Zautomatyzowana metoda mrużenia oczu dla zachowania synchronizacji czasu i dynamiki mózgu w badaniach bólu myszy
November 1st, 2024
Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego mrużenia oczu u gryzoni w czasie w sposób zgodny z blokowaniem czasu na pomiary neurofizjologiczne. Oczekuje się, że protokół ten będzie przydatny dla naukowców badających mechanizmy zaburzeń bólowych, takich jak migrena.
Nasze laboratorium bada sieci elektryczne stojące za złożonymi zaburzeniami mózgu, koncentrując się na tym, jak aktywność mózgu jest koordynowana w różnych stanach. Dlatego opracowaliśmy to podejście analityczne do automatyzacji danych z zeza, które lepiej ułatwia zapisy okołoneurofizjologiczne z zachowaniami zeza związanymi z migreną. W badaniach nad migreną zaczyna się otwierać nowy obszar badań, ponieważ modele migreny u gryzoni są coraz częściej wykorzystywane do badania podstawowych substratów obwodów nerwowych w migrenie i identyfikowania bardziej centralnych mechanizmów przyczyniających się do stanów podobnych do migreny.
Nasz protokół wypełnia lukę badawczą w zakresie obiektywnego ilościowego określania reakcji podobnych do bólu w sposób, który można połączyć z pomiarami mechanistycznymi, takimi jak neurofizjologia. Nasza metoda przedstawia szeroko dostępny sposób jednoczesnego ilościowego określania spontanicznych reakcji na ból i leżącej u jego podstaw aktywności elektrycznej sieci mózgowej w rozdzielczości poniżej sekundy. Głównym celem lub nadzieją tej pracy jest to, że stanie się ona katalizatorem wykorzystania pomiaru aktywności mózgu w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów migrenowych na modelach zwierzęcych.
Badamy, jak aktywność sieci elektrycznej w całym mózgu zmienia się w czasie podczas epizodów podobnych do migreny. Naszym celem jest zarówno obserwacja, jak aktywność migreny ewoluuje w mózgu w czasie, jak i próba opracowania opartych na mózgu markerów aktywności migreny w celu lepszego testowania terapii na modelach gryzoni. Aby rozpocząć, rozłóż sprzęt i zainstaluj oprogramowanie do procedury DeepLabCut lub DLC.
Aby utworzyć środowisko, przejdź do folderu, w którym zostało pobrane oprogramowanie DLC. Użyj polecenia zmień katalog, nazwa folderu cd. Uruchom pierwsze polecenie, conda env create f DEEPLABCUT.yaml.
Następnie wpisz conda activate Deeplabcut, aby włączyć środowisko. Następnie otwórz graficzny interfejs użytkownika za pomocą pythona m deeplabcut. Po otwarciu interfejsu kliknij Utwórz nowy projekt u dołu interfejsu.
Nazwij projekt, aby ułatwić jego późniejszą identyfikację. Wprowadź nazwę eksperymentatora i sprawdź sekcję lokalizacji, aby sprawdzić, gdzie projekt zostanie zapisany. Wybierz pozycję Przeglądaj foldery, aby zlokalizować filmy wideo do trenowania modelu, a następnie wybierz pozycję Kopiuj filmy do folderu projektu, jeśli filmy wideo powinny pozostać w oryginalnym katalogu.
Kliknij przycisk Utwórz, aby wygenerować nowy projekt. Po utworzeniu modelu wybierz opcję edytuj konfigurację. yaml, a następnie Edytuj, aby otworzyć plik ustawień konfiguracji.
Zmodyfikuj części ciała tak, aby obejmowały wszystkie części oka do śledzenia. Dostosuj liczbę klatek do wybrania, aby uzyskać łącznie 400 klatek na film szkoleniowy. Zmień rozmiar kropki na 6, aby upewnić się, że domyślny rozmiar etykiety jest wystarczająco mały, aby można go było dokładnie umieścić wokół krawędzi oka.
Po skonfigurowaniu przejdź do karty Wyodrębnij ramki w graficznym interfejsie użytkownika i wybierz pozycję Wyodrębnij ramki u dołu. Przejdź do karty Ramki etykiet i wybierz opcję Ramki etykiet. W nowym oknie znajdź foldery dla każdego z wybranych filmów szkoleniowych i wybierz pierwszy folder, aby otworzyć nowy interfejs etykietowania.
Oznacz punkty zdefiniowane podczas konfiguracji dla każdej klatki wybranego wideo. Po oznaczeniu wszystkich klatek zapisz etykiety i powtórz ten proces dla następnego filmu. Aby dokładnie oznaczyć zeza, użyj dwóch punktów w pobliżu największego wierzchołka oka.
Aby utworzyć zestaw danych treningowych, przejdź do karty Train network (Sieć pociągów) i zainicjuj polecenie Train Network (Sieć trenowania). Po zakończeniu trenowania sieci przejdź do pozycji Evaluate Network (Oceniaj sieć) i wybierz pozycję Evaluate Network (Oceniaj sieć). Aby przeanalizować filmy wideo, przejdź do karty Analizowanie filmów i wybierz pozycję Dodaj więcej filmów, aby wybrać filmy.
Wybierz opcję Zapisz wyniki jako plik CSV, jeśli dane wyjściowe w formacie CSV są wystarczające. Po wybraniu wszystkich filmów kliknij przycisk Analizuj filmy, aby rozpocząć proces analizy. Na koniec zastosuj makra, aby przekonwertować surowe dane na format wymagany do analizy odległości euklidesowej.
Model dokładnie wykrył zarówno przypadki bez zeza, jak i z zezem, oznaczając górny i dolny punkt powieki w celu obliczenia odległości euklidesowych. Średnia kwadratowa wartości błędu między punktami oznaczonymi ręcznie i oznaczonymi modelem wykazały minimalną zmienność po 300 klatkach, a średnie wartości prawdopodobieństwa dla prawidłowego wykrywania punktów przekroczyły 0,95 przy użyciu 400 klatek. Macierz pomyłek wykazała dodatnią wartość predykcyjną 96,96% i ujemną wartość predykcyjną 99,66% dla wykrywania zeza.
Przegląd
Ten protokół zapewnia metodę śledzenia automatycznego migotania oczu u gryzoni w czasie, kompatybilną z neurofizjologicznymi pomiarami. Ma na celu wspomaganie badań nad zaburzeniami bólowymi takimi jak migreny.
Kluczowe komponenty badań
Obszar nauki
- Neuronauki
- Analiza zachowań
- Neurofizjologia
Tło
- Badanie sieci elektrycznych leżących u podstaw zaburzeń mózgu.
- Koncentracja na koordynacji aktywności mózgu w różnych stanach.
- Zagadnienie obiektywnej ilościowej oceny reakcji na ból.
- Wykorzystanie modeli gryzoni do badania mechanizmów migreny.
Cel badań
- Automatyzacja analizy danych dotyczących migotania oczu dla lepszych nagrań neurofizjologicznych.
- Ilościowa ocena spontanicznych reakcji na ból obok aktywności mózgu.
- Ułatwienie pomiaru aktywności mózgu w czasie rzeczywistym podczas eksperymentów z migreną.
Stosowane metody
- Automatyczne śledzenie migotania oczu u gryzoni.
- Synchronizacja danych migotania z pomiarami neurofizjologicznymi.
- Analiza aktywności sieci mózgowej z rozdzielczością poniżej sekundy.
- Integracja danych behawioralnych i neurofizjologicznych.
Główne wyniki
- Demonstracja metody ilościowej oceny zachowań migotania oczu.
- Wgląd w układy obwodów nerwowych związane z migreną.
- Ułatwienie badania centralnych mechanizmów przyczyniających się do stanów przypominających migrenę.
- Możliwość jednoczesnego pomiaru reakcji na ból i aktywności mózgu.
Wnioski
- Protokół oferuje szeroko dostępną metodę dla badaczy.
- Zajmuje się znaczącą luką w badaniach nad ilościową oceną reakcji na ból.
- Ma potencjał do postępów w badaniach nad migreną w modelach zwierzęcych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying spontaneous pain behaviors in real time is a critical challenge for translational neuroscience and pain drug discovery, especially for migraine and head pain models. This automated squint detection protocol enables unbiased, time-synced behavioral and neurophysiological data collection, directly supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in preclinical pain research. Integrating behavioral metrics with brain network activity advances target validation and informs portfolio decisions for pain therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective interrogation of pain-related neural pathways in disease-relevant rodent models.
- Supports functional target validation by linking behavioral outputs to mechanistic neurophysiology.
- Improves predictive confidence for candidate targets by reducing observer bias in pain assessment.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated behavioral assays for compound screening in migraine models.
- Standardizes quantification of pain responses, enhancing reproducibility and assay reliability.
- Generates quantitative, time-resolved outputs suitable for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral endpoints with mechanistic biomarkers for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of pain therapeutics by integrating behavioral and neural data.
- Supports development of brain-based markers for preclinical efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical validation by synchronizing behavioral and neurophysiological data in rodent pain models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification in migraine research.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative behavioral readouts for compound evaluation.
- Analytics: Outputs high-resolution, time-synced data enabling robust statistical comparisons.
- Translational Research: Connects preclinical behavioral phenotypes with mechanistic brain activity for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, unbiased method adaptable across pain and neurobehavioral models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pain target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of behavioral assays.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions and capital efficiency in pain therapeutic pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of pain and migraine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and neurophysiology for optimal deployment.
- Needs access to DeepLabCut software, video capture systems, and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of labeling and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to various rodent models but may require parameter tuning for different pain phenotypes.
- Dependent on high-quality video and accurate frame labeling for robust model training.
