Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy
1 listopada 2024
Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.
Nasze laboratorium bada sieci elektryczne stojące za złożonymi zaburzeniami mózgu, koncentrując się na tym, jak aktywność mózgu jest koordynowana w różnych stanach. Dlatego opracowaliśmy to podejście analityczne do automatyzacji danych z zeza, które lepiej ułatwia zapisy okołoneurofizjologiczne z zachowaniami zeza związanymi z migreną. W badaniach nad migreną zaczyna się otwierać nowy obszar badań, ponieważ modele migreny u gryzoni są coraz częściej wykorzystywane do badania podstawowych substratów obwodów nerwowych w migrenie i identyfikowania bardziej centralnych mechanizmów przyczyniających się do stanów podobnych do migreny.
Nasz protokół wypełnia lukę badawczą w zakresie obiektywnego ilościowego określania reakcji podobnych do bólu w sposób, który można połączyć z pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Nasza metoda przedstawia szeroko dostępny sposób jednoczesnego ilościowego określania spontanicznych reakcji na ból i leżącej u jego podstaw aktywności elektrycznej sieci mózgowej w rozdzielczości poniżej sekundy. Głównym celem lub nadzieją tej pracy jest to, że stanie się ona katalizatorem wykorzystania pomiaru aktywności mózgu w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów migrenowych na modelach zwierzęcych.
Badamy, jak aktywność sieci elektrycznej w całym mózgu zmienia się w czasie podczas epizodów podobnych do migreny. Naszym celem jest zarówno obserwacja, jak aktywność migreny ewoluuje w mózgu w czasie, jak i próba opracowania opartych na mózgu markerów aktywności migreny w celu lepszego testowania terapii na modelach gryzoni. Aby rozpocząć, rozłóż sprzęt i zainstaluj oprogramowanie do procedury DeepLabCut lub DLC.
Aby utworzyć środowisko, przejdź do folderu, w którym zostało pobrane oprogramowanie DLC. Użyj polecenia zmień katalog, nazwa folderu cd. Uruchom pierwsze polecenie, conda env create f DEEPLABCUT.yaml.
Następnie wpisz conda activate Deeplabcut, aby włączyć środowisko. Następnie otwórz graficzny interfejs użytkownika za pomocą pythona m deeplabcut. Po otwarciu interfejsu kliknij Utwórz nowy projekt u dołu interfejsu.
Nazwij projekt, aby ułatwić jego późniejszą identyfikację. Wprowadź nazwę eksperymentatora i sprawdź sekcję lokalizacji, aby sprawdzić, gdzie projekt zostanie zapisany. Wybierz pozycję Przeglądaj foldery, aby zlokalizować filmy wideo do trenowania modelu, a następnie wybierz pozycję Kopiuj filmy do folderu projektu, jeśli filmy wideo powinny pozostać w oryginalnym katalogu.
Kliknij przycisk Utwórz, aby wygenerować nowy projekt. Po utworzeniu modelu wybierz opcję edytuj konfigurację. yaml, a następnie Edytuj, aby otworzyć plik ustawień konfiguracji.
Zmodyfikuj części ciała tak, aby obejmowały wszystkie części oka do śledzenia. Dostosuj liczbę klatek do wybrania, aby uzyskać łącznie 400 klatek na film szkoleniowy. Zmień rozmiar kropki na 6, aby upewnić się, że domyślny rozmiar etykiety jest wystarczająco mały, aby można go było dokładnie umieścić wokół krawędzi oka.
Po skonfigurowaniu przejdź do karty Wyodrębnij ramki w graficznym interfejsie użytkownika i wybierz pozycję Wyodrębnij ramki u dołu. Przejdź do karty Ramki etykiet i wybierz opcję Ramki etykiet. W nowym oknie znajdź foldery dla każdego z wybranych filmów szkoleniowych i wybierz pierwszy folder, aby otworzyć nowy interfejs etykietowania.
Oznacz punkty zdefiniowane podczas konfiguracji dla każdej klatki wybranego wideo. Po oznaczeniu wszystkich klatek zapisz etykiety i powtórz ten proces dla następnego filmu. Aby dokładnie oznaczyć zeza, użyj dwóch punktów w pobliżu największego wierzchołka oka.
Aby utworzyć zestaw danych treningowych, przejdź do karty Train network (Sieć pociągów) i zainicjuj polecenie Train Network (Sieć trenowania). Po zakończeniu trenowania sieci przejdź do pozycji Evaluate Network (Oceniaj sieć) i wybierz pozycję Evaluate Network (Oceniaj sieć). Aby przeanalizować filmy wideo, przejdź do karty Analizowanie filmów i wybierz pozycję Dodaj więcej filmów, aby wybrać filmy.
Wybierz opcję Zapisz wyniki jako plik CSV, jeśli dane wyjściowe w formacie CSV są wystarczające. Po wybraniu wszystkich filmów kliknij przycisk Analizuj filmy, aby rozpocząć proces analizy. Na koniec zastosuj makra, aby przekonwertować surowe dane na format wymagany do analizy odległości euklidesowej.
Model dokładnie wykrył zarówno przypadki bez zeza, jak i z zezem, oznaczając górny i dolny punkt powieki w celu obliczenia odległości euklidesowych. Średnia kwadratowa wartości błędu między punktami oznaczonymi ręcznie i oznaczonymi modelem wykazały minimalną zmienność po 300 klatkach, a średnie wartości prawdopodobieństwa dla prawidłowego wykrywania punktów przekroczyły 0,95 przy użyciu 400 klatek. Macierz pomyłek wykazała dodatnią wartość predykcyjną 96,96% i ujemną wartość predykcyjną 99,66% dla wykrywania zeza.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę automatycznego śledzenia mrugania oczami u gryzoni w czasie, kompatybilną z pomiarami neurofizjologicznymi. Ma on na celu wsparcie badaczy analizujących zaburzenia bólowe, takie jak migrena.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Neurofizjologia
Wstęp
- Bada sieci elektryczne leżące u podłoża zaburzeń mózgu.
- Koncentruje się na koordynacji aktywności mózgu podczas różnych stanów.
- Odnosi się do potrzeby obiektywnego ilościowego określania reakcji bólowych.
- Wykorzystuje modele gryzoni do badania mechanizmów migreny.
Cel badania
- W celu zautomatyzowania analizy danych dotyczących mrugania dla uzyskania lepszych zapisów neurofizjologicznych.
- W celu ilościowego określenia spontanicznych reakcji bólowych równocześnie z aktywnością mózgu.
- W celu umożliwienia pomiaru aktywności mózgu w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów nad migreną.
Zastosowane metody
- Zautomatyzowane śledzenie przymrużeń oczu u gryzoni.
- Synchronizacja czasowa danych o przymrużeniach z pomiarami neurofizjologicznymi.
- Analiza aktywności sieci mózgowej z rozdzielczością poniżej sekundy.
- Integracja danych behawioralnych i neurofizjologicznych.
Główne wyniki
- Przedstawiono metodę ilościowego pomiaru zachowań mrużenia oczu.
- Dostarczono informacji na temat substratów obwodów neuronalnych migreny.
- Umożliwiono badanie centralnych mechanizmów przyczyniających się do stanów przypominających migrenę.
- Umożliwiono jednoczesny pomiar odpowiedzi bólowych i aktywności mózgu.
Wnioski
- Protokół oferuje szeroko dostępną metodę dla badaczy.
- Rozwiązuje on istotną lukę badawczą w zakresie ilościowego pomiaru reakcji na ból.
- Posiada potencjał do rozwoju badań nad migreną w modelach zwierzęcych.
Często zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Kwantyfikacja spontanicznych zachowań bólowych w czasie rzeczywistym stanowi krytyczne wyzwanie dla neuronauki translacyjnej i odkrywania leków przeciwbólowych, szczególnie w modelach migreny i bólu głowy. Ten zautomatyzowany protokół detekcji mrużenia oczu umożliwia bezstronne, zsynchronizowane czasowo gromadzenie danych behawioralnych i neurofizjologicznych, co bezpośrednio wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność predykcyjną w przedklinicznych badaniach nad bólem. Integracja wskaźników behawioralnych z aktywnością sieci mózgowych usprawnia walidację punktów uchwytu i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących portfolio terapeutyków przeciwbólowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia obiektywną analizę ścieżek neuronalnych związanych z bólem w istotnych dla chorób modelach gryzoni.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie wyników behawioralnych z mechaniczną neurofizjologią.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do potencjalnych celów terapeutycznych poprzez redukcję błędu obserwatora w ocenie bólu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ułatwia przygotowanie walidowanych testów behawioralnych do przesiewu związków w modelach migreny.
- Standaryzuje kwantyfikację reakcji bólowych, zwiększając powtarzalność i niezawodność testów.
- Generuje ilościowe dane o rozdzielczości czasowej, odpowiednie dla przepływów pracy w wysokoprzepustowym przesiewie treści (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność punktów końcowych w badaniach behawioralnych z biomarkerami mechanistycznymi w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka podczas rozwoju terapii przeciwbólowych poprzez integrację danych behawioralnych i neuronowych.
- Wspiera opracowywanie markerów mózgowych do przedklinicznych testów skuteczności.
Integracja potoków i procesów roboczych
Niniejszy protokół łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez synchronizację danych behawioralnych i neurofizjologicznych w modelach bólu u gryzoni.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków w badaniach nad migreną.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty behawioralne do oceny związków.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze, zsynchronizowane czasowo dane umożliwiające solidne porównania statystyczne.
- Badania translacyjne: Łączy przedkliniczne fenotypy behawioralne z mechaniczną aktywnością mózgu w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, bezstronną metodę możliwą do adaptacji w różnych modelach bólu i neurobehawioralnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w leczeniu bólu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów behawioralnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w rurociągach terapeutycznych leczenia bólu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących bólu i migreny.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie neuronauki behawioralnej i neurofizjologii w celu optymalnego wdrożenia.
- Wymaga dostępu do oprogramowania DeepLabCut, systemów przechwytywania obrazu wideo oraz infrastruktury obliczeniowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów etykietowania i analizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest dostosowalna do różnych modeli gryzoni, lecz może wymagać dostrojenia parametrów dla różnych fenotypów bólu.
- Zależna od wysokiej jakości nagrań wideo i dokładnego etykietowania klatek w celu skutecznego trenowania modelu.
