Name: Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji sygnałów wapniowych podczas zapłodnienia i wczesnego rozwoju u C. elegans za pomocą reportera CaFE. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia w komórkach bez konieczności iniekcji barwników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KSKG został sfinansowany z grantu od Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R15HD111986). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD4010440). Dziękujemy firmie WormBase.

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Proste narzędzie z solidnym protokołem to potężne połączenie, które pozwala radzić sobie z trudnymi pytaniami naukowymi. W tym miejscu przedstawiono metody wizualizacji wapnia jako łatwo wykrywalnego wskaźnika zastępczego dla nawożenia za pomocą reportera CaFE. Ten sam reporter utrzymuje się we wczesnej embriogenezie, a także umożliwia wizualizację stanów przejściowych wapnia w dalszym rozwoju. Sygnalizacja wapniowa służy jako krytyczny drugi przekaźnik, który wyznacza główne zmiany w funkcjonowaniu komórek, szczególnie w biologii rozwojowej. W oocycie pierwsza faza pękania fali wapniowej wyznacza nie tylko czas zapłodnienia, ale także miejsce fuzji plemników3. U C. elegans oś A-P jest również określana przez miejsce fuzji plemników23. Dlatego zdolność do wizualizacji wapnia w oocytach i zarodkach pozwala na badanie złożonych pytań, które mają kluczowe znaczenie dla biologii komórki i rozwoju.
Opisana tutaj metoda z reporterem CaFE powinna być wystarczająco prosta dla nowicjuszy w dziedzinie nicieni. Dotychczasowe metody wykrywania fal wapniowych w oocytach C. elegans opierały się na iniekcji barwnika 3,8,14. Chociaż badania te były ważne i pouczające, wstrzykiwanie barwnika jest pracochłonne, a sprzęt do wstrzykiwania nie jest dostępny w każdym laboratorium.
Przedstawione tutaj protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem zdrowych robaków. Aby zmaksymalizować szansę na sukces, upewnij się, że nie ma zanieczyszczeń na podłożu robaków lub na trawniku bakteryjnym, na którym żerują robaki. Nie wystawiaj robaków na warunki stresowe, takie jak temperatura, ponieważ wpłyną one na owulację i zapłodnienie. Dodatkowo, kontrole skuteczności RNAi powinny być włączone do każdego eksperymentu, ponieważ skuteczność zmniejsza się z czasem. Użyj kontroli pozytywnej dla skuteczności RNAi, takiej jak jajo 5, które generuje zarodki, ale nie ma zdolnego do życia potomstwa, ponieważ tworzenie skorupki jaja jest zagrożone24. Ponadto parametry przechwytywania obrazu muszą być zoptymalizowane dla każdego systemu mikroskopowego. Nasze specyfikacje są tutaj zawarte jako odniesienie, ale należy spodziewać się odchyleń. Chociaż system ten z łatwością wykrywa cytoplazmatyczny wapń jako wskaźnik zastępczy dla zapłodnienia, niekoniecznie reprezentuje on zdarzenie fuzji plemnika z oocytem w dobrej wierze.
Szeroki wachlarz narzędzi i mutantów, swobodnie dystrybuowanych w społeczności robaków, zwiększa użyteczność CaFE Reporter. Reporter jest zintegrowany z genomem robaka i można go łatwo skrzyżować z innymi zmutowanymi lub reporterowymi szczepami C. elegans 25. Doniesiono tutaj o utworzeniu EAG25 wyrażającego reporter CaFE za pomocą markera histonowego H2B-mCherry w celu wizualizacji jąder (ryc. 1) i EAG28 zarówno z reporterem CaFE, jak i markerem domeny pleckstrin-homologia mCherry, który podkreśla peryferia komórki (ryc. 2) 13,26. Oba szczepy pomagają w wizualizacji komórek w linii zarodkowej i podczas embriogenezy. Ponadto zakład RNAi w C. elegans, w połączeniu z CaFE reporter, ujawnił nowe informacje na temat kompetencji nawożenia. Jak pokazano w podwójnej owulacji wywołanej przez knockdown ipp-5 RNAi na rycinie 3, obecność plemnika i owulacji oocytu jest niewystarczająca do stymulacji zapłodnienia.
Wyniki te wskazują, że musi istnieć inny sygnał lub brak inhibitora, który umożliwia zapłodnienie oocytu. Przedwcześnie owulowana komórka jajowa wykazuje opóźniony stan przejściowy wapnia, gdy oocyt przemieszcza się do macicy. Ta późna fala wapniowa sugeruje, że przedwcześnie owulowany oocyt -2 może z czasem rozwinąć kompetencję do zapłodnienia. Przewidujemy, że badania nad czasem zapłodnienia, szczególnie w odniesieniu do sygnalizacji i regulacji komórka-komórka, będą wspomagane przez zastosowanie reportera CaFE. Dodatkowo, reporter CaFE utrzymuje się w embriogenezie i wykazuje jednokomórkowe stany przejściowe wapnia. Ta embrionalna sygnalizacja wapniowa została również zgłoszona w ciągu pierwszych 24 godzin od rozwoju danio pręgowanego27. Rola stanów przejściowych wapnia jest nieznana, ale obecność sugeruje zdarzenie sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju, które nie zostało jeszcze zbadane. Warto zauważyć, że nie zaobserwowano przejściowych stanów wapnia w nowo zapłodnionych zygotach. Dlatego wapń nie lokalizuje się w bruździe łupliwej, jak udokumentowano u kilku innych organizmów, w tym Xenopus i ludzi 20,21,22.
Co ważne, reporter CaFE jest na tyle łatwy, że może być używany przez studentów po minimalnym przeszkoleniu. Zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy 1-punktowe laboratorium CURE (course-based undergraduate research experience) dla studentów biologii z opisanymi tutaj szczepami i protokołami. W ciągu semestru klasa spotykała się raz w tygodniu przez 3 godziny lub dwa razy w tygodniu po 1 godzinę i 30 minut. Uczniowie mieli do wyboru pracę samodzielnie lub w grupach 2-osobowych. Każdy uczeń/para wybrała inny gen do zbadania z wyselekcjonowanej listy. Wykonali RNAi przeciwko wybranemu genowi w szczepie EAG28 i zbadali robaki pod kątem wpływu na płodność, zapłodnienie i/lub morfologię gonad. Opierając się na uzyskanych wynikach i lekturze podstawowej literatury, studenci opracowali hipotezy, które mogli przetestować w kolejnych eksperymentach. Ten iteracyjny projekt miał kluczowe znaczenie dla zwiększenia zaangażowania uczniów28. Studenci zdobyli autentyczne doświadczenie badawcze i zdobyli umiejętności w zakresie organizmów modelowych, badań genetycznych i mikroskopii fluorescencyjnej. Biorąc pod uwagę łatwość obsługi reportera CaFE, studenci bez doświadczenia badawczego byli w stanie odnieść sukces. Następnie studenci w przeważającej większości wyrazili preferencję dla formatu CURE w stosunku do tradycyjnych zajęć laboratoryjnych, a wielu studentów wyraziło chęć kontynuowania badań. Podsumowując, te narzędzia i protokoły pomagają zarówno w edukacji, jak i badaniach nad wczesnymi procesami rozwojowymi.

Zapłodnienie oznacza początek nowego cyklu życia, ale określenie dokładnego momentu zapłodnienia jest trudne. Zachowaną cechą zapłodnienia jest fala wapnia przez oocyt bezpośrednio po fuzji plemników1. Chociaż charakter fali wapniowej, pod względem częstotliwości i prędkości, różni się w zależności od gatunku, prawie wszystkie organizmy wykazują przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia po zapłodnieniu. Fala wapniowa odgrywa kluczową rolę w blokowaniu polispermii, aktywacji komórek jajowych i innych ważnych zdarzeń komórkowych2. Ponieważ fala wapniowa inicjuje się w miejscu fuzji plemników, wapń służy jako marker zapłodnienia3.
Caenorhabditis elegans to idealny organizm modelowy do badania wczesnego rozwoju. Robaki są przezroczystymi hermafrodytami, które są genetycznie podatne na manipulacje4. Co najważniejsze dla badań nad zapłodnieniem, dorosłe osobniki C. elegans w sposób ciągły wytwarzają oocyty przy użyciu ściśle uporządkowanej gonad5. W rzeczywistości oocyty są jedynymi nowymi komórkami produkowanymi, ponieważ soma jest postmitotyczna w wieku dorosłym6. Rysunek 1 przedstawia gonadę, która składa się z 2 symetrycznych jajówek w kształcie litery U. Oocyt znajdujący się najbliżej spermateki (narządu magazynującego plemniki) jest określany jako oocyt -1. Ta konstrukcja linii montażowej gonady robaka owuluje dojrzały oocyt do spermateki co ~23 minuty w temperaturze 20 °C u młodych dorosłych7. Nowo zapłodniony zarodek następnie przenosi się do wspólnej macicy, zanim zostanie złożony przez pojedynczy srom.
Poprzednie techniki wizualizacji wapnia podczas nawożenia u C. elegans polegały na mikroiniekcji barwników wrażliwych na wapń3,8. Aby łatwiej zobaczyć falę wapniową po fuzji plemnika z jajem, genetycznie kodowany wskaźnik wapnia oparty na jGCaMP7s został wstawiony w pojedynczej kopii w locus bezpiecznej przystani przy użyciu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)7,9. Reporter został nazwany CaFE dla wapnia podczas nawożenia u C. elegans. Osoba zgłaszająca nie wykazuje istotnych wad fizjologii ani płodności.
Tutaj przedstawione są protokoły wizualizacji fali wapniowej w oocytach i zarodkach C. elegans za pomocą reportera CaFE. W połączeniu z niezliczonymi narzędziami dostępnymi w społeczności robaków, takimi jak interferencja RNA (RNAi) i markery gonad mCherry, reporter CaFE ułatwia badanie regulacji wewnętrznych zdarzeń zapłodnienia, w szczególności kompetencji nawożenia i czasu nawożenia. Dodatkowo, reporter CaFE utrzymuje się we wczesnym rozwoju i jest unikalnym narzędziem do badania embriogenezy.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; Proszek rozpuszcza się łatwiej niż płatki</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lampa alkoholowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Do stosowania z 95% etanolem</td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Mały sterylizator parowy AMSCO serii 400</td><td>Steris Opieka zdrowotna</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bactoo-pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Baktoo-trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 wirujący dysk konfokalny</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Używany z mikroskopem Leica</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Cytogenics Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 szkiełka w opakowaniu</td></tr><tr><td>Szczypce płaskie, gładka szczęka</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Upewnij się, że szczypce mają gładką szczękę</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;- d-1-tiogalaktopiranozyd&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; bez dioksanu</td></tr><tr><td>Taśma laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>Taśma 0,5 cala służy do oklejania szkiełek mikroskopowych</td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>Opakowanie 1 uncji</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 skaning laserowy konfokalny</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nikon NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Konfokalny</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne Petri szalka (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 szalek Petriego w opakowaniu</td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 szalek Petriego w opakowaniu</td></tr><tr><td>Szczep EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Stworzony przez Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Szczep EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PIE-1U; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Stworzony przez Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Szczep EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Stworzony przez Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Szczep JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Created by E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Szczep OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Stworzony przez Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Uchwyt do kilofów</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt</td><td>drożdżowy IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Wapń jest ważną cząsteczką sygnałową podczas przejścia z oocytu do zarodka (OET) i wczesnej embriogenezy. Nicień hermafrodytyczny Caenorhabditis elegans zapewnia kilka unikalnych zalet w badaniu OET, ponieważ jest przezroczysty i ma uporządkowaną gonadę, która wytwarza jeden dojrzały oocyt co ~ 23 minuty w temperaturze 20 °C. Zmodyfikowaliśmy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia jGCaMP7s tak, aby fluorescencyjnie wskazywał moment zapłodnienia w żywym organizmie. Nazwaliśmy ten reporter "CaFE" dla wapnia podczas nawożenia u C. elegans. Reporter CaFE został zaprojektowany jako locus bezpiecznej przystani w pojedynczej kopii, nie ma znaczącego wpływu na fizjologię ani płodność, a po zapłodnieniu wytwarza silny sygnał. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów wykorzystania reportera CaFE jako narzędzia in vivo do analizy OET i embriogenezy. Uwzględniamy metody synchronizacji robaków, badania skutków knockdownu RNAi, montowania robaków do obrazowania oraz wizualizacji wapnia w oocytach i zarodkach. Dodatkowo przedstawiamy generację dodatkowych szczepów robaków, które mają pomóc w tego typu analizach. Demonstrując przydatność reportera CaFE do wizualizacji czasu zapłodnienia, informujemy, że podwójna owulacja występuje, gdy ipp-5 jest celem RNAi i że tylko pierwszy oocyt ulega natychmiastowemu zapłodnieniu. Co więcej, odkrycie jednokomórkowych stanów przejściowych wapnia podczas wczesnej embriogenezy zostało tutaj przedstawione, co pokazuje, że reporter CaFE utrzymuje się we wczesnym rozwoju. Co ważne, narzędzie do zgłaszania CaFE w robakach jest na tyle proste, że można je włączyć do zajęć laboratoryjnych w ramach badań licencjackich opartych na kursach (CURE). Reporter CaFE, w połączeniu z uporządkowaną gonadą i łatwością RNAi u robaków, ułatwia badanie dynamiki komórka-komórka wymaganej do regulacji wewnętrznego zapłodnienia i wczesnej embriogenezy.

Stosując protokoły opisane w niniejszym manuskrypcie, zaobserwowano dynamiczne wzorce sygnalizacji wapniowej podczas zapłodnienia i embriogenezy u C. elegans.
Typowy przebieg zapłodnienia u nicieni zawierających reporter CaFE przedstawiono na Rysunku 2. W celu ułatwienia analizy wykorzystano szczep EAG28, który łączy reporter CaFE z transgenem kodującym domenę homologii plecstryny (PH-mCherry)13. Marker PH-mCherry lokalizuje się w błonie plazmatycznej i pozwala na łatwiejszą wizualizację granic komórkowych, szczególnie w ramieniu gonady. Szczep EAG28 powstał poprzez skrzyżowanie szczepu EAG16 zawierającego reporter CaFE ze szczepem reporterowym OD70 PH-mCherry13. U C. elegans owulacja i zapłodnienie zachodzą jednocześnie. Za czas 0 zapłodnienia uznaje się pierwszą klatkę, w której wykryto sygnał fluorescencyjny w owulującym oocycie (Rysunku 2). Jasny błysk fluorescencji pojawia się w miejscu fuzji z plemnikiem, gdy tylko przednia krawędź oocytu wnika do spermateki, będącej organem magazynującym plemniki7. Sygnał pojawia się przed całkowitym zakończeniem owulacji. Fala wapniowa jest dwufazowa: następuje gwałtowny początkowy błysk, po którym podąża fala fluorescencji od punktu wniknięcia w kierunku przeciwległego bieguna. Cały oocyt staje się fluorescencyjny w czasie &#60;30 s.
Należy zauważyć, że reporter CaFE występuje w pojedynczej kopii, w związku z czym sygnał nie jest tak silny jak w przypadku innych transgenów. Z-stack time-lapse nie jest zalecany podczas owulacji, chyba że dostępny i zoptymalizowany jest konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym. Obrazy Z-stack można uzyskać przed lub po nagraniu filmu, aby zarejestrować trójwymiarowe zmiany w morfologii gonad. Chociaż przedstawione tutaj obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego, stany przejściowe zaobserwowano również przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii szerokopolowej, która jest bardziej powszechna i przystępniejsza cenowo niż mikroskopia konfokalna. W przypadku zastosowania konfokalnego mikroskopu skaningowego szybkość klatek wynosi około 1 fps. W przypadku konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym szybkość klatek wynosi 10 fps lub więcej. Sygnał tła reportera CaFE jest wystarczający, aby oświetlić dojrzewające oocyty w ramieniu gonady. Po zapłodnieniu zazwyczaj obserwuje się 1,5-2-krotny wzrost intensywności sygnału GFP.
Istnieje kilka alternatywnych metod ilościowego oznaczania danych. Na przykład oprogramowanie do analizy obrazu Imaris, stworzone przez Oxford Instruments (tę samą spółkę matkę co konfokalny mikroskop dyskowy Andor Dragonfly), posiada funkcję ilościowego oznaczania sygnału w każdej klatce wyłącznie dla przechodzącego oocyta, zamiast dla większego ROI. Oprogramowanie Imaris nie jest jednak bezpłatne. Ponadto szczegółowa strategia analizy obrazu w celu pomiaru fal wapniowych w oocycie została drobiazgowo opisana przez Takayamę, Fujitę i Onami i wykorzystuje program ImageJ, który jest dostępny bezpłatnie14. Alternatywnie, kymografy służące do ilustrowania fali sygnału fluorescencyjnego w pojedynczym oocycie wymagają bardziej rozbudowanej manipulacji obrazem niż opisano w niniejszej pracy, lecz są opisane w pracy Takayamy i Onami3.
Wyraźną zaletą C. elegans jest możliwość wyciszenia ekspresji niemal każdego genu poprzez karmienie nicieni bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA w celu wywołania endogennego RNAi15,16. Dla optymalnej ekspresji dsRNA zarówno pożywki RNAi, jak i nasycona kultura RNAi zawierają IPTG. dsRNA jest wytwarzane poprzez ekspresję badanego genu z flankującymi promotorami. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy bibliotekę Ahringera, która obejmuje większość genomu nicienia dzięki zastosowaniu 16 256 szczepów bakteryjnych17. Alternatywnie, przez laboratorium Vidala za pomocą systemu Gateway stworzono ORFeome składający się z około 11 000 klonów RNAi, który jest dostępny w sprzedaży za pośrednictwem Horizon Discovery18.
Aby zademonstrować użyteczność reportera CaFE w połączeniu z RNAi, zbadaliśmy przedwczesną owulację. Częściowa delecja w genie ipp-5 indukuje zdarzenie podwójnej owulacji, podczas której zarówno oocyt -1, jak i oocyt -2 dostają się do spermateki podczas tej samej owulacji19. IPP-5&#160;jest fosfatazą działającą na IP3, która skutecznie obniża poziom drugiego przekaźnika IP3. Stwierdziliśmy, że wyciszenie ipp-5 za pomocą RNAi wywołuje fenotyp podwójnej owulacji podobny do obserwowanego u mutantów.
Analiza reportera CaFE podczas podwójnej owulacji wywołanej wyciszeniem genu ipp-5 za pomocą RNAi ujawniła nowe aspekty OET. Po pierwsze, sygnał wapniowy zaobserwowano natychmiast po wejściu do spermateki w prowadzącym oocycie -1, ale nie w następującym za nim oocycie -2 (Rysunek 3). Mimo że owulacji ulega 2 oocyty, oocyt -1 jest wciąż jedynym oocytem wykazującym oznaki prawidłowego dojrzewania, w szczególności rozpad otoczki jądrowej (NEBD). Dane te sugerują, że mimo obecności plemników, oocyt -2 nie jest zdolny do zapłodnienia, ponieważ nie dojrzał on jeszcze prawidłowo. Po drugie, w oocycie -2 występuje opóźniona fala wapniowa, zazwyczaj w momencie opuszczania spermateki i przechodzenia do macicy. Choć dojrzewanie oocytu jest zazwyczaj warunkiem koniecznym do owulacji, dane te sugerują, że dojrzewanie oocytu i zdolność do zapłodnienia mogą nadal wystąpić po owulacji. Wizualizacja opóźnionej fali wapniowej podczas wyciszenia ipp-5 podkreśla zalety reportera CaFE w badaniu czasu i zdolności do zapłodnienia.
Ponadto odkryliśmy, że reporter CaFE jest wykrywalny w zniesionych jajach i ujawnia jednokomórkowe przejściowe wzrosty poziomu wapnia podczas wczesnej embriogenezy u C. elegans. Embriony z synchronizowanych jednodniowych dorosłych nicieni EAG28 (CaFE; PH-mCherry) obrazowano zgodnie z protokołami z sekcji 1-5 przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly i kamery Zyla (Rycina 4). Przejściowe wzrosty poziomu wapnia są ograniczone do pojedynczych komórek i trwają krócej niż fala wapniowa podczas zapłodnienia (~9 s, n=11). Jednakże fala wapniowa podczas embriogenezy nie wydaje się być dwufazowa. Przejściowych wzrostów poziomu wapnia nie zaobserwowano przed stadium 8 komórek. Co istotne, wapń nie lokalizuje się w bruździe podziałowej u C. elegans, co ma miejsce u wielu innych organizmów, w tym u ludzi i Xenopus20,21,22. Jednokomórkowe przejściowe wzrosty poziomu wapnia obserwowano znacznie po gastrulacji (~200 min po zapłodnieniu) oraz w zniesionych jajach. Pojedynczy embrion wykazuje w czasie wiele przejściowych wzrostów poziomu wapnia, lecz w różnych komórkach i zazwyczaj w jednej komórce naraz. Należy pamiętać, że ciągła ekspozycja na stymulację laserową uszkodzi embriony. Zaleca się zmniejszenie mocy LED/lasera lub stosowanie ekspozycji przerywanej. Jednakże, ponieważ fale wapniowe są stosunkowo krótkie i trwają ~9 s, nie zalecamy odstępów dłuższych niż 2 s między zdarzeniami stymulacji LED/laserem.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Ramię gonady C. elegans. Obraz jednego ramienia gonady z linii robaków EAG25, pokazujący reporter CaFE GFP (zielony) oraz marker histony 2B-mCherry (czerwony), który uwidacznia jądra komórkowe w linii zarodkowej. Proksymalny oocyt jest oznaczony jako -1 bezpośrednio przed spermateką, w której przechowywane są plemniki (strzałka). Zarodek znajdujący się najbliżej spermateki, ale wewnątrz macicy, jest zarodkiem najmłodszym. Obraz został wykonany przy użyciu konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego Nikon ECLIPSE Ti2. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Wizualizacja fali wapniowej podczas zapłodnienia. Obrazy z serii czasowej przedstawiające fluorescencję odzwierciedlającą stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego podczas zapłodnienia u szczepu robaków EAG28. Szczep EAG28 zawiera zarówno reporter CaFE (zielony), jak i fuzję domeny homologii plekstryny z mCherry (żółty), która podkreśla błony plazmatyczne. Czas 0 oznacza&#160;pierwszą klatkę obrazu przedstawiającą wyraźny wzrost sygnału fluorescencyjnego w oocycie. Czas 24,4 s odzwierciedla pierwszą klatkę pokazującą&#160;fluorescencję całego oocytu.&#160;Obrazy z serii czasowej zostały wykonane przy użyciu konfokalnego mikroskopu dyskowego Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Fale wapnia podczas zdarzenia podwójnej owulacji wywołanej RNAi ipp-5 .Obrazy z lapse-time przedstawiające sekwencyjne fale wapnia w oocycie -1 i oocycie -2 w szczepie EAG16 (CaFE w kolorze zielonym GFP) poddanym działaniu RNAi ipp-5 . Klatka z czasu -40,0 s zawiera oznaczenia dla oocytu -1 (-1), oocytu -2 (-2), spermateki (*) i zarodka +1 (+1). Czas 0 s pokazuje początkowy wzrost fluorescencji fali wapnia w oocycie -1. Czas 4,5 s pokazuje rozprzestrzenianie się fali wapnia w kierunku przeciwległego bieguna w oocycie -1. Czas 70,5&#160;s przedstawia fluorescencję całej komórki w oocycie -1, przy jednoczesnym sygnale GFP o poziomie podstawowym w oocycie -2; oba oocyty znajdują się w&#160;spermatece. Zapłodniony oocyt -1 i niezapłodniony oocyt -2 dostają się do macicy w czasie 158,3 s. W 219,3 s oocyt -2&#160;wykazuje późną fluorescencyjną falę wapnia. Obrazy zostały wykonane przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 30 µM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Pojedyncze przejściowe zmiany poziomu wapnia w komórkach we wczesnej embriogenezie. (A) Zarodki in utero oraz (B) ex utero (zniesione jajo) wykazały sygnał fluorescencyjny w pojedynczej komórce podczas embriogenezy. Obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Produkcja zdolnych do życia zarodków jest złożonym procesem. Naszym ogólnym celem jest zdefiniowanie sygnałów komórkowych, które koordynują przejście z komórki jajowej do zarodka. Reporter CaFE to nowe narzędzie opracowane do wizualizacji sygnałów wapniowych, które pojawiają się podczas zapłodnienia i podczas wczesnej embriogenezy.Korzystając z reportera CaFE, odkryliśmy opóźniony fal wapniowy w oocytach, które są przedwcześnie owulowane. Odkryliśmy również obecność jednokomórkowych stanów przejściowych wapnia we wczesnej embriogenezie. Oba odkrycia ilustrują użyteczność genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia we wczesnym okresie rozwoju.Poprzednie techniki wizualizacji oocytów wapnia polegały na wstrzykiwaniu barwnika do gonady. Technika ta jest pracochłonna i wymaga specjalistycznego sprzętu do mikroiniekcji. Reporter CaFE umożliwia łatwą wizualizację fali wapniowej w oocytach i zarodkach za pomocą powszechnie dostępnego sprzętu.CaFE Reporter ułatwia badania nad czasem i regulacją sygnalizacji wapniowej w oocytach i zarodkach. Ten reporter można łatwo połączyć z istniejącymi mutantami, markerami i knockdownami RNAi, aby odkryć zachowanie wapnia w stosunku do innych przełomowych wydarzeń podczas wczesnej embriogenezy, takich jak dojrzewanie miotowe. Na początek przytrzymaj uchwyt wykałacza i poluzuj srebrną obrożę w kierunku jego głowy, aby cztery sekcje się rozłączyły.Umieść 1.5-calowy drut platynowy pośrodku czterech sekcji. Przytrzymaj drut pośrodku, jednocześnie dokręcając kołnierz, aby połączyć cztery sekcje. Za pomocą szczypiec płaskich ostrożnie uformuj drut i kilkakrotnie zaciśnij koniec drutu, aby uzyskać około dwóch do trzech milimetrów stopy.Użyj tej stopy, aby zebrać robaki. Przygotuj roztwór 3% agarozy w wodzie i podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Umieść puste szkiełko mikroskopowe między dwoma innymi szkiełkami mikroskopowymi, które mają pojedynczą warstwę taśmy laboratoryjnej na długiej osi.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra upuść podgrzany 3% roztwór agarozy na środek ślepego szkiełka. Szybko umieść nowy preparat mikroskopowy na kropli agarozy, prostopadle do pustego szkiełka, tak aby kropla spoczywała na sąsiednich zaklejonych szkiełkach, a następnie delikatnie rozdziel szkiełka, zachowując nienaruszoną podkładkę. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów dodaj małą kroplę jednomilimolowego lewamizolu w buforze M9 do środka podkładki agarozowej, aby sparaliżować robaki.Wybierz co najmniej pięć zsynchronizowanych robaków i delikatnie dotknij stopki uchwytu wytrycha do kropli lewamizolu, aby przenieść robaki. Ostrożnie przykryj wacik agarozowy szkiełkiem nakrywkowym. Sprawdź położenie robaków, ponieważ szkiełko nakrywkowe może spowodować rozproszenie robaków.Oznacz szkiełko mikroskopowe odpowiednimi szczegółami, takimi jak nazwa szczepu robaka. Zlokalizuj robaki za pomocą obiektywu o małej mocy w mikroskopie, korzystając z oświetlenia jasnego pola. Użyj obiektywu powietrznego o powiększeniu co najmniej 20x lub obiektywu immersyjnego o powiększeniu 40x, aby wyraźnie uwidocznić falę wapniową w oocytach.Aby uzyskać optymalną wizualizację reporterów fluorescencyjnych, dostosuj wzmocnienie lub czas ekspozycji dla kanałów GFP i RFP. Zbadaj każdy minus jeden oocyt w ramionach gonad robaka, aby określić, czy zapłodnienie jest nieuchronne. Po rozpadzie otoczki jądrowej cytoszkielet najbardziej proksymalnego oocytu minus jeden przegrupuje się, nabierze zaokrąglonego wyglądu i oddzieli się od oocytu minus dwóch.Gdy owulacja nastąpi nieuchronnie, natychmiast rozpocznij nagrywanie wideo w szerokim polu. Proksymalny oocyt jest oznaczony przez minus-jeden bezpośrednio przed spermateką, gdzie przechowywane są plemniki. Najnowszy zarodek znajduje się najbliżej spermateki, ale wewnątrz macicy.Fala wapniowa wykazywała dwufazowy wzór, rozpoczynający się gwałtownym rozbłyskiem, po którym następowała fala fluorescencji przemieszczająca się od punktu wejścia w kierunku przeciwległego bieguna. Sygnał wapniowy zaobserwowano natychmiast po wejściu do spermateki w wiodącej oocycie minus-jeden, ale nie w końcowej oocycie minus-dwie. Zarodki in utero i ex-utero wykazywały sygnał fluorescencyjny w pojedynczej komórce podczas embriogenezy.

in-vivo-visualization-calcium-transients-during-fertilization-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje technikę wizualizacji wczesnych etapów embriogenezy u nicienia Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia poklatkowa wczesnego embrionogenezy u Caenorhabditis elegans

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów Ca2+ do rejestrowania zmian w aktywności neuronalnej u zachowujących się robaków Caenorhabditis elegans.

Ratiometryczne obrazowanie wapnia poszczególnych neuronów w zachowaniu Caenorhabditis elegans

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Poznaj metodę wizualizacji sygnałów wapniowych podczas zapłodnienia i wczesnego rozwoju u C. elegans za pomocą reportera CaFE. Technika ta umożliwia badanie dynamiki wapnia w komórkach bez konieczności iniekcji barwników.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Przeglądaj więcej filmów