Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Produkcja zdolnych do życia zarodków jest złożonym procesem. Naszym ogólnym celem jest zdefiniowanie sygnałów komórkowych, które koordynują przejście z komórki jajowej do zarodka. Reporter CaFE to nowe narzędzie opracowane do wizualizacji sygnałów wapniowych, które pojawiają się podczas zapłodnienia i podczas wczesnej embriogenezy.

Korzystając z reportera CaFE, odkryliśmy opóźniony fal wapniowy w oocytach, które są przedwcześnie owulowane. Odkryliśmy również obecność jednokomórkowych stanów przejściowych wapnia we wczesnej embriogenezie. Oba odkrycia ilustrują użyteczność genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia we wczesnym okresie rozwoju.

Poprzednie techniki wizualizacji oocytów wapnia polegały na wstrzykiwaniu barwnika do gonady. Technika ta jest pracochłonna i wymaga specjalistycznego sprzętu do mikroiniekcji. Reporter CaFE umożliwia łatwą wizualizację fali wapniowej w oocytach i zarodkach za pomocą powszechnie dostępnego sprzętu.

CaFE Reporter ułatwia badania nad czasem i regulacją sygnalizacji wapniowej w oocytach i zarodkach. Ten reporter można łatwo połączyć z istniejącymi mutantami, markerami i knockdownami RNAi, aby odkryć zachowanie wapnia w stosunku do innych przełomowych wydarzeń podczas wczesnej embriogenezy, takich jak dojrzewanie miotowe. Na początek przytrzymaj uchwyt wykałacza i poluzuj srebrną obrożę w kierunku jego głowy, aby cztery sekcje się rozłączyły.

Umieść 1.5-calowy drut platynowy pośrodku czterech sekcji. Przytrzymaj drut pośrodku, jednocześnie dokręcając kołnierz, aby połączyć cztery sekcje. Za pomocą szczypiec płaskich ostrożnie uformuj drut i kilkakrotnie zaciśnij koniec drutu, aby uzyskać około dwóch do trzech milimetrów stopy.

Użyj tej stopy, aby zebrać robaki. Przygotuj roztwór 3% agarozy w wodzie i podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Umieść puste szkiełko mikroskopowe między dwoma innymi szkiełkami mikroskopowymi, które mają pojedynczą warstwę taśmy laboratoryjnej na długiej osi.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra upuść podgrzany 3% roztwór agarozy na środek ślepego szkiełka. Szybko umieść nowy preparat mikroskopowy na kropli agarozy, prostopadle do pustego szkiełka, tak aby kropla spoczywała na sąsiednich zaklejonych szkiełkach, a następnie delikatnie rozdziel szkiełka, zachowując nienaruszoną podkładkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów dodaj małą kroplę jednomilimolowego lewamizolu w buforze M9 do środka podkładki agarozowej, aby sparaliżować robaki.

Wybierz co najmniej pięć zsynchronizowanych robaków i delikatnie dotknij stopki uchwytu wytrycha do kropli lewamizolu, aby przenieść robaki. Ostrożnie przykryj wacik agarozowy szkiełkiem nakrywkowym. Sprawdź położenie robaków, ponieważ szkiełko nakrywkowe może spowodować rozproszenie robaków.

Oznacz szkiełko mikroskopowe odpowiednimi szczegółami, takimi jak nazwa szczepu robaka. Zlokalizuj robaki za pomocą obiektywu o małej mocy w mikroskopie, korzystając z oświetlenia jasnego pola. Użyj obiektywu powietrznego o powiększeniu co najmniej 20x lub obiektywu immersyjnego o powiększeniu 40x, aby wyraźnie uwidocznić falę wapniową w oocytach.

Aby uzyskać optymalną wizualizację reporterów fluorescencyjnych, dostosuj wzmocnienie lub czas ekspozycji dla kanałów GFP i RFP. Zbadaj każdy minus jeden oocyt w ramionach gonad robaka, aby określić, czy zapłodnienie jest nieuchronne. Po rozpadzie otoczki jądrowej cytoszkielet najbardziej proksymalnego oocytu minus jeden przegrupuje się, nabierze zaokrąglonego wyglądu i oddzieli się od oocytu minus dwóch.

Gdy owulacja nastąpi nieuchronnie, natychmiast rozpocznij nagrywanie wideo w szerokim polu. Proksymalny oocyt jest oznaczony przez minus-jeden bezpośrednio przed spermateką, gdzie przechowywane są plemniki. Najnowszy zarodek znajduje się najbliżej spermateki, ale wewnątrz macicy.

Fala wapniowa wykazywała dwufazowy wzór, rozpoczynający się gwałtownym rozbłyskiem, po którym następowała fala fluorescencji przemieszczająca się od punktu wejścia w kierunku przeciwległego bieguna. Sygnał wapniowy zaobserwowano natychmiast po wejściu do spermateki w wiodącej oocycie minus-jeden, ale nie w końcowej oocycie minus-dwie. Zarodki in utero i ex-utero wykazywały sygnał fluorescencyjny w pojedynczej komórce podczas embriogenezy.