Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo
10 stycznia 2025
Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.
Nasze badania koncentrują się na białaczce, a konkretnie na zespołach mielodysplastycznych lub neoplazji mielodysplastycznej. Jest to choroba komórek macierzystych wywodząca się z hematopoetycznych komórek macierzystych. Wpływa na różne linie komórek krwi, szczególnie linię erytroidalną, która jest odpowiedzialna za produkcję krwinek serca.
Przerwanie tej linii może prowadzić do niedokrwistości, która jest powszechnie obserwowana u pacjentów z MDS. Metoda, którą przedstawiamy w tym artykule, pozwala na solidną i uproszczoną metodę oceny skuteczności ludzkich erytroblastów in vitro po modyfikacji genów lub leczeniu farmakologicznym. Hematopoetyczne komórki macierzyste są obecne od narodzin do ostatniej chwili naszego życia.
W naszym organizmie nie ma już tkanki proliferacyjnej, której każdego dnia produkuje się biliony komórek. Wciąż jest tak wiele rzeczy do zrozumienia, więc będziemy nadal badać te niesamowite komórki w zdrowych tkankach aminowych, kładąc duży nacisk na proteostazę i biologię RNA. Na początek rozmrozić 100 000 komórek CD34 + UCB, zanurzając fiolkę na 30 sekund w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.
Dodać kroplami jeden mililitr pożywki do rozmrażania, a następnie delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół. Przenieś zawieszoną zawiesinę komórek kropla po kropli do pięciu mililitrów pożywki do rozmrażania. Następnie odwirować zawiesinę komórkową przez osiem minut w temperaturze 320 G w temperaturze pokojowej.
Umyj komórki w 10 mililitrach aktywowanego fluorescencją sortowania komórek lub buforu FACS z DNAzą. Po ponownym odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki stymulującej. Przenieś dwa mililitry zawiesiny komórkowej na 24-dołkową płytkę i inkubuj płytkę przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie zbierz komórki w aktywowanych fluorescencją probówkach do sortowania komórek i uzupełnij je jednym mililitrem pożywki z komórek macierzystych. Po rozmrożeniu wirusa dodaj wymaganą objętość do pożywki stymulującej, aby uzyskać wielokrotność infekcji wynoszącą 30. Ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zawierającej wirusa o gęstości 100 000 komórek na 100 mikrolitrów wirusa i przenieść je do jednego dołka na 96-dołkowej płytce.
Dodaj PBS do pustych studzienek i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś pełną objętość zawiesiny komórkowej z dołka 96-dołkowej płytki do probówek FACS z jednym mililitrem pożywki z komórek macierzystych. Umyj studzienkę i końcówkę pipety pożywką z komórek macierzystych, aby dodać dwa mililitry pożywki z komórek macierzystych do probówki FACS.
Po odwirowaniu probówki FACS wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki eksplatacyjnej. Przenieść zawiesinę do studzienki na płytce 24-dołkowej i inkubować komórki. Aby rozpocząć, przenieś pełną objętość komórek CD34 + transdukowanych za pomocą reportera EGFP do oddzielnej probówki FACS.
Wirować przy 320 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS. Dodać pięć mikrolitrów przeciwciała CD34 do probówki i inkubować probówki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.
Następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu FACS zawierającego DAPI i wirować przez osiem minut w temperaturze 320 G w temperaturze pokojowej. Po ponownym zawieszeniu komórek w 200 mikrolitrach buforu FACS zawierającego DAPI, przed sortowaniem przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra przeciwciała CD34 do jednej kropli kulek w 100 mikrolitrach PBS.
Inkubuj mieszaninę w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do mieszanki. Wirować przez osiem minut w temperaturze pokojowej 320 G.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS. Następnie dodaj komórki białaczkowe GFP-ujemne i GFP-dodatnie do probówki FACS. Umyj komórki w jednym mililitrze buforu FACS.
Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś 100 000 komórek GFP-ujemnych i 100 000 komórek GFP-dodatnich, każda w 500 mikrolitrach buforu FACS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów przed sortowaniem. Następnie zbierz posortowane komórki na pożywce z komórkami macierzystymi.
Odwirowywać komórki przez osiem minut w temperaturze 320 G w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach pożywki różnicowania erytroidalnego. Teraz dozuj jeden mililitr zawieszonych komórek do trzech dołków 24-dołkowej płytki.
Napełnij wszystkie zewnętrzne studzienki PBS. Aby odświeżyć pożywkę, upewnij się, że komórki osiadły na dnie płytki. Delikatnie pochyl płytkę i usuń 500 mikrolitrów pożywki.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki do różnicowania erytroidów 2X cytokin, aby odświeżyć płytkę. Szóstego dnia przenieś komórki na 12-dołkową płytkę i dodaj jeden mililitr pożywki do każdej studzienki, aby osiągnąć końcową objętość dwóch mililitrów. Zbierz 200 mikrolitrów komórek z każdej studzienki 12-dołkowej płytki.
Zastąp usuniętą objętość 250 mikrolitrami pożywki do różnicowania erytroidalnego 2X. Dodaj jeden mililitr buforu FACS do każdej probówki zbiorczej. Po odwirowaniu probówek ponownie zawiesić granulowane komórki w 100 mikrolitrach buforu FACS.
Dodaj po jednym mikrolitrze przeciwciał CD71, CD34 i CD235a do probówek. Następnie ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze bufora FACS zawierającego DAPI. Wirować probówki przez osiem minut w temperaturze 320 G w temperaturze pokojowej.
Ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach buforu FACS za pomocą DAPI. Ustaw DAPI w stosunku do rozproszenia bocznego lub SSC, aby wykluczyć martwe komórki. Ustaw wysokość SSC względem obszaru SSC, aby wykluczyć agregacje, i wybierz pojedyncze komórki.
Ustaw wysunięty do przodu obszar rozproszenia w stosunku do SSCA, aby usunąć zanieczyszczenia na podstawie rozmiaru. Ustaw CD235a kontra CD71. Ustaw CD34 w porównaniu z SSCA.
Uruchom kulki, komórki GFP-dodatnie i komórki barwione DAPI. Skompensuj odczyty i zastosuj kompensację do ustawień cytometru. Komórki CD34-dodatnie z krwi pępowinowej wykazywały wzrost liczby komórek apoptotycznych apoptozy z dodatnim aneksyną V z 14,4% w czwartym dniu do 34,2% w 17 dniu.
Wykres słupkowy pokazuje znaczny wzrost odsetka komórek V-dodatnich aneksyny do 17 dnia, osiągając około 40%
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje różnicowanie CD34+ hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych ex vivo, skupiając się na kluczowych procesach erytropoezy oraz ich znaczeniu dla leczenia powiązanych schorzeń, takich jak zespoły mielodysplastyczne. Poprzez opracowanie uproszczonej metody oceny wydajności erytroblastów, badanie ma na celu pogłębienie wiedzy na temat zaburzeń prowadzących do anemii u tych pacjentów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Erytropoeza
- Zespoły mielodysplastyczne
- Biologia hematopoetycznych komórek macierzystych
Wstęp
- Zespół mielodysplastyczny to choroba komórek macierzystych wpływająca na linie komórkowe krwi.
- Zaburzenia linii erytroidalnej mogą prowadzić do anemii.
- Zrozumienie hematopoetycznych komórek macierzystych jest kluczowe, ponieważ utrzymują się one przez całe życie człowieka.
Zastosowane metody
- Rozmrażanie i resuspensja komórek CD34+ z krwi pępowinowej (UCB)
- Transdukcja komórek z modyfikacjami genetycznymi
- Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
Główne wyniki
- W komórkach CD34+ odnotowano wzrost wskaźników apoptozy w czasie.
- Wykazano efektywne różnicowanie w erytroblasty.
- Opracowane specyficzne metody umożliwiają ocenę po modyfikacji genetycznej lub leczeniu farmakologicznym.
Wnioski
- Badanie prezentuje solidną metodę różnicowania komórek krwiotwórczych, która może doprowadzić do opracowania skuteczniejszych metod leczenia anemii wywołanej zespołami mielodysplastycznymi.
- Praca ta podkreśla znaczenie zrozumienia procesu różnicowania komórek w biologii komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna ocena erytropoezy u ludzi jest kluczowa dla ograniczania ryzyka we wczesnych etapach odkrywania leków w hematologii oraz zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw anemii i zespołów mielodysplastycznych. Przedstawiony schemat postępowania umożliwia rzetelną, ilościową ocenę różnicowania erytroidalnego i funkcji genów zarówno w zdrowych, jak i chorobowych systemach ludzkich. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących portfolio terapii modulujących erytropoezę.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów oraz wpływu szlaków sygnałowych na determinację linii erytroidalnej.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację efektów perturbacji genetycznych lub chemicznych na erytropoezę.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w pierwotnych ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych.
- Zapewnia wgląd mechanistyczny w zaburzenia istotne dla rozwoju chorób, takie jak te obserwowane w zespołach mielodysplastycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane układy in vitro i ex vivo do przesiewania związków wpływających na różnicowanie erytroidalne.
- Umożliwia odtwarzalne, ilościowe odczyty z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i identyfikacji komórek na podstawie markerów.
- Wspiera standaryzację testów w celu zapewnienia porównywalności między badaniami i zespołami.
- Przygotowuje skalowalne platformy do oceny modulacji genów i strategii ratunkowych z użyciem leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie wyników in vitro z modelami ex vivo pochodzącymi od pacjentów w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka przy rozwoju kandydatów, u których wykazano wpływ na erytropoezę.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez monitorowanie markerów różnicowania i apoptozy w różnych punktach czasowych.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka podczas wyboru kandydatów przedklinicznych w portfolio hematologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację lidera, aż po walidację przedkliniczną w procesach badawczych skoncentrowanych na hematologii.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie wpływu genów i związków na specyfikację i dojrzewanie linii erytroidalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych testów opartych na cytometrii przepływowej do przesiewania związków i genetycznego.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe, takie jak wskaźniki apoptozy i ekspresja markerów, do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro i ex vivo z modelami chorób istotnymi dla pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułowy, wielokrotnego użytku przepływ pracy, który można dostosować do różnych celów genowych i bibliotek związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz zrozumienie mechanizmów erytropoezy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w zespołach badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów hematologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i związków z potwierdzonymi efektami erytroidalnymi w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych oraz w analizie cytometrii przepływowej.
- Wymaga dostępu do aparatury FACS oraz zwalidowanych paneli przeciwciał dla markerów erytroidalnych.
- Wymaga standaryzacji strategii bramkowania i interpretacji danych między zespołami.
- Możliwość adaptacji zarówno do próbek od zdrowych dawców, jak i próbek pochodzących od pacjentów w celu szerszego zastosowania.
- Zależność od stabilnych źródeł pozyskiwania komórek i kontroli jakości w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
