienie MNazy, dodając pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA do końcowego stężenia 10 milimolarnych. Delikatnie mieszaj przez inwersję i umieść tubkę na lodzie na co najmniej 30 minut. Używając mikrorurek Bioruptor o pojemności 1,5 mililitra, sonikuj mieszaninę reakcji z dużą mocą przez trzy minuty, z 30-sekundowym włączaniem i 30-sekundowym wyłączaniem.Następnie wiruj w 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant do nowych rurek i ponownie wiruj w 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie pobierz około 400 mikrolitrów supernatantu.Zachowaj 30 mikrolitrów jako wejściowe DNA do ekstrakcji DNA i zamroź w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykorzystaj pozostałe 370 mikrolitrów lizatu komórkowego do immunoprecypitacji histon-chromatyny. Na początek zagotuj około 150 mikrolitrów wcześniej uzyskanych próbek wejściowych i H3K4me3 CHIP na bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie natychmiast schłodzić próbkę na lodzie przez pięć minut.Następnie dodaj wymaganą ilość wymienionych składników do próbki. Mutuj próbkę przez dwie godziny na wirniku przy czterech stopniach Celsjusza i 10 obr./min. Przełóż mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 20 mikrolitrów umytych białkowych kulek G Sepharose.Mutuj mieszankę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wirniku przy 10 obr./min. Skręcaj rurki w temperaturze pokojowej przy 800 G przez minutę. Przemyj kulki trzy razy jednym mililitrem zimnego buforu bromo-deoksyurydyny lub buforu immunoprecipitacyjnego BrdU rotującym przez trzy minuty przy każdym myciu.Ponownie wiruj probówkę i myj jednym mililitrem buforu TE przez trzy minuty. Ponownie obróć rurki przy 800 G przez minutę w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysaj supernatant. Dodaj do kulek 100 mikrolitrów buforu TE z 1% SDS.Inkubuj mieszankę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wiruj w 800 G przez minutę w temperaturze pokojowej. Oczyścić supernatant do 18 mikrolitrów buforu elucijnego za pomocą kolumn oczyszczających DNA, aby uzyskać próbki immunoprecipitacji BrdU i H3K4me3 eSPAN. Przygotuj bibliotekę jednoniciowego DNA z wymienionymi próbkami, stosując podręcznik zestawu do przygotowania biblioteki sssDNA i biblioteki DNA o niskim wejściu.Oczyść produkt ligacji do 20 mikrolitrów buforu elucijnego o niskiej zawartości EDTA. Wzmocnić bibliotekę DNA za pomocą 50 mikrolitrów mieszanki reakcji z zestawu do przygotowania biblioteki DNA z pojedynczą nicią. Zgodnie z wyświetlanym cyklem, wzmocnij mieszankę PCR.Oczyść produkty PCR, mieszając je z 60 mikrolitrami kulek, podgrzanych do 30 stopni Celsjusza. Dokładnie wymieszaj produkty PCR i koraliki. Pozwól mieszance stać w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Zwiąż kulki na magnetycznym stojaku przez trzy minuty i umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego etanolu 80%. Susz koraliki na powietrzu przez dwie minuty, a następnie rozcieńcz DNA do 20 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości EDTA udostępnionego w zestawie do przygotowania biblioteki DNA. Zmierz koncentrację biblioteczną i rozkład rozmiarów fragmentów za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej rozdzielczości.Łącz równe ilości pojedynczych bibliotek, w tym wejściowe chromatyny H3K4me3 immunoprecipitacji, BrdU immunoprecipitacji oraz próbek eSPAN do równoległego sekwencjonowania parowanego końca. Typowa analiza żelowa biblioteki sekwencjonowania DNA H3K4me3 eSPAN ujawniła wzór drabinowy nukleosomu chromatyny. Główny pas mononukleosomów pojawił się na 270 parach zasad, gdzie adaptery zostały dodane do fragmentu DNA uzyskanego podczas trawienia.Różne mapowania próbek ujawniły piki na poszczególnych nukleosomach otaczających początkową sekwencję 607, autonomicznie replikującą się w komórkach typu dzikiego i mcm2-3A. Średnie błędy łańcucha wykazały, że w komórkach drożdży typu dzikiego depozycja histonów rodzicielska wykazywała niewielkie skłonności na stronę opóźnionej nici. Jednak w mutantowym histonie rodzicielskim H3H4 został przeniesiony na wiodącą nicię.

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

W tym protokole opisujemy nowatorską technikę BrdU-ChIP-Slot-Western do badania białek i modyfikacji histonów związanych z nowo zsyntetyzowanym lub powstającym DNA.

Badanie białek związanych z powstającym DNA w komórkach ssaków techniką BrdU-ChIP-Slot-Western

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.

G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.

Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Tutaj przedstawiamy procedurę analizy przebiegu replikacji poprzez patogenne, podatne na struktury powtórzenia za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

Poznaj metodę eSPAN do analizy depozycji histonów podczas replikacji DNA w komórkach drożdży i mysich komórek macierzystych. Technika ta ujawnia mechanizmy dziedziczenia epigenetycznego.

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem (Wideo) | JoVE Journal

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Przeglądaj więcej filmów