Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów
4 października 2024
Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.
Nasze badania koncentrują się na zbiorowisku mikrobiomu u komarów w skali poszczególnych narządów. Za pomocą analizy metagenomicznej badamy symbionty w jajnikach, jelicie środkowym i gruczołach ślinowych. Zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas sekcji, staramy się zbadać, w jaki sposób te drobnoustroje wpływają na biologię komarów na pierwszej skali i dodać ukierunkowane metody kontroli.
Praca z poszczególnymi narządami jest naprawdę złożona, ponieważ musimy pracować nad nimi w stanie nienaruszonym, nie powodując żadnych uszkodzeń lub zanieczyszczeń między narządami. Poza tym dysponujemy tylko niewielką ilością materiału genetycznego. Badania nad komarami-wektorami zazwyczaj koncentrują się na organizmie ściennym.
Jednak interakcje między wirusami, bakteriami i komarami mogą się różnić w zależności od konkretnego narządu. Poprzez dokładne preparowanie i izolowanie narządów komarów, możemy badać każdy przedział indywidualnie i lepiej zrozumieć, jak funkcjonują te interakcje. Na początek uzyskaj wysterylizowane powierzchniowo komary w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej PBS.
Przenieś oczyszczonego komara na kroplę sterylnego 1X PBS umieszczoną na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą pęsety przytrzymaj klatkę piersiową komara, aby zapobiec jego ruchom. Następnie umieść igłę na szyi tuż pod głową i delikatnie pociągnij za głowę komara, aby oddzielić ją od klatki piersiowej.
Za pomocą igły przeciąć gruczoły ślinowe na poziomie przewodu ślinowego. Pobrać gruczoły za pomocą igły i umieścić je w nowej kropli PBS w celu spłukania. Następnie, za pomocą igły, pobierz gruczoły ślinowe.
Połóż komara na plecach, aby rozpocząć preparowanie jajników. Za pomocą kleszczy przytrzymaj komara za klatkę piersiową, aby zapobiec ruchom i nakłuj igłą trzeci segment brzucha, zaczynając od dołu. Przekłuwając trzeci segment brzucha, pociągnij brzuch w dół, aby go otworzyć i odsłonić narządy wewnętrzne.
Usuń wszelkie pozostałe części egzoszkieletu komara, aby ułatwić uwolnienie narządu. Wyjmij oba jajniki za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i umieść je w nowej kropli sterylnego PBS na szkiełku mikroskopowym w celu spłukania. Przenieś przepłukane jajniki do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej 100 mikrolitrów buforu konserwującego.
Następnie, za pomocą sterylnej igły, oddziel jelito środkowe od jelita przedniego i tylnego. Usuń kanaliki Malpighiego z jelita środkowego i umieść je w nowej kropli sterylnego PBS, aby je wypłukać i zapobiec zanieczyszczeniu. Następnie przenieś jelito środkowe do kolejnej kropli sterylnego PBS.
Za pomocą kleszczy otwórz jelito środkowe, aby uwolnić bakterie. Odpipetuj wszystkie bakterie zawierające PBS i tkankę jelita środkowego do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 100 mikrolitrów buforu konserwującego. Dodaj pięć mikrolitrów PBS na ten sam obszar szkiełka mikroskopowego, w którym wcześniej umieszczono jelito środkowe.
Odpipetuj PBS z powrotem do tej samej 1.5-mililitrowej probówki, aby pobrać wszelkie bakterie, które mogły przykleić się do szkiełka. Na koniec użyj sterylnych kleszczy, aby chwycić tuszę komara i przechowywać ją w wysterylizowanej 1,5 mililitrowej probówce zawierającej 100 mikrolitrów buforu konserwującego.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje społeczności mikrobiomu w poszczególnych narządach samic komarów, koncentrując się na jajnikach, jelicie środkowym i gruczołach ślinowych. Dzięki zastosowaniu analizy metagenomicznej oraz ulepszonych technik sekcji, celem badań jest zapobieganie kontaminacji krzyżowej oraz wyjaśnienie roli symbiontów mikrobiologicznych w biologii komarów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Społeczności mikrobiologiczne u komarów
- Strategie biologicznej kontroli wektorów
- Analiza metagenomiczna
Wstęp
- Wiele symbiontów komarów nie nadaje się do hodowli in vitro.
- Badania zazwyczaj koncentrują się na całych organizmach, pomijając oddziaływania specyficzne dla poszczególnych organów.
- Zrozumienie tych oddziaływań jest kluczowe dla opracowania ukierunkowanych metod kontroli wektorów.
Zastosowane metody
- Disekcja samic komarów w celu izolacji organów
- Analiza metagenomiczna społeczności mikrobiologicznych
- Zapobieganie zanieczyszczeniom krzyżowym podczas disekcji
Główne wyniki
- Wyizolowane próbki organów do analizy mikrobiomu
- Scharakteryzowane symbionty specyficzne dla każdego organu
- Pogłębione zrozumienie roli drobnoustrojów w biologii komarów
Wnioski
- Badanie przedstawia wykonalną metodę prowadzenia analiz mikrobiomu na poziomie organów u komarów.
- Podejście to ma istotne znaczenie dla badań nad zwalczaniem wektorów oraz biologią komarów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Disekcjonowanie na poziomie organów oraz analiza metagenomiczna tkanek komarów umożliwiają precyzyjne mapowanie składu i funkcji mikrobiomu, co bezpośrednio wpływa na strategie kontroli wektorów. Podejście to pozwala rozwiązać problem niehodowalnych symbiontów i wspiera opracowywanie celowanych interwencji poprzez wyjaśnienie organowo-specyficznych ról drobnoustrojów. Zwiększona rozdzielczość na poziomie organów podnosi pewność predykcyjną w badaniach translacyjnych nad biokontrolą oraz w ustalaniu priorytetów portfela projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie wpływu mikrobów na biologię komarów na poziomie organów.
- Wspiera walidację funkcjonalną roli symbiontów w kompetencji wektora i transmisji patogenów.
- Ułatwia analizę mechanistyczną poprzez izolację interakcji specyficznych dla danego organu.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów mikrobiologicznych w procesach zwalczania wektorów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, wolne od kontaminacji próbki organów do dalszych analiz metagenomicznych.
- Standaryzuje przygotowanie próbek w celu zapewnienia powtarzalności i ilościowego profilowania mikrobiomu.
- Umożliwia skalowalny screening społeczności mikrobiologicznych w wielu organach komarów.
- Wspiera wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji mikrobiologicznych w zarządzaniu wektorami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Powiązana odkrycia mikrobiologiczne z układami organów istotnymi dla przebiegu choroby, takimi jak gruczoły ślinowe i jelito środkowe.
- Zapewnia ciągłość procesu – od odkrycia powiązań mikrobiologicznych po przedkliniczną walidację strategii biocontroli.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez wyjaśnienie specyficznych dla danego przedziału funkcji mikrobiologicznych istotnych dla transmisji patogenów.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje proces od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę mikrobiomu, począwszy od izolacji narządów, aż po charakterystykę metagenomiczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących specyficznych dla organów ról mikrobiologicznych i ich wpływu na kompetencję wektora.
- Przesiewanie: Dostarcza odtwarzalne, ilościowe dane o mikrobiomie na poziomie organów w celu priorytetyzacji kandydatów.
- Analityka: Zapewnia genomy zmontowane z metagenomów (MAGs) oraz ilościowe odczyty do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z przedkliniczną walidacją biokontroli poprzez mapowanie funkcji mikrobiologicznych w organach istotnych dla przebiegu choroby.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia zstandardyzowany, możliwy do ponownego wykorzystania protokół do badań mikrobiomu na poziomie organów dla różnych gatunków wektorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mikrobiomem wektorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów analizy mikrobiomu na poziomie organów.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w zakresie wyboru celów mikrobiologicznych i opracowywania strategii kontroli wektorów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do biokontroli z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o specyficzne dla organów funkcje mikrobiologiczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach sterylnej dyssekcji i izolacji narządów.
- Wymaga dostępu do sekwencjonowania metagenomicznego i infrastruktury bioinformatycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja między zespołami w celu zapobiegania kontaminacji.
- Może wymagać adaptacji dla różnych gatunków komarów lub wielkości narządów.
- Ograniczona ilość materiału genetycznego z jednego narządu może ograniczać dalsze analizy.
