Name: Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę oceny erytropoezy in vitro i ex vivo przy użyciu komórek CD34+ z krwi pępowinowej. Technika ta umożliwia badanie różnicowania erytroblastów oraz ocenę skuteczności terapii w zespołach mielodysplastycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.P., S.B. i K.RP. byli wspierani przez program HARP, Barts Charity (G-002167), Kay Kendall Leukaemia Fund (KKL1149) i Akademię Nauk Medycznych (SBF004\1099). Dziękujemy dr Pantelitsa Protopapa za barwienie MGG i nabycie mikroskopii. Doceniamy również urządzenia do cytometrii przepływowej i mikroskopii Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London. Dziękujemy brytyjskiej organizacji charytatywnej Anthony Nolan, za dostarczenie nam jednostek krwi pępowinowej użytych w tym manuskrypcie.

Modeling Erythropoiesis Using HSPCs from Cord Blood and Bone Marrow

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy skuteczną i niezawodną metodę indukowania różnicowania erytroidalnego hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + (HSPC) wyizolowanych ze szpiku kostnego dorosłego (BM) lub z krwi pępowinowej (UCB). Proces ten obejmuje edycję/modyfikację komórek pierwotnych w celu zbadania funkcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu różnicowania erytroidalnego. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do zbadania funkcjonalnego znaczenia genów, które wcześniej nie...

Każdego dnia około 280 miliardów czerwonych krwinek (RBC) jest wytwarzanych w szpiku kostnym, aby zapewnić transport tlenu przez całe ciało1. Erytropoeza to precyzyjnie dostrojony proces różnicowania, w którym powstają dojrzałe, funkcjonalne czerwone krwinki z hematopoetycznych komórek macierzystych. Wiele chorób, zarówno nabytych, jak i wrodzonych, może wpływać na ten proces, w tym zespół mielodysplastyczny, niedokrwistość aplastyczna, talasemia i wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna2.
Klinicznym objawem zaburzonej erytropoezy jest niedokrwistość, główna przyczyna zachorowalności na całym świecie. Objawy niedokrwistości wahają się od zmęczenia, duszności i zawrotów głowy po stany zagrażające życiu, takie jak niewydolność serca i zatrzymanie akcji serca3. Ponieważ niedokrwistość dotyka 1,8 miliarda ludzi na całym świecie4, modelowanie erytropoezy ex vivo w celu zbadania tych stanów i ich mechanizmów leżących u ich podstaw pozostaje globalnym priorytetem. Opisana tutaj metoda ma na celu zapewnienie prostego i solidnego modelu do badania różnicowania erytroidalnego zarówno zdrowych, jak i chorych. Model ten pozwala na rozbiór ról poszczególnych genów w tym procesie i umożliwia testowanie związków, które mogą przynieść korzyści pacjentom z anemią. Historycznie rzecz biorąc, modelowanie nieefektywnej erytropoezy wiązało się z wieloma wyzwaniami, w tym z niedoborem komórek macierzystych w niektórych chorych szpikach kostnych i trudnościami w naśladowaniu niszy szpiku kostnego.
Poprzednie badania używały podobnych lub bardziej złożonych protokołów; na przykład, Bondu i wsp. używali koktajlu cytokin, w tym erytropoetyny (EPO), czynnika komórek macierzystych (SCF) i interleukiny-6 (IL6) przez 4 dni przed usunięciem IL6 z koktajlu różnicowania erytroidalnego, natomiast Yip i wsp. dodali EPO do swojego koktajlu cytokin dopiero po 7 dniach płynnej hodowli. Elvarsdóttir i in. opracowali trójwymiarowy (3D) model hodowli komórek CD34+, aby ułatwić najwyższą ekspansję i dojrzewanie komórek erytroidalnych, w tym generowanie wysp erytroblastycznych i wyłuszczonych erytrocytów, które są ważne dla badania zjawisk takich jak syderoblasty pierścieniowe5,6,7,8. Protokół ten wykorzystuje tylko trzy cytokiny podczas namnażania komórek (tj. SCF, trombopoetynę [TPO] i kinazę tyrozynową 3 podobną do FMS [FLT3]) i trzy cytokiny utrzymywane przez cały proces różnicowania (tj. EPO, IGF1 i SCF). Jednym z kluczowych kryteriów wspólnych dla tych różnych badań jest wykorzystanie komórek CD34+. Chociaż pochodzenie tych komórek jest różne, są one konsekwentnie stosowane w tych różnych protokołach. Źródła mogą wahać się od nieinwazyjnego pobierania UCB do bardziej inwazyjnych procedur w celu uzyskania próbek szpiku kostnego dla dorosłych, które można pobrać od pacjentów zmobilizowanych za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF) lub po nakłuciu szpiku kostnego. Ogólnie rzecz biorąc, modele hodowli płynnych są przenoszone przez 14 dni, podczas gdy modele 3D mogą utrzymywać komórki przez dłuższy czas. Protokoły te są niezbędne do modelowania chorób genetycznych i zakłóceń erytropoezy. Podejścia genetyczne, takie jak knockdowny krótkiego spinki RNA (shRNA), mogą być wykorzystane do wyciszenia interesujących genów i zbadania ich roli w erytropoezie. Wpływ wyciszania genów może być następnie monitorowany na różnych etapach różnicowania, dostarczając ex vivo ludzki model produkcji czerwonych krwinek do badania niedokrwistości zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Protokół ten obejmuje transdukcję komórek krwi pępowinowej CD34 + za pomocą shRNA, które konstytutywnie wyrażają gen reporterowy, taki jak wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), umożliwiając sortowanie próbek przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Komórki są następnie inkubowane w pożywkach różnicujących przez 2 tygodnie i monitorowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej i barwienia immunochemicznego.

<table><tbody><tr><td>2x Koraliki HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Przeciwciało PerCP Cy5.5</td><td>Przeciwciało BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX medium montażowe&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Giemsa</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki EPO</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki ligand Flt-3</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki G-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IGF1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki IL-6</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki TPO</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maj-Grunwald rozwiązanie&nbsp;</td><td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 Skaner o wysokiej przepustowości&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Medium Średnie</td><td>technologie komórek macierzystych</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Erytropoeza, niezwykle dynamiczny i wydajny proces odpowiedzialny za generowanie dziennego limitu czerwonych krwinek (około 280 ± 20 miliardów komórek dziennie), jest kluczowa dla utrzymania indywidualnego zdrowia. Każde zakłócenie tej ścieżki może mieć poważne konsekwencje, prowadząc do problemów zdrowotnych. Według Światowej Organizacji Zdrowia szacuje się, że 25% światowej populacji ma objawy niedokrwistości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować ludzkie komórki erytroidalne zarówno in vitro, jak i krwiotwórcze komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) ze źródeł takich jak krew pępowinowa (UCB) lub krew pobrana od zdrowych dawców i ex vivo z HSPC wyizolowanymi ze szpiku kostnego pacjenta. Korzystając z podejścia genetycznego, interesujące geny mogą być modulowane w HSPC, a ich wpływ na erytropoezę może być monitorowany na różnych etapach procesu różnicowania. Metoda ta pozwala na badanie przesiewowe związków zaburzających, wzmacniających lub ratujących zdolność HSPC do różnicowania się w dojrzałe komórki erytroidalne oraz na badanie roli genów będących przedmiotem zainteresowania w procesie różnicowania erytroidalnego.

Komórki CD34+ z krwi pępowinowej lub szpiku kostnego są najpierw rozmrażane, stymulowane i transdukowane shRNA wykazującym ekspresję GFP (Rycina 1A). Komórki CD34+GFP+ są sortowane 4 dni po transdukcji zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną na Rycynie 1B. Reprezentatywne wyniki wykazały dojrzewanie komórek CD34+ po transdukcji i sortowaniu metodą FACS. Komórki są analizowane (1) za pomocą cytometrii przepływowe...

Modelowanie erytropoezy daje cenną szansę na zrozumienie biologicznego znaczenia aktorów w tym procesie i ocenę nowych podejść terapeutycznych, które mogą złagodzić wady różnicowania. W tym miejscu opisujemy prostą i niezawodną metodę skutecznego różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ ex vivo.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

Nasze badania koncentrują się na białaczce, a konkretnie na zespołach mielodysplastycznych lub neoplazji mielodysplastycznej. Jest to choroba komórek macierzystych wywodząca się z hematopoetycznych komórek macierzystych. Wpływa na różne linie komórek krwi, szczególnie linię erytroidalną, która jest odpowiedzialna za produkcję krwinek serca.Przerwanie tej linii może prowadzić do niedokrwistości, która jest powszechnie obserwowana u pacjentów z MDS. Metoda, którą przedstawiamy w tym artykule, pozwala na solidną i uproszczoną metodę oceny skuteczności ludzkich erytroblastów in vitro po modyfikacji genów lub leczeniu farmakologicznym. Hematopoetyczne komórki macierzyste są obecne od narodzin do ostatniej chwili naszego życia.W naszym organizmie nie ma już tkanki proliferacyjnej, której każdego dnia produkuje się biliony komórek. Wciąż jest tak wiele rzeczy do zrozumienia, więc będziemy nadal badać te niesamowite komórki w zdrowych tkankach aminowych, kładąc duży nacisk na proteostazę i biologię RNA. Na początek rozmrozić 100 000 komórek CD34 + UCB, zanurzając fiolkę na 30 sekund w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.Dodać kroplami jeden mililitr pożywki do rozmrażania, a nas

a-comprehensive-pipeline-to-assess-efficiency-human-erythropoiesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Prezentujemy system hodowli erytroblastów wątroby in in vitro u myszy płodowej, który analizuje wczesne i późne stadia końcowej erytropoezy. System ten ułatwia analizę funkcjonalną określonych genów na różnych etapach rozwoju.

System hodowli wątroby płodu myszy do analizy funkcji genów docelowych we wczesnych i późnych stadiach erytropoezy terminalnej

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Tutaj prezentujemy techniki pomiaru deformowalności krwinek czerwonych i heterogeniczności komórkowej za pomocą ektacytometrii. Techniki te mają zastosowanie do ogólnych badań odkształcalności krwinek czerwonych i szczegółowych badań chorób krwi charakteryzujących się obecnością w krążeniu zarówno sztywnych, jak i odkształcalnych krwinek czerwonych, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa.

Pomiar odkształcalności i niejednorodności krwinek czerwonych we krwi za pomocą ektacytometrii

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje procedurę indukowania różnicowania ludzkich komórek macierzystych i prądkotworzycznych krwiotwórczych pochodzących z szpiku kostnego pacjenta i komórek jednojądrzasty składnik krwi obwodowej. Test wykorzystuje półsztywne medium kulturowe wspierające zobowiązanie do linii erytrocytarnej i mieloidalnej oraz zawiera standaryzowane metryki umożliwiające reprodukowalną klasyfikację kolonii w celu charakteryzacji przedklinicznego leku.

Test jednostek formujących kolonie przystosowany dla pochodzących od pacjenta komórek rdzenia kostnego i obwodowej krwi jednojądrzastej

Poznaj metodę oceny erytropoezy in vitro i ex vivo przy użyciu komórek CD34+ z krwi pępowinowej. Technika ta umożliwia badanie różnicowania erytroblastów oraz ocenę skuteczności terapii w zespołach mielodysplastycznych.

Kompleksowy proces oceny skuteczności erytropoezy u ludzi in vitro i ex vivo

Przeglądaj więcej filmów