Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Nasze badania koncentrują się na mechanizmie dziedziczenia epigenetycznego. Konkretnie, proces replikacji DNA sprzężał się z recyklingiem histonów rodzicielskich, który stanowi pierwszy etap emisji w dziedziczeniu epigenetycznym. Wielokrotne składanie histonów u rodziców, które są zaangażowane w replikację DNA, zostało uznane za odgrywające ważną rolę w recyklingu histonów rodzicielskich.

Obejmuje to kompleks helikazy D, polimerazę DNA oraz kompleks replikacji ochronnej. Tradycyjne podejścia genetyczne i biochemiczne były stosowane w tej dziedzinie badawczej. Tradycyjnie stosuje się metody sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, aby zrozumieć proces transferu histonów rodzicielskich.

Przed opracowaniem wzbogacania i sekwencjonowania DNA związanego z białkiem, czyli metody eksperymentalnej, badanie procesu transferu histonów rodzicielskich było wyzwaniem. Metoda eksperymentu była potężnym narzędziem do rozwiązywania tych podstawowych pytań. Na początek spiłuj granulki z komórek drożdżowych i ponownie je zawiesz poprzez delikatne wirowanie.

Następnie myję to samo 0,4 mililitra buforu lizywnego CHIP zawierającego inhibitory proteazy oraz mieszankę antybiotyków, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnym. Wiruj mieszankę w 5 000 G przez minutę. Następnie do pelletu dodaj 0,1 mililitra buforu lizycznego CHIP z inhibitorami proteazy i mieszanką antybiotyków.

Następnie około 100 mikrolitrów szklanych kulek o pojemności 0,5 milimetra. Lizuj komórki przez koraliki przez trzy cykle w chłodni, chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Używając gorącej igły 16 gauge, wybij otwory na dnie rurki.

Zbieraj lizat, wkładając przebitą rurkę do pustej rurki DNA o niskiej więździe o pojemności 1,5 mililitra, a następnie wiruj w 1 600 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zasysaj supernatant, nie poruszając granulatu. Frakcja resztek komórkowych zawiera chromatynę.

Ponownie zawiesij pellety komórkowe, pipetując w 0,35 mililitra uzupełnionej nukleazy mikrokokowej, czyli buforu trawienia MNazy. Następnie dodaj 10 jednostek MNase do zawieszenia. Delikatnie mieszaj, odwracając cztery do sześciu razy, i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Schłodzić trawienie MNazy, dodając pięć mikrolitrów 0,5 molowego EDTA do końcowego stężenia 10 milimolarnych. Delikatnie mieszaj przez inwersję i umieść tubkę na lodzie na co najmniej 30 minut. Używając mikrorurek Bioruptor o pojemności 1,5 mililitra, sonikuj mieszaninę reakcji z dużą mocą przez trzy minuty, z 30-sekundowym włączaniem i 30-sekundowym wyłączaniem.

Następnie wiruj w 10 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przelej supernatant do nowych rurek i ponownie wiruj w 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie pobierz około 400 mikrolitrów supernatantu.

Zachowaj 30 mikrolitrów jako wejściowe DNA do ekstrakcji DNA i zamroź w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wykorzystaj pozostałe 370 mikrolitrów lizatu komórkowego do immunoprecypitacji histon-chromatyny. Na początek zagotuj około 150 mikrolitrów wcześniej uzyskanych próbek wejściowych i H3K4me3 CHIP na bloku grzewczym o temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie natychmiast schłodzić próbkę na lodzie przez pięć minut.

Następnie dodaj wymaganą ilość wymienionych składników do próbki. Mutuj próbkę przez dwie godziny na wirniku przy czterech stopniach Celsjusza i 10 obr./min. Przełóż mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 20 mikrolitrów umytych białkowych kulek G Sepharose.

Mutuj mieszankę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wirniku przy 10 obr./min. Skręcaj rurki w temperaturze pokojowej przy 800 G przez minutę. Przemyj kulki trzy razy jednym mililitrem zimnego buforu bromo-deoksyurydyny lub buforu immunoprecipitacyjnego BrdU rotującym przez trzy minuty przy każdym myciu.

Ponownie wiruj probówkę i myj jednym mililitrem buforu TE przez trzy minuty. Ponownie obróć rurki przy 800 G przez minutę w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysaj supernatant. Dodaj do kulek 100 mikrolitrów buforu TE z 1% SDS.

Inkubuj mieszankę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wiruj w 800 G przez minutę w temperaturze pokojowej. Oczyścić supernatant do 18 mikrolitrów buforu elucijnego za pomocą kolumn oczyszczających DNA, aby uzyskać próbki immunoprecipitacji BrdU i H3K4me3 eSPAN. Przygotuj bibliotekę jednoniciowego DNA z wymienionymi próbkami, stosując podręcznik zestawu do przygotowania biblioteki sssDNA i biblioteki DNA o niskim wejściu.

Oczyść produkt ligacji do 20 mikrolitrów buforu elucijnego o niskiej zawartości EDTA. Wzmocnić bibliotekę DNA za pomocą 50 mikrolitrów mieszanki reakcji z zestawu do przygotowania biblioteki DNA z pojedynczą nicią. Zgodnie z wyświetlanym cyklem, wzmocnij mieszankę PCR.

Oczyść produkty PCR, mieszając je z 60 mikrolitrami kulek, podgrzanych do 30 stopni Celsjusza. Dokładnie wymieszaj produkty PCR i koraliki. Pozwól mieszance stać w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Zwiąż kulki na magnetycznym stojaku przez trzy minuty i umyj je dwukrotnie 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego etanolu 80%. Susz koraliki na powietrzu przez dwie minuty, a następnie rozcieńcz DNA do 20 mikrolitrów buforu o niskiej zawartości EDTA udostępnionego w zestawie do przygotowania biblioteki DNA. Zmierz koncentrację biblioteczną i rozkład rozmiarów fragmentów za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej rozdzielczości.

Łącz równe ilości pojedynczych bibliotek, w tym wejściowe chromatyny H3K4me3 immunoprecipitacji, BrdU immunoprecipitacji oraz próbek eSPAN do równoległego sekwencjonowania parowanego końca. Typowa analiza żelowa biblioteki sekwencjonowania DNA H3K4me3 eSPAN ujawniła wzór drabinowy nukleosomu chromatyny. Główny pas mononukleosomów pojawił się na 270 parach zasad, gdzie adaptery zostały dodane do fragmentu DNA uzyskanego podczas trawienia.

Różne mapowania próbek ujawniły piki na poszczególnych nukleosomach otaczających początkową sekwencję 607, autonomicznie replikującą się w komórkach typu dzikiego i mcm2-3A. Średnie błędy łańcucha wykazały, że w komórkach drożdży typu dzikiego depozycja histonów rodzicielska wykazywała niewielkie skłonności na stronę opóźnionej nici. Jednak w mutantowym histonie rodzicielskim H3H4 został przeniesiony na wiodącą nicię.