Name: Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj system regulowany rapamycyną do kontroli aktywności fosfataz tyrozynowych w żywych komórkach HEK-293T. Metoda umożliwia badanie mechanizmów SHIP-2 w sygnalizacji komórkowej i migracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Jordan Fauser za jej wkład w rozwój RapR-Shp2 i związanych z nim protokołów. Prace zostały wsparte nagrodą 5R35GM145318 przyznaną przez NIGMS, nagrodą R33CA258012 przyznaną przez NCI oraz nagrodą P01HL151327 przyznaną przez NHLBI.

Temporal Regulation of Phosphatase Activity with the Rapamycin-Regulated System

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki w zakresie opracowywania, charakterystyki i stosowania fosfataz kontrolowanych chemicznie. Narzędzie RapR-Shp2 opiera się na przełączniku regulowanym rapamycyną umieszczonym w domenie katalitycznej Shp2. Mocną stroną tego narzędzia jest specyficzność i ścisła kontrola czasowa aktywności fosfatazy. Narzędzie ma zastosowanie do innych fosfataz i w połączeniu z wcześniej opisaną technologią RapR-TAP pozwala na rekonstrukcję poszczególnych dalszych szlaków sygnałowych26. Unikalne możliwości podejścia RapR pozwoliły naukowcom zidentyfikować przejściowe zdarzenia wywołane aktywacją Shp2 i przeanalizować specyficzne szlaki sygnałowe regulujące poszczególne procesy morfodynamiczne. 
Na konstrukcję fosfatazy RapR wpływa kilka krytycznych czynników. Dobrze rozdzielona struktura krystaliczna domeny katalitycznej badanej fosfatazy jest bardzo pomocna w wyborze miejsca insercji iFKBP. Jednak ze względu na duże podobieństwo strukturalne między fosfatazami tyrozynowymi, wyrównanie sekwencji aminokwasowych domen katalitycznych może dostarczyć wystarczających informacji do identyfikacji miejsca insercji, jak pokazano na podstawie wyrównania Shp2 do PTP1B i PTPPest (Figura 2). Dla RapR-Shp2, Val406, znajdujący się w miejscu sprzężonym z krytyczną katalityczną pętlą WPD przez β-nić, został wybrany jako najbardziej optymalne miejsce insercji. To samo miejsce insercji może skutkować skuteczną regulacją innych PTPaz, jak wykazano dla PTP1B i PTP-PEST12 (Figura 2A).
Jeśli fosfataza, która jest przedmiotem zainteresowania, jest białkiem wielodomenowym, informacje strukturalne o organizacji domen pomogą zapobiec zakłócaniu innych funkcji PTPazy. Kolejnym czynnikiem wpływającym na konstrukcję optymalnej RapR-PTPazy jest to, ile aminokwasów powinno zostać zastąpionych przez wstawiony iFKBP. Większe i bardziej elastyczne pętle indukcyjne w PTPazie mogą wymagać dodatkowego skrócenia, aby zapewnić ścisłą regulację aktywności katalitycznej przez iFKBP. Podobnie, długość i skład łączników łączących iFKBP z PTPazą będą miały wpływ na skuteczność regulacji. Krótkie łączniki składające się z pojedynczej reszty Gly zapewnią ściślejszą regulację, ale mogą zmniejszyć maksymalną aktywność enzymu, jeśli wprowadzą trwałe zniekształcenia strukturalne, nawet gdy iFKBP jest związany z rapamycyną i FRB. Średniej długości łączniki Gly-Ser-Gly zapewniają większą elastyczność, ale mogą nie być wystarczająco sztywne dla niektórych PTPaz. Długie łączniki złożone z Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly pomogą zapobiec tworzeniu się niezamierzonych struktur drugorzędowych, które mogą wpływać na regulację PTPazy. RapR-Shp2 został przetestowany ze wszystkimi trzema typami łączników; Łącznik Gly-Ser-Gly okazał się najbardziej optymalny. 
Kluczowym aspektem decydującym o pomyślnym opracowaniu narzędzi RapR jest ustanowienie solidnego testu fosfatazy i obecność odpowiednich kontroli. Porównanie aktywności fosfatazy RapR z aktywnością dominująco-ujemnych i konstytutywnie aktywnych wersji POI pozwala ocenić nieszczelność konstruktu RapR i zakres aktywacji. Ponadto brak defosforylacji przez konstytutywnie aktywną fosfatazę lub zmniejszona fosforylacja przez dominującego mutanta ujemnego będzie wskazywał na niewłaściwe warunki reakcji. 
W przypadku testu fosfatazy warunki reakcji będą wymagały optymalizacji dla każdej PTPazy. Dostosowanie temperatury, czasu reakcji i warunków buforowych będzie zależeć od interesującej PTPazy. Energiczne mieszanie próbek ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wystarczającego wymieszania PTPazy związanej z sefarozą i jej substratu. Wreszcie, jeśli opisany test fosfatazy nie jest optymalny dla konkretnej interesującej nas PTPazy, wówczas jako alternatywny test można zastosować reakcję fosfatazy z użyciem fosforanu p-nitrofenylu jako substratu27.
W eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek podczas przygotowywania próbki należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. W przedstawionym protokole zastosowano pożywkę L-15 opartą na buforze HEPES, który nie jest wrażliwy na stężenie CO2 . Jeśli pożądane jest użycie pożywki na bazie wodorowęglanów, należy uzupełnić HEPES w celu utrzymania pH próbki lub zastosować komorę do obrazowania środowiskowego uzupełniającą CO2 . Protokół zaleca nałożenie warstwy oleju mineralnego na próbkę, aby zapobiec parowaniu i uprościć dodawanie rapamycyny. Można zastosować inne konfiguracje wykorzystujące komorę do obrazowania środowiskowego lub komorę zamkniętą, ale dodanie rapamycyny może być trudniejsze. Podczas dodawania rapamycyny do komórek podczas obrazowania należy upewnić się, że etap się nie przesunie, a komórki nie zostaną zakłócone. Wszelkie dodatkowe ruchy próbki podczas procesu obrazowania będą utrudniać gromadzenie danych. Intensywność oświetlenia i czas ekspozycji powinny być utrzymywane na niskim poziomie, aby zmniejszyć fototoksyczność, szczególnie w przypadku obrazowania długotrwałego. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednia wydajność transfekcji komórek. Stosunek 1:1 DNA FRB do RapR-Shp2 zapewnia odpowiednią ekspresję, ale w przypadku nowych konstruktów stosunek ten będzie wymagał korekty. Aby zapewnić skuteczną aktywację, FRB powinien być wyrażany na wyższym poziomie niż fosfataza RapR.
Ograniczeniem narzędzi opartych na RapR jest brak możliwości szybkiej dezaktywacji. Zmiana pożywki usuwa zewnątrzkomórkową rapamycynę, ale dezaktywacja konstruktów RapR może trwać wiele godzin ze względu na bardzo ścisłe wiązanie rapamycyny z konstruktem RapR. Szybką inaktywację można osiągnąć poprzez dodanie inhibitora miejsca aktywnego PTPazy. Jednak potencjalne niezamierzone skutki inhibitora mogą sprawić, że interpretacja wyników będzie trudna. Ponadto, nawet w połączeniu z inhibitorem PTPazy, podejście RapR nie może być stosowane w cyklicznych eksperymentach aktywacji/inaktywacji. Kolejnym ograniczeniem systemu RapR jest brak kontroli przestrzennej. Konstrukty RapR ulegają globalnej ekspresji, a zatem są aktywowane w całym komórce. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest zastosowanie rapamycyny w klatce, która może być uwalniana przez światło bliskie UV lokalnie w komórce28,29. Co więcej, narzędzie RapR może być modyfikowane w celu uzyskania aktywacji fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania w określonym kompleksie białkowym lub w określonej lokalizacji subkomórkowej. Poprzez przyłączenie partnera wiążącego lub znacznika subkomórkowego do FRB, RapR-PTPaza będzie ukierunkowana na określone białko lub miejsce w komórce. Wreszcie, rapamycyna jest dobrze scharakteryzowanym immunosupresorem poprzez hamowanie mTOR i może wpływać na sygnalizację komórkową, potencjalnie zakłócając sygnalizację interesującej PTPazy. Aby przezwyciężyć ten problem, dobrą alternatywą są nieimmunosupresyjne analogi rapamycyny (iRap i AP21967). Wykazano, że oba związki regulują konstrukty RapR14.

Proteinowe fosfatazy tyrozynowe stanowią krytyczną rodzinę białek uczestniczących w licznych zdarzeniach sygnalizacyjnych komórek. Wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w regulacji proliferacji, migracji i apoptozy komórek1,2,3. W konsekwencji dysregulacja proteinowych fosfataz tyrozynowych prowadzi do szeregu wyniszczających chorób i zaburzeń4,5,6,7. Badanie funkcji fizjologicznych fosfataz tyrozynowych oraz ich roli w rozwoju tych patologii było historycznie utrudnione z powodu braku narzędzi niezbędnych do badania zawiłości sygnalizacji fosfataz8.
Tradycyjnie fosfatazy bada się za pomocą metod, które nie posiadają pożądanej swoistości i/lub nie zapewniają kontroli czasowej nad ich aktywnością. Te krytyczne ograniczenia dostępnych narzędzi utrudniają analizę specyficznych ról fosfataz w szlakach sygnałowych. Nadekspresja mutantów konstytutywnie aktywnych i dominująco negatywnych lub obniżenie ekspresji fosfatazy zapewniają swoistość, lecz brakuje im kontroli czasowej, a ponadto często mogą one wywołać mechanizmy kompensacyjne, które zamaskują rzeczywistą funkcję enzymu.
Inhibitory farmakologiczne umożliwiają czasową regulację fosfataz. Jednakże wiele inhibitorów fosfataz wykazuje znaczną niespecyficzność ze względu na silnie konserwatywny skład centrum aktywnego w fosfatazach tyrozynowych9. Ponadto, z powodu ograniczeń konstrukcyjnych, inhibitory celujące w centrum katalityczne wykazują słabą przepuszczalność przez błony komórkowe10. Kolejnym ograniczeniem inhibitorów jest fakt, że pozwalają one jedynie na badanie efektów inaktywacji fosfataz11. Istnieje zatem potrzeba opracowania narzędzi umożliwiających specyficzną, regulowaną czasowo aktywację fosfataz. Narzędzia te pozwolą badaczom zidentyfikować bezpośrednie efekty aktywacji fosfataz, oddzielając je od wielu równoległych kaskad sygnalizacyjnych, często aktywowanych przez bodźce biologiczne. Co istotne, ścisła czasowa kontrola aktywności umożliwia identyfikację przejściowych zdarzeń indukowanych przez fosfatazę oraz pozwala odróżnić efekty ostrej od przedłużonej aktywności fosfatazy. Połączenie regulacji czasowej z analizą mutacyjną pozwoli na szczegółowe przeanalizowanie specyficznych ról poszczególnych domen fosfatazy oraz zbadanie jej sygnalizacji w dół kaskady12.
Aby zniwelować brak pożądanych właściwości w istniejących narzędziach, grupa Karginova opracowała system regulowany rapamycyną (RapR)13,14,15. System RapR wykorzystuje zmodyfikowaną domenę przełączającą, iFKBP, która umożliwia allosteryczną regulację białka docelowego (POI). Wstawienie domeny iFKBP w pozycji allosterycznie sprzężonej z centrum katalitycznym POI sprawia, że staje się ono podatne na regulację za pomocą rapamycyny. Wobec braku rapamycyny domena iFKBP zaburza centrum katalityczne ze względu na immanentnie wysoką dynamikę strukturalną iFKBP, co prowadzi do inaktywacji POI. Dodanie rapamycyny indukuje oddziaływanie iFKBP z współwyrażanym białkiem FRB (Rysunek 1). Powoduje to stabilizację domeny przełączającej, co w konsekwencji przywraca strukturę i funkcję domeny katalitycznej POI. W ten sposób narzędzie to umożliwia specyficzną i regulowaną czasowo aktywację POI.
<img alt="Schemat aktywacji białka; aktywacja Shp2 poprzez tworzenie kompleksu iFKBP/FRB; oddziaływanie molekularne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat systemu RapR-Shp2 regulowanego rapamycyną. RapR umożliwia allosteryczną aktywację białka docelowego po dodaniu rapamycyny. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: iFKBP = wstawialne FKBP12; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę; R = rapamycyna; Shp2 = fosfataza tyrosynowa białka zawierająca domenę homologii Src-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Narzędzie RapR można zastosować do różnych rodzin białek. Może ono służyć do regulacji kinaz białkowych, jak i fosfataz12,14. Niniejszy protokół skupia się na zastosowaniu narzędzia RapR do kontroli fosfatazy Shp2. Shp2 jest powszechnie ekspresowaną białkową fosfatazą tyrozynową, która bierze udział w procesach sygnalizacyjnych, takich jak proliferacja, migracja, immunomodulacja i różnicowanie1,16,17,18. Dysregulację Shp2 powiązano z licznymi nowotworami litego narządu, białaczką szpikową oraz zaburzeniami rozwojowymi5,7. Jednakże Shp2 stała się obiektem tych samych niedoskonałości narzędziowych, które opisano powyżej. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowano i scharakteryzowano RapR-Shp2, czyli konstrukt Shp2 podlegający specyficznej i czasowej regulacji12.
Przed opracowaniem RapR-Shp2 wiadomo było, że Shp2 bierze udział w migracji komórek19,20,21. Jednak jego konkretna rola w sygnalizacji zaangażowanej w ten proces nie była znana. Nie wiadomo było również, w jakiej skali czasowej Shp2 reguluje migrację komórek oraz jakie konkretne zmiany morfodynamiczne wywołuje w różnych punktach czasowych swojej aktywacji. Ponadto nie było jasne, czy ostra i przedłużona aktywacja Shp2 wywoła różne efekty. Dzięki zastosowaniu RapR-Shp2 odkryto, że ostra aktywacja Shp2 indukuje przejściowe rozprzestrzenianie się komórek, zwiększenie liczby wypustek, polaryzację komórek oraz migrację. Zidentyfikowano również specyficzne szlaki sygnałowe poniżej Shp2, które regulują odrębne zmiany morfodynamiczne12. Niniejszy protokół zawiera szczegółowe informacje na temat projektu i charakterystyki RapR-Shp2, które mogą posłużyć jako wytyczne przy opracowywaniu i stosowaniu innych fosfataz RapR.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Szkiełka nakrywkowe 25 mm okrągłe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor</td><td></td><td></td> Laemmli <td>Na 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Komórki</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsos</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Komora komórkowa attofluoru</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Potrójna inaktywowana termicznie 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Opublikowano w 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red barwnik błonowy plazmatyczny</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a kompetentny komórki</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzym</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Ditiothreitol, Odczynniki Clelanda</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6</td><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Promega</td><td>E2692</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Gel</td></tr><tr><td>Gel Zielony Kwas nukleinowy Barwnik</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Żel ładujący Barwnik fioletowy 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Cells</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania ImageJ</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> imidazolowy <td>25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> <td>do lizy20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>Do</td> uruchomienia funkcji CellGeo użyto aktualizacji <td>CellGeo MathWorks</td><td>N/A</td> R <td>2022b</td></tr><tr>Oprogramowanie do<td>automatyzacji mikroskopii metamorficznej i analizy obrazu</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>NIE DOTYCZY MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele 12 dołków</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Klasa wodna</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Wielopasmowe lustro polichroiczne</td><td>Technologia Chroma</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanObiektyw SAPO 40x</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca i Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski Indywidualnie mocowane kołpaki</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion Plus Thermo</td><td>Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Membrany PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Bibuła filtracyjna Kanapki</td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sód</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>do elektroforezy</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-EGFR</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>przeciwciała 2232</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ERK 1/2</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antyflagowe</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-paxillin</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-EGFR Y992</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>przeciwciała 2235</td><td></td></tr><tr><td>Anty-fosfo-erk 1/2 T202/Y204 Sygnalizacja</td><td>komórkowa</td> przeciwciała <td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fosfo-paksyliny Y31</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anty-fosfo-PLC&gamma; Y783</td><td>Sygnalizacja komórkowa przeciwciała</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anty-PLC&gamma; </td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> przeciwciał <td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

Fosfatazy tyrozynowe to ważna rodzina enzymów, które regulują kluczowe funkcje fizjologiczne. Są one często rozregulowane w chorobach ludzkich, co czyni je kluczowymi celami badań biologicznych. Narzędzia, które umożliwiają regulację aktywności fosfatazy, odgrywają zasadniczą rolę w analizie ich funkcji. Tradycyjne podejścia, takie jak nadekspresja konstytutywnie aktywnych lub dominujących mutantów ujemnych lub regulacja w dół za pomocą siRNA, nie mają kontroli czasowej. Inhibitory fosfatazy często mają słabą swoistość i pozwalają badaczom jedynie określić, na jakie procesy wpływa hamowanie fosfatazy. 
Opracowaliśmy podejście chemogenetyczne, system regulowany przez Rapamycynę (RapR), który pozwala na allosteryczne regulowanie domeny katalitycznej fosfatazy, co umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy. System RapR składa się z domeny iFKBP wprowadzonej do miejsca allosterycznego w fosfatazie. Wewnętrzna dynamika strukturalna domeny RapR zakłóca domenę katalityczną, prowadząc do inaktywacji enzymu. Dodatek rapamycyny pośredniczy w tworzeniu kompleksu między iFKBP a koeksprymowanym białkiem FRB, który stabilizuje iFKBP i przywraca aktywność domenie katalitycznej fosfatazy. 
Ten system zapewnia wysoką specyficzność i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach. Unikalne możliwości tego systemu umożliwiają identyfikację zdarzeń przejściowych i badanie poszczególnych szlaków sygnałowych za fosfatazą. Protokół ten opisuje wytyczne dotyczące rozwoju fosfatazy RapR, jej charakterystyki biochemicznej oraz analizy jej wpływu na dalszą sygnalizację i regulację morfodynamiki komórki. Zawiera również szczegółowy opis strategii inżynierii białek, testów in vitro analizujących aktywność fosfatazy oraz eksperymentów obrazowania żywych komórek identyfikujących zmiany w morfologii komórek.

Rycina 4 przedstawia wyniki, jakich można spodziewać się w teście aktywności fosfatazy opartej na paksyllinie. W tym doświadczeniu aktywność konstytutywnie aktywnej i dominująco negatywnej fosfatazy Shp2 porównano z aktywnością aktywnego i nieaktywnego RapR-Shp2, wykorzystując poziom fosfo-paksylliny jako parametr odczytu. Konstrukty Shp2 poddano immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisem w protokole. Odczyty fosfo-paksylliny dla konstytutywnie aktywnego Shp2 oraz aktywnego RapR-Shp2 były zbliżone, co wskazuje, że wprowadzenie domeny RapR nie wpłynęło negatywnie na aktywny RapR-Shp2 i zachował on pełną aktywność po aktywacji. Wyniki dla dominująco negatywnego Shp2 i nieaktywnego RapR-Shp2 również były zbliżone, co dowodzi, że konstrukt RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Wskazuje to na prawidłowe zaprojektowanie fosfatazy RapR. Fosfo-substrat użyty w tym teście może się różnić w zależności od badanej fosfatazy.
Rycina 5, podobnie jak Rycina 4, porównuje konstytutywnie aktywną, dominująco negatywną oraz aktywną i nieaktywną formę RapR-Shp2. Eksperyment ten przeprowadzono bez immunoprecypitacji konstruktów. Został on zaprojektowany w celu scharakteryzowania efektów sygnalizacji downstream konstruktu RapR-Shp2 wewnątrz komórek. W tym przypadku konstrukty Shp2 wyekspresowano w komórkach HEK293T. Wykazano, że fosforylacja efektora downstream ERK1/2 wzrasta w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2, tak samo jak w próbce konstytutywnie aktywnej. Nieaktywny RapR-Shp2 nie wywołał tej zmiany. Wskazuje to, że sygnalizacja downstream Shp2 zostaje zachowana po włączeniu domeny RapR. Podobnie znane fosfo-substraty EGFR i PLCγ uległy defosforylacji w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2 w komórkach A431.
Wreszcie Rysunek 6 przedstawia wyniki aktywacji RapR-Shp2 w odniesieniu do morfodynamiki komórek HeLa. Po aktywacji RapR-Shp2 w komórkach zaobserwowano wzrost aktywności protrusyjnej oraz zwiększenie powierzchni komórek. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 jest wystarczająca do wywołania zmian morfodynamicznych w komórkach HeLa i może pozwolić badaczom na analizę specyficznych szlaków sygnałowych downstream odpowiedzialnych za ten efekt.
<img alt="Western blot wykazujący ekspresję białek po traktowaniu rapamycyną; prążki Paxillin, Flag-Shp2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki testu aktywności opartego na paksyllinie: Formy konstytutywnie aktywne, dominująco negatywne oraz RapR-Shp2 zostały poddane immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisanym protokołem. Poziomy pY31 paksylliny w obu próbkach CA i RapR-Shp2 były podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 wykazywał aktywność zbliżoną do CA Shp2 po aktywacji. Próbka nieaktywnego RapR-Shp2 nie wykazywała aktywności, podobnie jak próbka DN, co świadczy o braku „przeciekania” (leaky expression). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę homologii do Src-2; DN = dominująco negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza Western blot, sygnalizacja phospho-ERK, efekty rapamycyny, porównanie ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wyniki analizy lizatów komórkowych: Wykazano ekspresję konstytutywnie aktywnej, dominująco negatywnej oraz RapR-Shp2 w komórkach HEK293T, a następnie przeprowadzono protokół analizy lizatów całokomórkowych. W stanie nieaktywnym RapR-Shp2 nie aktywowało ERK1/2 poprzez fosforylację, podobnie jak w próbce DN Shp2. Wskazuje to, że RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Po aktywacji poziom fosforylacji ERK1/2 był zbliżony do poziomu w próbce CA Shp2, co świadczy o skutecznej aktywacji i przekazywaniu sygnału w dół szlaku przez Shp2. Podobnie, w komórkach A431 wykazujących ekspresję RapR-Shp2 zaobserwowano spadek fosforylacji zarówno EGFR, jak i PLCγ, które są znanymi substratami Shp2. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = fosfataza tyrozynowa białka zawierająca domenę homologii Src-2; DN = dominujący negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; ERK = kinaza regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi; GAPDH = gliceraldehyd-3-fosforan dehydrogenaza; EGFR = receptor epidermalnego czynnika wzrostu; PLCγ = fosfolipaza C gamma; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza zmian powierzchni komórek; wykresy przedstawiają efekty RapR-Shp2, znormalizowaną powierzchnię komórek, aktywność protruzyjną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza danych dotyczących powierzchni komórek i aktywności protruzyjnej na podstawie obrazowania na żywo: komórki HeLa zostały transfekowane RapR-Shp2 i poddane opisanemu protokołowi obrazowania na żywo. Dane analizowano zgodnie z protokołem analizy danych. Po aktywacji (oznaczonej pionową szarą linią) w komórkach HeLa zaobserwowano wzrost zarówno aktywności protruzyjnej, jak i powierzchni komórek. W próbkach negatywnych, w których wykazano jedynie ekspresję FRB, aktywność ta nie wystąpiła. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 indukuje szybkie zmiany morfodynamiczne w komórkach HeLa oraz sprzyja rozprzestrzenianiu się i tworzeniu wypustek komórkowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

Nasze prace koncentrują się na opracowaniu narzędzi regulujących aktywność fosfataz tyrozynowych. Zastosowaliśmy system regulowany rapamycyną do kilku fosfataz i wykazaliśmy, że zapewnia on specyficzną i czasową regulację naszego interesującego nas białka. Naszym celem było określenie zmian morfologicznych wywołanych aktywacją fosfatazy SHIP-2.Narzędzie RapR pozwoliło nam określić przejściowe efekty aktywacji fosfatazy w komórkach i określiliśmy złożone, specyficzne skutki fosfatazy biorącej udział w rozprzestrzenianiu się i migracji komórek. Dodatkowo określiliśmy zachowania tej samej fosfatazy sterowane domeną. Przyczyniło się to do naszego zrozumienia mechanizmów fosfatazy w regulacji fotodynamiki morfów komórek i dalszej sygnalizacji.Nasze narzędzie RapR oferuje możliwość specyficznej i czasowej regulacji fosfatazy, która jest przedmiotem zainteresowania. Po wprowadzeniu do fosfatazy, domena iFKBP działa jak przełącznik allosteryczny, który po związaniu z rapamycyną przywraca aktywność fosfatazy, działając jako przełącznik włączania. Możemy również wykorzystać system regulowany przez rapamycynę do rekonstrukcji kompleksów sygnałowych.Nasze odkrycia przy użyciu narzędzia RapR otworzyły drzwi do określenia wpływu interaktomii SHIP-2s na jej zdolność do regulowania aktywności komórek. Odkryliśmy, że SHIP-2 w wiązaniu domeny SH2 ma kluczowe znaczenie w retrakcji komórek. Korzystając z narzędzia RapR, możemy dokładniej zbadać, którzy wiążący partnerzy mogą być odpowiedzialni za tę regulację.Aby rozpocząć, uzyskaj komórki HEK-293T. Napompuj 800 000 komórek na studzienkę na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej w uzupełnionej pożywce DMEM. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby osiągnąć 60 do 80% płynności.Następnie wymieszaj jeden mikrogram każdego DNA osocza z 200 mikrolitrami DMEM bez surowicy i sześcioma mikrolitrami odczynnika do transfekcji. Po 15 minutach inkubacji dozować 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej na studzienkę komórek. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Trzeciego dnia dodaj odpowiednią ilość rapamycyny lub etanolu oddzielnie do komórek i inkubuj je przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie umieść płytkę na lodzie i delikatnie umyj komórki trzema mililitrami zimnego PBS. Po usunięciu PBS dodać 300 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego rapamycynę lub etanol i zeskrobać komórki za pomocą skrobaka do komórek.Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra i mikrowirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby sprawdzić poziom ekspresji, należy przelać 20 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować próbkę z 20 mikrolitrami 2x buforu Laemmli zawierającego 5% beta-merkaptoetanolu w temperaturze od 95 do 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.Na początek należy wyhodować i przygotować komórki HEK-293T wykazujące ekspresję RapR-Shp2 do immunoprecypitacji. Aby przygotować sefalozę, dodaj zawieszone białko G Sepharose do 1,5-mililitrowej probówki. Po dodaniu buforu do lizy należy mikrowirować probówkę przez jedną minutę przy 2 000 g i ostrożnie usunąć bufor do lizy.Następnie ponownie zawiesić Sepharose w 380 mikrolitrach buforu do lizy, kilkakrotnie odwracając rurkę. Inkubować sefarozę z BSA i przeciwciałem na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Po umyciu sefalozy, jak pokazano wcześniej, użyj odciętej końcówki, aby ostrożnie ponownie zawiesić ją w buforze do lizy.Dodaj supernatant z przygotowanych komórek HEK-293T wyrażających RapR-Shp2 do 50 mikrolitrów zawieszonej sefalozy w nowej 1,5-mililitrowej probówce i inkubuj probówkę na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 1,5 do dwóch godzin. Na początek uzyskaj komórki HEK-293T eksprymujące RapR-Shp2 i przeprowadź immunoprecypitację białkiem G Sepharose. Po immunoprecypitacji przemyć Sepharose dwa razy każdy 0,5 mililitra buforu do lizy, a następnie 0,5 mililitra buforu do przemywania wodą.Usuń jak najwięcej bufora po ostatnim zakręceniu. Następnie dodać 40 mikrolitrów mieszaniny buforu fosfo-paksyliny imidazolu do każdej próbki z jedną rapamycyną mikromolową lub bez niej. Delikatnie przesuń rurkę i natychmiast umieść ją w shakerze grzewczym na 40 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza.Ustawić wytrząsarkę grzewczą na 1 000 obrotów na minutę, aby zapewnić pełne mieszanie próbki. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 40 mikrolitrów 2x buforu Laemmli do każdej próbki i inkubuj je w temperaturze od 95 do 100 stopni przez pięć minut. Po ostygnięciu próbek załaduj 15 mikrolitrów każdej próbki na żel poliakrylamidowy SDS o gradiencie od 4 do 15%.Uruchom standardowy protokół Western blot przy użyciu membran PVDF. Na koniec osusz za pomocą przeciwciała Anti-FLAG w celu wykrycia konstruktu RapR-Shp2 i anty-fosfo-paksyliny w celu wykrycia fosforylowanej paxilliny w próbkach. Aktywny RapR-Shp2 nie wykazywał fosfo-paksyliny, podobnie jak konstytutywnie aktywny Shp2, co wskazuje na zachowaną pełną aktywność.Nieaktywny RapR-Shp2 i dominujący ujemny Shp2 wykazywały podobne poziomy fosfo-paksyliny, co wskazuje na brak aktywności, gdy jest nieaktywny.

development-application-rapamycin-regulated-tyrosine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

W tym badaniu zwiększyliśmy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany w stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand. Oddziaływania można wykreślić na dwie krzywe: krzywą proteolityczną i krzywą zależności od dawki. Jako przykładowy przypadek posłużyliśmy się oddziaływaniem mTOR-rapamycyna.

Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR

W tym badaniu szczegółowo opisujemy procedurę zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS, które wykazuje porównywalną patofizjologię do zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna. Omawiamy również to podejście w świetle hamującego działania rapamycyny na zwłóknienie jelit.

Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Jeffrey D. Rothstein opowiada o patologii i mechanizmach leżących u podstaw stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), postępach w badaniach nad ALS oraz obecnych strategiach opracowywania terapii.

ALS – choroba neuronów ruchowych: mechanizm i opracowywanie nowych terapii

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Poznaj system regulowany rapamycyną do kontroli aktywności fosfataz tyrozynowych w żywych komórkach HEK-293T. Metoda umożliwia badanie mechanizmów SHIP-2 w sygnalizacji komórkowej i migracji.

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Przeglądaj więcej filmów