Technika pływania poziomego w kształcie litery U do przygotowywania wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA

[Narrator] Badania koncentrują się na metodzie optymalizacji nasienia, mającej na celu ustalenie, czy technika UHS oferuje korzyści w przygotowywaniu wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA. Technologia mikroprzepływowa została wykorzystana do optymalizacji selekcji wysokiej jakości plemników o niższym DFI. Głównym ograniczeniem metody UHS jest jej duże poleganie na zdolności do samodzielnego pływania wysokiej jakości plemników. Metoda UHS nie jest odpowiednia dla pacjentów z całkowicie nieruchomymi plemnikami. Thigmotaxis odgrywa kluczową rolę w separacji plemników. Orbita w kształcie litery U ma dłuższą granicę, co ułatwia swobodny przepływ wysokiej jakości plemników, umożliwiając ich całkowite oddzielenie od nieruchomych plemników, zanieczyszczeń i innych składników. W porównaniu z techniką DGC, metoda pasowa UHS wymaga mniejszej liczby czynności manualnych dla personelu laboratoryjnego, a wysokiej jakości plemniki uzyskane metodą pasa UHS nie są poddawane wielokrotnym procedurom wirowania, co skutkuje niższym DFI. Na początek dodaj 20 mikrolitrów pożywki nawozowej do naczynia operacyjnego, aby utworzyć ścieżki w kształcie litery U. Zassać 10 mikrolitrów pożywki nawozowej za pomocą pipety, aby utworzyć okrągłą kroplę w lewym punkcie początkowym ścieżki w kształcie litery U. Używając pożywki nawozowej, utwórz dwie krople buforowe o wielkości 10 mikrolitrów każda w odstępach wzdłuż lewej środkowej części toru w kształcie litery U. Połącz wszystkie kropelki z pożywką nawozową, aby utworzyć ciągłą ścieżkę. Użyj 2,5 mikrolitra poliwinylopirolidonu lub PVP, aby utworzyć długi pasek kropli cieczy po prawej stronie toru w kształcie litery U. Przygotuj sześć mikrokropel, używając pożywki do przetwarzania oocytów po prawej stronie paska PVP. Dodaj siedem mililitrów oleju hodowlanego do naczynia, upewniając się, że olej całkowicie pokrywa najwyższy punkt kropel. Umieść naczynie w inkubatorze z 6% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc, aby uzyskać równowagę. Po pobraniu nasienia należy zmierzyć jego objętość metodą ważenia, zapewniając dokładność do 0,01 mililitra. Umieść próbkę nasienia w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 30 minut i odessaj ją do jednorazowej pipety z tworzywa sztucznego o szerokim otworze. Jeśli nasienie nie upłynni się w ciągu 60 minut, dodaj równą ilość pożywki nawozowej. Kilkakrotnie wdychaj i wydychaj mieszaninę za pomocą jednorazowej plastikowej pipety do przenoszenia, aż do całkowitego upłynnienia. Zmierz wartość pH nasienia za pomocą precyzyjnej bibuły testowej pH w zakresie od sześciu do 10. Weź 10 mikrolitrów całkowicie upłynnionego nasienia i wlej je do komory liczenia plamek żółtych. Oceń ruchliwość plemników w polu 200X za pomocą mikroskopu optycznego. Dodać pięć mikrolitrów nasienia do mikrokropelki pożywki do nawożenia w lewym punkcie początkowym toru w kształcie litery U w naczyniu operacyjnym ICSI. Dostosuj kąt i położenie igły do trzymania oocytów i igły do wstrzykiwań pod soczewką obiektywu 4X. Po zweryfikowaniu konfiguracji przenieś wybraną komórkę jajową do mikrokropelki pożywki do przetwarzania oocytów w naczyniu operacyjnym ICSI. Umieść naczynie operacyjne zawierające oocyty na gorącym stoliku przygotowanego operatora mikroskopu. Po ustawieniu ostrości opuść igłę iniekcyjną do paska PVP czaszy operacyjnej ICSI. Wsunąć igłę do wstrzykiwań w długi pasek po prawej stronie toru w kształcie litery U i pobrać plemniki wysokiej jakości. Przenieś plemniki do paska PVP po prawej stronie i umieść nasienie na dnie naczynia operacyjnego. Delikatnie wcisnąć igłę do wstrzykiwań w środkową lub dolną część ogona plemnika. Szybko odciągnij igłę do wstrzykiwań i podrap nasienie, aby je unieruchomić. Teraz wdychaj plemniki od ogona do głowy do igły do wstrzykiwań. Powoli wstrzyknij plemniki do cytoplazmy oocytu i inkubuj wstrzyknięty oocyt. Dodaj 1,5 mililitra roztworu wirującego o gradiacji gęstości 45% do 15-mililitrowej sterylnej probówki ze stożkowym dnem. I powoli dodaj 1,5 mililitra roztworu wirującego o gradiacji gęstości 90% na dno roztworu o gradiacji 45%. Teraz dodaj skroplone nasienie do gradientowego roztworu wirującego i wiruj probówkę o sile 300 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu zbierz około 0,5 mililitra pozostałego osadu plemników i wymieszaj go z trzema mililitrami pożywki do zapłodnienia. Odwirować mieszaninę w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować supernatant, pozostawiając około 0,2 mililitra osadu, a następnie wstrząsnąć i wymieszać w celu ponownego zawieszenia osadu. Na koniec policz stężenie i ruchliwość plemników przed przechowywaniem próbki w inkubatorze z 6% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Umieść probówkę zawierającą 25 mikrolitrów roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia w łaźni wodnej o temperaturze od 90 do 100 stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Następnie przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut, aż temperatura się ustabilizuje. Dodaj od trzech do 10 mikrolitrów nasienia do probówek agarozowych o niskiej temperaturze topnienia i dokładnie wymieszaj. Upuść 30 mikrolitrów mieszaniny na wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe w pozycji poziomej. Po przykryciu umieść wstępnie obrobione szkiełko szkiełkowe w lodówce w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza na cztery minuty, upewniając się, że pozostaje w pozycji poziomej. Wyjmij szkiełko z lodówki i delikatnie zsuń ze szkła nakrowego. Szybko zanurz wstępnie obrobione szkiełko szklane w roztworze denaturującym na siedem minut. Zdejmij szkiełko i ustaw go pionowo. Następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar kropelek wody bez dotykania obszaru próbki. Umyj szkiełko w wodzie destylowanej przez pięć sekund. Szkiełko należy zanurzyć szeregowo w roztworach odpowiednich dla określonego okresu. Następnie, trzymając szkiełko szkiełkowe poddane obróbce poziomo, dodaj około jednego mililitra zmieszanego roztworu barwnika na szkiełko. Po barwieniu przez pięć minut delikatnie spłucz szkiełko wodą destylowaną 10 do 15 razy. Wysokiej jakości plemniki o dobrej ruchliwości progresywnej płynnie pływały wzdłuż krawędzi toru w kształcie litery U, ułatwiając igłę do wstrzykiwania plemników docytoplazmatycznych do chwytania ich indywidualnie. Podczas gdy dobre plemniki uzyskano przy użyciu obu metod, wskaźnik fragmentacji DNA wysokiej jakości plemników oddzielonych metodą wirowania w gradiacji gęstości był znacznie wyższy w porównaniu z metodą pływania poziomego w kształcie litery U.