Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Nasze prace koncentrują się na opracowaniu narzędzi regulujących aktywność fosfataz tyrozynowych. Zastosowaliśmy system regulowany rapamycyną do kilku fosfataz i wykazaliśmy, że zapewnia on specyficzną i czasową regulację naszego interesującego nas białka. Naszym celem było określenie zmian morfologicznych wywołanych aktywacją fosfatazy SHIP-2.

Narzędzie RapR pozwoliło nam określić przejściowe efekty aktywacji fosfatazy w komórkach i określiliśmy złożone, specyficzne skutki fosfatazy biorącej udział w rozprzestrzenianiu się i migracji komórek. Dodatkowo określiliśmy zachowania tej samej fosfatazy sterowane domeną. Przyczyniło się to do naszego zrozumienia mechanizmów fosfatazy w regulacji fotodynamiki morfów komórek i dalszej sygnalizacji.

Nasze narzędzie RapR oferuje możliwość specyficznej i czasowej regulacji fosfatazy, która jest przedmiotem zainteresowania. Po wprowadzeniu do fosfatazy, domena iFKBP działa jak przełącznik allosteryczny, który po związaniu z rapamycyną przywraca aktywność fosfatazy, działając jako przełącznik włączania. Możemy również wykorzystać system regulowany przez rapamycynę do rekonstrukcji kompleksów sygnałowych.

Nasze odkrycia przy użyciu narzędzia RapR otworzyły drzwi do określenia wpływu interaktomii SHIP-2s na jej zdolność do regulowania aktywności komórek. Odkryliśmy, że SHIP-2 w wiązaniu domeny SH2 ma kluczowe znaczenie w retrakcji komórek. Korzystając z narzędzia RapR, możemy dokładniej zbadać, którzy wiążący partnerzy mogą być odpowiedzialni za tę regulację.

Aby rozpocząć, uzyskaj komórki HEK-293T. Napompuj 800 000 komórek na studzienkę na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej w uzupełnionej pożywce DMEM. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby osiągnąć 60 do 80% płynności.

Następnie wymieszaj jeden mikrogram każdego DNA osocza z 200 mikrolitrami DMEM bez surowicy i sześcioma mikrolitrami odczynnika do transfekcji. Po 15 minutach inkubacji dozować 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej na studzienkę komórek. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Trzeciego dnia dodaj odpowiednią ilość rapamycyny lub etanolu oddzielnie do komórek i inkubuj je przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie umieść płytkę na lodzie i delikatnie umyj komórki trzema mililitrami zimnego PBS. Po usunięciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego rapamycynę lub etanol i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek.

Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i mikrowirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby sprawdzić poziom ekspresji, należy przelać 20 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować próbkę z 20 mikrolitrami 2x buforu Laemmli zawierającego 5% beta-merkaptoetanolu w temperaturze od 95 do 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Na początek należy wyhodować i przygotować komórki HEK-293T wykazujące ekspresję RapR-Shp2 do immunoprecypitacji. Aby przygotować sefalozę, dodaj zawieszone białko G Sepharose do 1,5-mililitrowej probówki. Po dodaniu buforu do lizy należy mikrowirować probówkę przez jedną minutę przy 2 000 g i ostrożnie usunąć bufor do lizy.

Następnie ponownie zawiesić Sepharose w 380 mikrolitrach buforu do lizy, kilkakrotnie odwracając rurkę. Inkubować sefarozę z BSA i przeciwciałem na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po umyciu sefalozy, jak pokazano wcześniej, użyj odciętej końcówki, aby ostrożnie ponownie zawiesić ją w buforze do lizy.

Dodaj supernatant z przygotowanych komórek HEK-293T wyrażających RapR-Shp2 do 50 mikrolitrów zawieszonej sefalozy w nowej 1,5-mililitrowej probówce i inkubuj probówkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 do dwóch godzin. Na początek uzyskaj komórki HEK-293T eksprymujące RapR-Shp2 i przeprowadź immunoprecypitację białkiem G Sepharose. Po immunoprecypitacji przemyć Sepharose dwa razy każdy 0,5 mililitra buforu do lizy, a następnie 0,5 mililitra buforu do przemywania wodą.

Usuń jak najwięcej bufora po ostatnim zakręceniu. Następnie dodać 40 mikrolitrów mieszaniny buforu fosfo-paksyliny imidazolu do każdej próbki z jedną rapamycyną mikromolową lub bez niej. Delikatnie przesuń rurkę i natychmiast umieść ją w shakerze grzewczym na 40 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Ustawić wytrząsarkę grzewczą na 1 000 obrotów na minutę, aby zapewnić pełne mieszanie próbki. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 40 mikrolitrów 2x buforu Laemmli do każdej próbki i inkubuj je w temperaturze od 95 do 100 stopni przez pięć minut. Po ostygnięciu próbek załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki na żel poliakrylamidowy SDS o gradiencie od 4 do 15%.

Uruchom standardowy protokół Western blot przy użyciu membran PVDF. Na koniec osusz za pomocą przeciwciała Anti-FLAG w celu wykrycia konstruktu RapR-Shp2 i anty-fosfo-paksyliny w celu wykrycia fosforylowanej paxilliny w próbkach. Aktywny RapR-Shp2 nie wykazywał fosfo-paksyliny, podobnie jak konstytutywnie aktywny Shp2, co wskazuje na zachowaną pełną aktywność.

Nieaktywny RapR-Shp2 i dominujący ujemny Shp2 wykazywały podobne poziomy fosfo-paksyliny, co wskazuje na brak aktywności, gdy jest nieaktywny.