Name: Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Poznaj test przesunięcia termicznego do badania wiązania ligandów z selenoproteiną O. Ta metoda fluorescencyjna pozwala analizować interakcje białkowe i identyfikować warunki stabilizujące do krystalografii białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. jest stypendystą W.W. Caruth, Jr. w dziedzinie badań biomedycznych, stypendystą Instytutu Zapobiegania i Badań nad Rakiem w Teksasie (CPRIT) oraz stypendystą Centrum Metabolizmu Minerałów i Badań Klinicznych im. Charlesa i Jane Pak. Prace te były wspierane przez NIH Grant K01DK123194 (AS), CPRIT Grant RR190106 (AS), Welch (I-2046-20200401) i Welch (I-2046-20230405).

1. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Użyj termocyklera, który może wykryć fluorescencję, takiego jak instrument RT-PCR, aby wykonać opisany protokół. W przypadku korzystania z SYPRO Orange, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, należy użyć trybu skanowania, który pozwala na wzbudzenie około 470 nm i detekcję emisji około 570 nm. Zaprogramować termocykler tak, aby utrzymywał próbkę w temperaturze 20 °C przez 2 minuty, a następnie wzrastał o 0,5 °C/1 min do 95 °C; mierzyć intensywność fluorescencji co 1 °C. 
	UWAGA: Zalecamy opcjonalny krok na końcu cyklu, aby przywrócić blok próbki do temperatury 20 °C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Każda reakcja zawiera cztery składniki: bufor, białko będące przedmiotem zainteresowania, dodatek i zewnętrzny barwnik fluorescencyjny. Zaprojektuj eksperyment tak, aby zawierał kontrole, takie jak brak białka, brak barwnika, białko bez dodatków i same dodatki, aby określić wszelką fluorescencję tła, która może mieć wpływ na interpretację wyników. Jeśli to możliwe, należy dołączyć kontrolę pozytywną, taką jak dodatek, o którym wiadomo, że wiąże i stabilizuje białko będące przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Do testu należy użyć oczyszczonego białka. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, użyj E. coli SelO, wyrażonego i oczyszczonego zgodnie z wcześniejszym opisem25,29. Krótko mówiąc, wyraź SelO oznaczone His-sumo (E. coli SelO ppSumo) w komórkach Rosetta DE3 i oczyść go za pomocą powinowactwa Ni2+-NTA. Rozszczepić znacznik His-sumo za pomocą proteazy Ulp i dalej oczyścić SelO za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.</li>
	<li>Fluorescencja SYPRO Orange będzie zależeć od jego interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ponieważ interakcje te będą się różnić w zależności od białka, zoptymalizuj stężenie białka i barwnika, aby uzyskać maksymalny stosunek sygnału do szumu sygnału fluorescencji. 
	UWAGA: SYPRO Orange nie jest kompatybilny z niektórymi białkami i dodatkami, takimi jak detergenty11,30. Dodatkowe barwniki zewnętrzne wymienione w 12 mogą być w razie potrzeby badane.</li>
</ol>
2. Określenie optymalnego stężenia barwnika (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Przygotuj 20 μl rozcieńczeń 50x, 40x, 30x, 20x i 10x SYPRO Orange z roztworu podstawowego, który jest dostarczany w dawce 5,000x w DMSO.</li>
	<li>Dozować 8 μl białka 6,25 μM rozcieńczonego w buforze TSA do sześciu oddzielnych dołków 384-dołkowej płytki PCR. 
	UWAGA: W naszym przykładzie użyliśmy następującego bufora TSA do przeprowadzenia rozcieńczeń: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT. Próbki można badać w trzech egzemplarzach w celu poprawy wiarygodności wyników.</li>
	<li>Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki. 
	UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.</li>
	<li>Dodać 1 μl każdego seryjnego rozcieńczenia roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka. Dodać 1 μl buforu bez barwnika do ostatniego dołka w celu kontroli bez barwnika.</li>
	<li>Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.</li>
	<li>Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.</li>
</ol>
3. Określenie optymalnego stężenia białka (Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Przygotować 20 μl seryjnych rozcieńczeń 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM i 1,56 μM białka przy użyciu buforu TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT).</li>
	<li>Dozować 8 μl seryjnych rozcieńczeń białka do pięciu oddzielnych dołków płytki 384-dołkowej.</li>
	<li>Dozuj bufor tylko w 6dołku jako kontrola bez białka.</li>
	<li>Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki. 
	UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.</li>
	<li>Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.</li>
	<li>Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.</li>
	<li>Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.</li>
</ol>
4. Przygotowanie eksperymentu TSA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
UWAGA: Po optymalizacji stężenia białka i barwnika SYPRO Orange, test może być przeprowadzony z dodatkiem pożądanych małych cząsteczek w celu analizy wiązania.
<ol>
	<li>Zdefiniuj liczbę warunków, biorąc pod uwagę kontrpróby i odpowiednie kontrole. 
	UWAGA: Na przykład przetestujemy wiązanie SelO z ośmioma warunkami w trzech egzemplarzach. Łącznie z kontrolami (bez dodatku, bez białka i bez barwnika) mamy 11 reakcji x 3 (potrójnie) = 33 reakcje ogółem.</li>
	<li>W oparciu o optymalne stężenie białka i barwnika obserwowane dla SelO, upewnij się, że każda reakcja zawiera 8 μl białka 6,25 μM, 1 μl dodatku i 1 μl 50x barwnika SYPRO Orange, co daje łącznie 10 μl objętości reakcji. Tak więc końcowe stężenie to 5 μM białka i 5x barwnik SYPRO Orange.</li>
	<li>Przygotować 288 μl 6,25 μM roztworu białkowego za pomocą buforu TSA. Ta objętość białkowego roztworu roboczego odpowiada za 36 reakcji (33 reakcje z dodatkowymi 10% dla zmian w pipetowaniu).</li>
	<li>Dozuj 8 μl białka 6,25 μM do oddzielnych dołków na płytce 384-dołkowej. Dozować bufor tylko w celu kontroli braku białka.</li>
	<li>Dodaj 1 μl małych cząsteczek o stężeniu 10x, aby uzyskać końcowy 1x. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, dodaj 1 μl z 20 mM MgCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Dozować bufor tylko w celu kontroli bez dodatków.</li>
	<li>Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.</li>
	<li>Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.</li>
	<li>Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.</li>
	<li>Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksport danych z urządzenia RT-PCR dla względnych jednostek fluorescencji (RFU) w odniesieniu do temperatury (°C).</li>
	<li>Użyj wybranego oprogramowania, aby wyodrębnić i wykreślić punkty danych do najwyższej intensywności zmierzonej dla każdej krzywej topnienia. Co ważne, potwierdź, że kontrole bez białka i bez barwnika wykazują niską fluorescencję tła bez zależnego od temperatury wzrostu fluorescencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A, B i tabela uzupełniająca S1). Wykonuj analizę danych za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak MoltenProt31 lub DSFWorld32.</li>
	<li>Określ temperaturę topnienia za pomocą Boltzmann Sigmoidal Fit dla danych. Temperatura topnienia (Tm) jest definiowana jako temperatura, w której obserwuje się 50% denaturację lub połowę maksymalnej intensywności (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Przesunięcie termiczne krzywej topnienia może sugerować dodatki stabilizujące lub destabilizujące. Aby obliczyć zmianę temperatury topnienia (Tm), należy skorzystać ze wzoru: Tm = Tm dodatek - Tm bufor. Wartość dodatnia opisuje stan stabilizujący lub dodatek oddziałujący; wartość ujemna opisuje stan destabilizujący (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
</ol>

High-Throughput Thermal Shift Assays for Protein-Ligand Interactions

<ol><li>Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genes%3A+Time+to+follow+the+roads+less+traveled%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Human genes: Time to follow the roads less traveled.</a> PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).</li>
<li>Kustatscher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+invitation+to+the+understudied+proteins+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An open invitation to the understudied proteins initiative.</a> Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).</li>
<li>Jones, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+genomics+consortium%3A+A+knowledge+platform+for+drug+discovery%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Rand+Health+Q%22%5BJournal%5D)">The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary.</a> Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).</li>
<li>Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efi-est%2C+efi-gnt%2C+and+efi-cgfp%3A+Enzyme+function+initiative+%28efi%29+web+resource+for+genomic+enzymology+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools.</a> J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).</li>
<li>Pace, C. N., Mcgrath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stabilization+of+lysozyme+to+thermal+and+guanidine+hydrochloride+denaturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.</a> J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Huynh, K., Partch, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+stability+and+ligand+interactions+by+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.</a> Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformationally+responsive+dyes+enable+protein-adaptive+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+performing+and+optimizing+differential+scanning+fluorimetry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).</li>
<li>Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+applications+of+differential+scanning+fluorimetry+in+early-stage+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery.</a> Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).</li>
<li>Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+fluorescent+dyes+as+tools+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.</a> Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).</li>
<li>Lucet, I. S., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ligand+binding+to+pseudokinases+using+a+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay.</a> Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+methodology+to+subclassify+pseudokinases+based+on+their+nucleotide-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties.</a> Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).</li>
<li>Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+analysis+of+thermofluor+data+can+readily+provide+quantitative+binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities.</a> Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).</li>
<li>Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-ligand+interactions+using+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry.</a> J Vis Exp. (91), e51809(2014).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).</li>
<li>Taujale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatic+challenges+and+advances+in+illuminating+the+druggable+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome.</a> Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).</li>
<li>Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+for+broke%3A+Targeting+the+human+cancer+pseudokinome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome.</a> Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).</li>
<li>Kung, J. E., Jura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+pharmacological+targeting+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).</li>
<li>Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+kinase-like+domain+in+a+selenoprotein%2C+widespread+in+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life.</a> PLoS One. 7 (2), e32138(2012).</li>
<li>Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+selenoprotein+o%3A+A+redox-active+mitochondrial+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein.</a> PLoS One. 9 (4), e95518(2014).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+ampylation+by+an+evolutionarily+conserved+pseudokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase.</a> Cell. 175 (3), 809-821 (2018).</li>
<li>Frese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alarmone+diadenosine+tetraphosphate+as+a+cosubstrate+for+protein+ampylation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).</li>
<li>Mostert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronucleotide+probes+reveal+a+diverging+specificity+for+ampylation+vs+umpylation+of+human+and+bacterial+nucleotide+transferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases.</a> Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ydiu+domain+modulates+bacterial+stress+signaling+through+Mn2%2B-dependent+umpylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation.</a> Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).</li>
<li>Mukherjee, M., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selenoprotein+o+substrates+using+a+biotinylated+atp+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog.</a> Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).</li>
<li>Kroeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edta+aggregates+induce+sypro+orange-based+fluorescence+in+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay.</a> PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).</li>
<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
<li>Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dsfworld%3A+A+flexible+and+precise+tool+to+analyze+differential+scanning+fluorimetry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data.</a> Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).</li>
<li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+thermofluor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).</li>
<li>Ribeiro, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+pseudoenzyme+classification%2C+evolution%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling.</a> Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).</li>
<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Test przesunięcia termicznego (TSA) służy jako skuteczna metoda badań przesiewowych interakcji białko-ligand, w tym tych z kofaktorami i inhibitorami. W tym protokole użyliśmy TSA do pomiaru wiązania pseudokinazy SelO z nukleotydami i kationami dwuwartościowymi. Nasze odkrycia pokazują, że SelO wykazuje zwiększoną stabilność termiczną w obecności ATP i Mg2+/Mn2+. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że homologi SelO z E. coli, S. cerevisiae i H. sapiens katalizują przenoszenie AMP z ATP do hydroksylowego łańcucha bocznego substratów białkowych25,29. Chociaż TSA dostarcza cennych informacji na temat wiązania nukleotydów, może nie zidentyfikować substratu in vivo. Inne cząsteczki, nie tylko substrat, mogą również wpływać na stabilność termiczną białka. Aby dokładnie zidentyfikować substrat, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak stężenie komórkowe i powinowactwo wiązania. Niemniej jednak TSA jest doskonałym narzędziem do badań przesiewowych szerokiego zakresu warunków, takich jak wiązanie małych cząsteczek, przy użyciu stabilizacji termicznej jako odczytu.
Użyteczność TSA wykracza poza jej zastosowanie w analizie wiązania małych cząsteczek z aktywnymi lub regulatorowymi miejscami białek. TSA znacząco przyczyniło się do biofizycznej charakterystyki białek, zapewniając warunki stabilizujące, które sprawiają, że białko bardziej sprzyja eksperymentom krystalograficznym. Warto zauważyć, że TSA oferuje kilka zalet, w tym prostą konfigurację i wysoką przepustowość przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów laboratoryjnych, takich jak płytki PCR i maszyny RT-PCR. Te zalety pozwalają na testowanie wielu warunków, które mogą być niewykonalne lub tak proste przy użyciu innych technik. W wielu badaniach wykorzystano TSA do pomiaru stabilności termicznej rekombinowanych białek z biblioteką związków w celu określenia optymalnych warunków krystalizacji białek19,33.
Włączenie odpowiednich kontroli jest konieczne, aby uniknąć błędnej interpretacji krzywych topnienia, przy czym autofluorescencja z płytek lub dodatków jest powszechnym problemem. TSA może nie być odpowiedni dla związków, które wykazują autofluorescencję lub wygaszają fluorescencję pomarańczy SYPRO. Potencjalnym rozwiązaniem jest badanie przesiewowe alternatywnych barwników opisanych w punkcie 12. Przedstawiony tutaj protokół TSA można łatwo dostosować do innych białek i dodatków będących przedmiotem zainteresowania. Dodatki nie ograniczają się wyłącznie do związków rozpuszczalnych w wodzie, jak wykazano w naszym protokole z nukleotydami i kationami dwuwartościowymi. Zamiast tego dodatki mogą obejmować szeroki zakres warunków, takich jak zmienne pH, ligandy lub leki rozpuszczone w DMSO8. Co więcej, preinkubacja liganda z białkiem może zapewnić bardziej powtarzalne wyniki poprzez zmniejszenie zakłóceń i artefaktów z barwnika. Dodatki, takie jak lipidy i detergenty, mogą prowadzić do wysokiej fluorescencji ze względu na ich interakcje z SYPRO Orange. Przykład krzywej denaturacji pokazano na rysunku 3A , który przedstawia niską fluorescencję tła w połączeniu ze znacznym wzrostem fluorescencji po denaturacji termicznej białka. Optymalne stężenie barwnika i białka zapewni maksymalny stosunek sygnału do szumu przy jednoczesnym utrzymaniu spójnego sygnału fluorescencji we wszystkich powtórzeniach.
TSA oferuje tę zaletę, że jest prostota z minimalną liczbą komponentów, zmniejszając w ten sposób liczbę zmiennych do optymalizacji. Krytyczne kroki obejmują określenie optymalnych stężeń zarówno barwnika, jak i białka. Ważne jest, aby pamiętać, że TSA wymaga oczyszczonego, "dobrze zachowującego się" białka. Białko i dodatek muszą być stabilne w buforze przy stężeniach stosowanych w TSA. Białka lub warunki, które są podatne na agregację lub oligomeryzację, mogą powodować błędne odczyty fluorescencji. Zagregowane lub niesfałdowane białka mogą początkowo wykazywać wysoką fluorescencję z niewielkim wzrostem po denaturacji. Oligomeryzacja białek może również powodować wiele stanów przejściowych, co komplikuje analizę10. Stężenie białka można precyzyjnie dostosować, aby zapobiec agregacji.
TSA jest kompatybilny z szeroką gamą i soli, co pozwala na optymalizację warunków stabilizacji białka i dodatku11. Objętości roztworów białek i dodatków mogą być dostosowane w celu przezwyciężenia ograniczeń stężeń białek i dodatków. Na przykład zamiast 10-krotnego roztworu stosowanego w reprezentatywnych wynikach można zastosować niższe stężenia dodatku, takie jak 5x. Warto zauważyć, że względna ilość białka i dodatku wymagana do przeprowadzenia testu jest niska, ponieważ 384-dołkowe płytki PCR mogą pomieścić objętości tak niskie, jak 10 μl całkowitej próbki.
Biorąc pod uwagę mocne strony TSA, idealnie nadaje się do badania niedostatecznie zbadanych białek, takich jak pseudokinazy. Pseudoenzymy to katalitycznie nieaktywne białka, które są strukturalnie homologiczne do aktywnych enzymów34. Ostatnie badania strukturalne i biochemiczne wykazały, że kilka pseudoenzymów jest enzymami aktywnymi, podczas gdy większość z nich pełni funkcje niekatalityczne35,36. Chociaż katalitycznie nieaktywne, pseudoenzymy są zaangażowane w różne choroby i odgrywają ważną rolę, w tym rusztowanie i modulację allosteryczną37. Jednak mechanizm działania i znaczenie funkcjonalne wielu pseudoenzymów są nieznane. Aktywność niektórych pseudoenzymów jest regulowana przez wiązanie ligandów, co skutkuje zwiększoną stabilnością termiczną, co jest związane ze zmianami konformacyjnymi białka14. Sugerujemy, że TSA jest cennym narzędziem do badania wiązania ligandów z pseudoenzymami w celu określenia optymalnego liganda dla aktywności funkcjonalnej.

Znaczna część ludzkiego proteomu pozostaje słabo scharakteryzowana. "Efekt światła ulicznego" opisany przez Dunhama i Kustatschera i in. odnosi się do zjawiska, w którym szeroko badanym białkom poświęca się więcej uwagi, pozostawiając niedobadane białka pomijane1,2. Czynniki przyczyniające się do tego efektu obejmują znaczenie biologiczne i znaczenie chorobowe niektórych białek. Co więcej, wcześniejsze badania, które oferują podstawową wiedzę, a także dostępność narzędzi do analizy funkcjonalnej, dodatkowo stymulują badania nad wysoko zbadanymi białkami1,2. Projekty takie jak Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium i Enzyme Function Initiative mają na celu scharakteryzowanie niedostatecznie badanych białek za pomocą proteomiki strukturalnej i funkcjonalnej2,3,4. Uzupełniającym podejściem do identyfikacji funkcji molekularnych niedostatecznie badanych białek jest badanie interakcji tych białek z małymi cząsteczkami w celu uzyskania cennych informacji na temat regulacji i swoistości substratów.
Wiązanie małych cząsteczek może zwiększyć stabilność termiczną białka5. Zjawisko to, znane jako stabilizacja konformacji indukowana przez ligand, często powoduje wzrost temperatury topnienia białka, co stanowi mierzalne wskazanie wiązania liganda6. Stabilność termiczną białka można zmierzyć za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej (DSF), znanej również jako Thermofluor lub test przesunięcia termicznego (TSA)7,8,9,10. W TSA próbka białka jest poddawana działaniu rosnących temperatur w obecności wrażliwego na środowisko barwnika o wysokiej klasie barwników<sup="xref">6. W miarę rozwoju i denaturacji białka barwnik wiąże się z odsłoniętymi hydrofobowymi obszarami białka i emituje fluorescencję. Zewnętrzne barwniki fluorescencyjne lub barwniki wrażliwe na środowisko nie mają wewnętrznej fluorescencji, a zamiast tego fluoryzują po interakcji z cząsteczką docelową9,11,12. Najczęściej stosowany barwnik, SYPRO Orange, oferuje kilka zalet, takich jak zwiększona stabilność i minimalna fluorescencja tła8,9,12. Warto zauważyć, że SYPRO Orange jest kompatybilny z systemami reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) ze względu na długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio około 470 nm i 570 nm. Ta unikalna funkcja pozwala na wykonywanie pomiarów o wysokiej przepustowości, dokładnych i czułych, które są kompatybilne z systemami detekcji fluorescencji powszechnie stosowanymi w systemach RT-PCR8.
TSA to wszechstronne narzędzie do badania interakcji białek z potencjalnymi kofaktorami lub lekami oraz do identyfikowania warunków stabilizujących krystalografię. Niektóre z jej zalet w porównaniu z innymi metodami przesiewowymi to względna prostota konfiguracji i wysoka przepustowość z płytkami 96- lub 384-dołkowymi13,14,15. Rozwój tej techniki był przełomowy dla badań nad odkrywaniem leków, oferując wygodę i umożliwiając badanie różnych dodatków, takich jak jony, ligandy i leki6,16. Co więcej, zdolności adaptacyjne TSA zachęciły naukowców do rozszerzenia jego użyteczności, ułatwiając pomiar powinowactwa wiązania wraz z testami przesiewowymi17,18. TSA jest skutecznym narzędziem w badaniach biologii strukturalnej do identyfikacji warunków, które sprzyjają stabilizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania do krystalizacji19. W związku z tym jego elastyczność i względna łatwość sprawiły, że TSA stała się podstawową techniką w charakterystyce białek. Tutaj użyjemy TSA do analizy wiązania metali i nukleotydów z niedostatecznie zbadaną pseudokinazą, selenoproteiną O (SelO), jako przykładem.
Kinazy są jedną z najbardziej pożądanych rodzin białek w odkrywaniu leków20. Przewiduje się, że około 10% ludzkich kinaz jest nieaktywnych i nazywa się je pseudokinazami, ponieważ brakuje im kluczowych reszt katalitycznych wymaganych do katalizy21,22. Selenoproteina O (SelO) jest ewolucyjnie konserwatywną pseudokinazą, która nie ma konserwatywnego asparaginianu w katalitycznym motywie HRD23. U eukariontów SelO lokalizuje się w mitochondriach i chroni komórki przed stresem oksydacyjnym24,25. Analizy strukturalne i biochemiczne pokazują, że SelO przenosi monofosforan adenozyny (AMP) z ATP do substratów białkowych w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylation25. Ostatnie badania wskazują, że enzymy katalizujące AMPylację mogą wiązać alternatywne nukleotydy, takie jak UTP in vitro26,27. Warto zauważyć, że badania wykazały, że homolog SelO z Salmonella typhimurium katalizuje białko UMPylacja, czyli transfer UMP, w sposób zależny od manganu28. Biorąc pod uwagę te intrygujące obserwacje, testujemy wiązanie SelO z ATP i UTP w obecności magnezu i manganu, służąc jako reprezentatywny przykład zastosowań TSA. Poniższy protokół można łatwo dostosować w celu optymalizacji i zbadania interakcji innych białek i dodatków będących przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno-5&trifosforanu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td><td>używany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA</td></tr><tr><td>Avanti J-15R z zespołem nośnika mikropłytek</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 384-Well PCR Płytki, cienkościenne, z listwą przypodłogową, przezroczyste/białe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania TSA</td></tr><tr><td>Tetrahydrat chlorku manganu (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania folii</td></tr><tr><td>uszczelniającej do PCR TSA Microseal "B", klej, optyczny</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Pomarańczowa plama białkowa w żelu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli trisodowej 5&trifosforanu</td><td>urydyny Sigma</td><td>Aldrich U6625-100MG</td><td>stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną o

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Definiowanie biologicznego znaczenia białek o nieznanych funkcjach stanowi istotną przeszkodę w zrozumieniu procesów komórkowych. Chociaż przewidywania bioinformatyczne i strukturalne przyczyniły się do badań nad nieznanymi białkami, walidacje eksperymentalne in vitro są często utrudnione ze względu na optymalne warunki i kofaktory wymagane do aktywności biochemicznej. Wiązanie kofaktora jest nie tylko niezbędne dla aktywności niektórych enzymów, ale może również zwiększać stabilność termiczną białka. Jednym z praktycznych zastosowań tego zjawiska jest wykorzystanie zmiany stabilności termicznej, mierzonej zmianami temperatury topnienia białka, do badania wiązania ligandów. 
Test przesunięcia termicznego (TSA) może być użyty do analizy wiązania różnych ligandów z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub znalezienia warunków stabilizujących do przeprowadzenia eksperymentów, takich jak krystalografia rentgenowska. Tutaj opiszemy protokół TSA wykorzystujący pseudokinazę, selenoproteinę O (SelO), w celu uzyskania prostej i wysokoprzepustowej metody testowania wiązania metalu i nukleotydu. W przeciwieństwie do kinaz kanonicznych, SelO wiąże ATP w odwróconej orientacji, aby katalizować transfer AMP do hydroksylowych łańcuchów bocznych białek w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylacja białek. Wykorzystując zmianę temperatur topnienia, dostarczamy kluczowych informacji na temat interakcji molekularnych leżących u podstaw funkcji SelO.

Eukariotyczne SelO składa się z N-końcowej sekwencji kierującej do mitochondriów, domeny przypominającej kinazę oraz silnie konserwowanej selenocysteiny na C-końcu białka23. Ten enzym zlokalizowany w mitochondriach koduje domenę pseudokinazy, która jest konserwowana od bakterii do ludzi23. Analiza strukturalna homologu SelO z Pseudomonas syringae ujawniła zmiany aminokwasowe w centrum aktywnym, które ułatwiają wiązanie ATP w orientacji odwróconej w porównaniu do kanonicznych kinaz25. W związku z tym SelO katalizuje AMPylację, a nie fosforylację, wielu białek zaangażowanych w sygnalizację antyoksydacyjną, aby chronić komórki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi i śmiercią komórkową25. Wykazano, że oprócz AMPylacji niektóre prokariotyczne i eukariotyczne AMPylazy katalizują również UMPylację27,28.
Użyliśmy oczyszczonego rekombinowanego białka SelO z E. coli w analizie TSA, aby zbadać wiązanie nukleotydów ATP i UTP do SelO w obecności kationów dwuwartościowych. Podobnie jak kanoniczne kinazy, SelO posiada motyw DFG, w którym asparaginian wiąże jon metalu w celu koordynacji nukleotydu w centrum aktywnym. Najpierw zoptymalizowaliśmy stężenie białka i barwnika dla uzyskania wiarygodnych pomiarów fluorescencji w TSA, ustalając, że optymalne stężenie E. coli SelO wynosi od 5 µM do 10&#160;µM&#160; przy zastosowaniu 5x SYPRO Orange (Rycina 2). Ponadto wykazaliśmy, że kontrolki bez białka, a także bez barwnika, wykazywały niski sygnał fluorescencji, który nie reagował na wzrost temperatury. Wykryliśmy wzrost stabilności termicznej E. coli SelO o około +4 °C i +12 °C odpowiednio w obecności ATP-Mg2+ oraz ATP-Mn2+ (Rycina 3). Nie zaobserwowano jednak zmiany stabilności termicznej po inkubacji z UTP, co wskazuje, że E. coli SelO może nie wykazywać wykrywalnego wiązania z UTP.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Konfiguracja termocyklera. Przykład programu termocyklera używanego do zwiększania temperatury próbki o +0.5 °C/min przy jednoczesnym pomiarze fluorescencji SYPRO Orange przy użyciu kanału FRET. Zalecenia obejmują również inkubację w temperaturze otoczenia na początku i na końcu protokołu. Skrót: FRET = Förster resonance energy transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Optymalizacja stężeń białka i barwnika. (A) Reprezentatywne wyniki optymalizacji stężenia barwnika SYPRO Orange z wykorzystaniem 5 µM SelO z Escherichia coli. (B) Reprezentatywne wyniki optymalizacji stężenia SelO z E. coli z wykorzystaniem 5x barwnika SYPRO Orange. Krzywa denaturacji termicznej przedstawia względne jednostki fluorescencji (oś y) w funkcji temperatury (oś x). Wyniki reprezentują średnią&#160;± SD z trzech powtórzeń (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg" /> 
Rycina 3:Krzywe denaturacji termicznej i &#916;Tm analizy SelO w obecności nukleotydów i kationów dwuwartościowych.&#160;(A) Surowe dane krzywych denaturacji termicznej próbek (5 &#181;M Escherichia coli SelO&#160;w obecności 200 &#181;M ATP lub UTP oraz 2 mM kationów dwuwartościowych, 5x SYPRO Orange) wyeksportowano z urządzenia do RT-PCR i naniesiono na wykres. SelO ATP-Mg reprezentuje próbki z SelO, ATP i MgCl22, SelO ATP-Mn reprezentuje próbki z SelO, ATP i MnCl22, SelO UTP-Mg reprezentuje próbki z SelO, UTP i MgCl22, SelO UTP-Mn reprezentuje próbki z SelO, UTP i MnCl22Należy zauważyć, że kontrola bez barwnika i kontrola bez białka wykazują niską fluorescencję. Wyniki przedstawiają średnią&#160;&#177; SD z trzech powtórzeń w dołkach (n = 3). (B) Krzywe denaturacji termicznej wykreślone do najwyższej intensywności i dopasowane do sigmoidalnego równania Boltzmanna. Choć denaturacja termiczna SelO nie była wpływana przez UTP, zaobserwowano wyraźne przesunięcie denaturacji termicznej w obecności ATP (krzywe fioletowe). Wyniki przedstawiają średnią&#160;&#177; SD z trzech powtórzeń w dołkach (n = 3). (C) Histogram przedstawiający Tm wartości uzyskane z dopasowania sigmoidalnego Boltzmanna do danych przedstawionych w Rycina 3BWyniki przedstawiają średnią&#160;&#177; SD z trzech powtórzeń w dołkach (n = 3). SelO 39.2 &#176;C&#160;&#177; 0,085, SelO ATP-Mg 43.3 &#176;C&#160;&#177; 0,133, SelO ATP-Mn 50.9 &#176;C&#160;&#177; 0,085, SelO UTP-Mg 39.1 &#176;C&#160;&#177; 0,056, SelO UTP-Mn 39.9 &#176;C&#160;&#177; 0.087. (D) Histogram przedstawiający zmianę temperatury topnienia &#916;Tm (Tm dodatek- Tm bufor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Przykładowe dane dla TSA SelO w obecności metali i nukleotydów. Arkusz z surowymi danymi wyeksportowanymi z urządzenia do RT-PCR oraz danymi przetworzonymi w celu usunięcia wartości po maksymalnej intensywności RFU, zgodnie z opisem w krokach protokołu 5.1 i 5.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl TableS1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy test przesunięcia termicznego, wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, używaną do badania wiązania małych cząsteczek z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Naszym celem jest zbadanie aktywności biochemicznej białek o nieznanych funkcjach. Wiązanie kofaktora jest nie tylko niezbędne dla aktywności niektórych białek, ale może również wpływać na ich stabilność termiczną. Jednym z praktycznych zastosowań tego zjawiska jest wykorzystanie zmiany stabilności termicznej, mierzonej temperaturą topnienia białka, do analizy wiązania ligandów.Test przesunięcia termicznego jest wszechstronnym narzędziem do badania interakcji białek z potencjalnymi kofaktorami lub lekami oraz do określania warunków stabilizujących krystalografię. Niektóre z jej zalet w porównaniu z innymi metodami przesiewania to stosunkowo prosta konfiguracja i wysoka przepustowość z płytkami 96 lub 384-dołkowymi. Selenoproteina O lub SelO jest ewolucyjnie konserwatywną pseudokinazą, która przenosi monofosforan adenozyny z ATP do substratów białkowych w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylacja W tym protokole używamy TSA do analizy wiązania nukleotydów i metali z SelO.Na początek przygotuj roztwór białka SelO za pomocą testu przesunięcia termicznego lub buforu TSA. Dozuj białko, małe cząsteczki i barwnik SYPRO Orange do odpowiednich dołków na płytce 384-dołkowej. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną i krótko obracaj płytkę o masie 1000 g przez jedną minutę w wirówce.Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym i zaprogramuj ją tak, aby utrzymywała próbkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie wzrost temperatury o 0,5 stopnia na minutę do 95 stopni Celsjusza. Eksportuj dane z maszyny RTPCR dla względnych jednostek fluorescencji lub RFU w odniesieniu do temperatury. Korzystając z wybranego oprogramowania, wyodrębnij i wykreśl punkty danych do najwyższej intensywności zmierzonej dla każdej krzywej topnienia.Określ temperaturę topnienia za pomocą pasowania sigmoidalnego Boltzmanna, aby uzyskać dane do określenia temperatury topnienia lub Tm. Krzywe denaturacji termicznej wykazały wzrost stabilności termicznej Escherichia coli SelO o 4 stopnie Celsjusza w obecności ATP z jonami magnezu i wzrost o 12 stopni Celsjusza w tym samym dla ATP z jonami manganu. Nie zaobserwowano jednak zmiany w stabilności termicznej po inkubacji z UTP, co wskazuje, że Escherichia coli SelO może nie wykazywać wykrywalnego wiązania z UTP. Kontrole bez białka, jak również bez barwnika, miały niski sygnał fluorescencji, który nie reagował na wzrost temperatury.

utilizing-thermal-shift-assay-to-probe-substrate-binding-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę molekularnego dokowania w połączeniu z testem przesunięcia termicznego komórkowego w celu przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami a celami białkowymi.

Przewidywanie docelowego białka i walidacja związku małocząsteczkowego

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj test przesunięcia termicznego do badania wiązania ligandów z selenoproteiną O. Ta metoda fluorescencyjna pozwala analizować interakcje białkowe i identyfikować warunki stabilizujące do krystalografii białek.

Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O

Przeglądaj więcej filmów