Struktura-kierowana projektowanie i opracowywanie nowych inhibitorów cyklofiliny A oraz pochodnych ganoderiol-F: podejście In-Silico
23 czerwca 2026
Przedstawiamy tutaj protokół strukturalnie ukierunkowanego projektowania interakcji wiązania białko-ligand między Sanglifehriną A a Cyklofiliną A/Ganoderiol-F, niezbędny w odkrywaniu nowych leków. Stabilność zespołu ligand-receptor została oceniona za pomocą symulacji dynamiki molekularnej.
To badanie koncentruje się na projektowaniu nowych inhibitorów Cyklofiliny A i roli przeciwnowotworowej skierowanej na oś Cyklofilina DCDK i hamującej proliferację komórek nowotworowych. Kluczowym wyzwaniem jest osiągnięcie optymalnej geometrii interakcji ligand-receptor i utrzymanie stabilnych kompleksów ligand-białko w dynamicznych warunkach eksperymentalnych i fizjologicznych. Na początek otwórz plik 1NMK.
Zlokalizuj aminokwas argininę"na pozycji numer 55 i zapisz współrzędne X, Y i Z w interfejsie AutoDock. Otwórz menu Plik, wybierz Odczytaj cząsteczki. Wybierz plik 1NMK"i kliknij Otwórz.
Dodaj atomy wodoru, wybierając Edytuj, wybierając Wodór i klikając Dodaj. Następnie wybierz Tylko polarne"i potwierdź za pomocą OK. Następnie ponownie przejdź do menu Edytuj, wybierz Atomy i wybierz Przypisz typ atomu AD4. Następnie wybierz Ładunki"i wybierz Ładunki Kollmana.
Zapisz przygotowane receptor jako 1NMK. pdbqt"wybierając Plik, wybierając Zapisz, ustawiając typ pliku i potwierdzając lokalizację zapisu. Następnie otwórz menu Ligand, wybierz Wejście.
Kliknij Otwórz, wybierz plik PDB i ponownie kliknij Otwórz. Gdy pojawi się okno informacyjne, przejrzyj szczegóły ligandu. Aby wykryć korzeń ligandu, wybierz Ligand, następnie wybierz Drzewo skrętu"i kliknij Wykryj korzeń.
Zapisz ligand, wybierając Ligand, wybierając Wyjście i klikając Zapisz jako PDBQT. Przygotuj siatkę receptora, wybierając Siatka, wybierając Makromolekuła, wybierając 1NMK i klikając Cząsteczka. Potwierdź ostrzeżenie i zapisz jako 1NMK.pdbqt.
Aby ustawić typy map, wybierz Siatka, następnie Ustaw typy map, Ligand. Wybierz Ligand"i w końcu ponownie wybierz Ligand". Następnie zdefiniuj centrum skrzynki siatki, wybierając Siatka, wybierając Skrzynka siatki i klikając Centrum.
Następnie wybierz atom i wprowadź współrzędne skrzynki siatki. Zapisz parametry siatki jako plik GPF. Skonfiguruj dokowanie, wybierając Dokowanie, następnie Makromolekuła"i Ustaw nazwę sztywnego pliku.
Przejdź do wymaganego folderu i kliknij 1NMK.pdbqt. aby go otworzyć, wybierz Dokowanie, wybierz Wyjście, kliknij Lamarckian GA i zapisz plik parametrów dokowania jako 1NMK.dpf. W terminalu Cygwin"wpisz cd C:i naciśnij enter; następnie wpisz cd project"i ponownie naciśnij enter.
Następnie wpisz cd molecules"i naciśnij enter. Następnie wpisz cd 3"i naciśnij enter. Wpisz polecenie AutoGrid", aby wygenerować mapy siatki i naciśnij enter, aby uruchomić AutoGrid.
Po wykonaniu, wpisz tail f 1NMK. glg"i naciśnij enter, aby zobaczyć postęp logu, wpisz polecenie symulacji dokowania molekularnego. Aby wygenerować plik logu dokowania, naciśnij enter, aby uruchomić AutoDock.
Następnie wpisz tail f 1NMK. dlg"i naciśnij enter, aby monitorować proces dokowania. Po utworzeniu wszystkich plików DLG przejdź do folderu 1 i otwórz plik DLG w programie WordPad, naciśnij Ctrl+F.
Wpisz słowo kluczowe wyszukiwania i naciśnij enter trzykrotnie, aby dotrzeć do tabeli RMSD. Skopiuj energię wiązania i odpowiednie informacje o uruchomieniu dla każdej cząsteczki z tabeli RMSD, skompiluj najlepsze 20 cząsteczek w arkuszu kalkulacyjnym z kolumnami utworzonymi dla numeru seryjnego, minimalnej energii wiązania i uruchomienia. W terminalu Cygwin"przejdź do określonego folderu cząsteczek w katalogu projektu.
Wpisz polecenie, aby wyodrębnić koordynaty zdobytego ligandu z DLG i przyciąć dane. Naciśnij enter jeszcze raz, aby sfinalizować, potwierdzając utworzenie pliku 1NMK run PDBQT. Upewnij się, że plik 1NMK run PDB"został utworzony w tym samym folderze.
Następnie otwórz oprogramowanie PyMOL 2.5"i AutoDock"z pulpitu, a następnie otwórz plik receptora, aby wybrać strukturę receptora do wizualizacji. Otwórz odpowiedni plik konfiguracji ligandu dla wybranej cząsteczki i wyświetl załadowany ligand w obszarze roboczym 3D. Wybierz Ukryj wszystko"z menu, zaimportuj plik do Maestro"aby wizualizacja struktury, a następnie kliknij Ligand Interaction", aby uzyskać diagram interakcji ligandu.
Otwórz oprogramowanie UCSF Chimera"z pulpitu. Wybierz Plik, następnie Otwórz. Przejdź do dysku C, projektu i cząsteczek.
Wybierz plik 1NMK. pdb"i kliknij Otwórz. Z menu wybierz Reszta"i wybierz UNL Zoom", aby skupić się na regionie reszty UNL.
Wybierz Strefę. Następnie naciśnij OK", aby potwierdzić. Następnie wybierz Akcja.
Wybierz Etykieta, następnie wybierz Reszta"i wybierz Nazwa plus specyfikator", aby oznaczyć reszty. Otwórz Narzędzia, wybierz Analiza struktury, a następnie kliknij FindHBond. W oknie ustawień domyślnych FindHBond, zaznacz pola kolorowanie wiązań wodorowych, które nie spełniają ścisłych kryteriów"i Tylko znajdź wiązania wodorowe z zaznaczonymi.
Wyczyść zaznaczenie strefy, aby rozpocząć nowe badanie. Następnie wybierz parametry strefy i powiększ wyświetlanie molekularnego, aby obserwować niebieskie i pomarańczowe linie reprezentujące wiązania wodorowe. Na koniec zbadaj zwizualizowaną strukturę i policz całkowitą liczbę widocznych wiązań wodorowych.
Potwierdzenie dokowania
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na projektowaniu i walidacji nowych inhibitorów cyklofiliny A, celujących w oś cyklofilina D-CDK w celu zahamowania proliferacji komórek nowotworowych. Stosując podejście oparte na strukturze, badacze opracowali 117 cząsteczek ligandów i ocenili ich oddziaływania z receptorem enzymu Sanglifehrin A (1NMK) za pomocą dokowania molekularnego oraz symulacji dynamiki molekularnej. Przepływ pracy zintegrował wiele narzędzi obliczeniowych w celu optymalizacji wiązania ligand-receptor, oceny stabilności oraz zidentyfikowania kluczowych reszt oddziałujących pod kątem potencjalnego opracowania leków przeciwnowotworowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia nowotworów
- Komputerowe projektowanie leków
- Dokowanie i symulacje molekularne
Wstęp
- Cyklofilina A (Cyp A) jest zaangażowana w progresję nowotworów poprzez regulację proliferacji i przeżywalności komórek.
- Oś Cyklofilina D-CDK stanowi obiecujący cel terapeutyczny w onkologii.
- Pochodne ganoderiolu F wykazały potencjał jako cele onkogenne w wielu typach nowotworów.
- Dokładne przewidywanie oddziaływań ligand-receptor wymaga solidnego modelowania obliczeniowego.
Cel badania
- Zaprojektowanie nowych inhibitorów cyklofiliny A przy użyciu metod sterowanych strukturą.
- Ocena powinowactwa wiązania ligand-receptor oraz kompatybilności geometrycznej za pomocą dokowania.
- Potwierdzenie stabilności kompleksu poprzez symulacje dynamiki molekularnej.
- Identyfikacja kluczowych reszt aminokwasowych uczestniczących w tworzeniu wiązań wodorowych z ligandami wiodącymi.
Zastosowane metody
- Program Chemsketch do konstruowania 117 nowych cząsteczek ligandów będących inhibitorami cyklofiliny.
- Program AutoDock 4.2.6 do dokowania ligandów do białka w celu określenia optymalnej geometrii wiązania.
- Program PyMOL 2.5 do wizualizacji póz dokowania oraz oddziaływań ligand-receptor.
- Programy Chimera i Maestro do wykrywania i analizy wiązań wodorowych.
- Program Gromacs z polem siłowym CHARMM 36 do symulacji dynamiki molekularnej kompleksu ligand-receptor.
Główne wyniki
- Arginina 55 w receptorze 1NMK utworzyła wiązanie wodorowe z ligandem w odległości 1,53 Å.
- Kluczowe reszty oddziałujące obejmowały Asn, Gly, Thr, Lys, Ile, His, Phe oraz Cys.
- Ligand utworzył 45 wiązań wodorowych z receptorem, co wskazuje na silny potencjał wiązania.
- Pole dokowania (docking box) zostało wycentrowane w punkcie X=38,86, Y=10,987, Z=40,734 w receptorze 1NMK.
- Symulacja MD w programie Gromacs wykazała stabilizację kompleksu po 1 ns, przy spójnych wartościach RMSD oraz promienia żyracji.
- Układ zachował równowagę w warunkach NVT/NPT, przy średniej gęstości ~1019 kg/m³ oraz stabilnym ciśnieniu i temperaturze (~300 K).
Wnioski
- Zaprojektowany kompleks ligand-receptor wykazuje wystarczającą stabilność, aby kontynuować jego rozwój jako terapeutyku przeciwnowotworowego.
- Arginina 55 odgrywa kluczową rolę w wiązaniu ligandu w centrum aktywnym cyklofiliny A.
- Zintegrowany schemat obliczeniowy skutecznie identyfikuje obiecujące inhibitory Cyp A.
- Dalsze prace skupią się na walidacji in vitro oraz in vivo w wielu typach komórek nowotworowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obliczeniowe projektowanie sterowane strukturą umożliwia szybką identyfikację inhibitorów cyklofiliny A z zoptymalizowanym wiązaniem do osi cyklofilina D-CDK, która jest zwalidowanym celem onkologicznym. Podejście to zmniejsza odsetek niepowodzeń na wczesnym etapie badań poprzez priorytetyzację ligandów z silnym przewidywanym zaangażowaniem w cel i stabilnością kompleksu. Opisany schemat postępowania wspiera identyfikację związków wiodących poprzez integrację dokowania, analizy oddziaływań i dynamiki molekularnej w celu ograniczenia ryzyka związanego z hipotezami mechanistycznymi przed syntezą.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modelowanie oddziaływań ligandów z cyklofiliną A w rozdzielczości atomowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez przewidywanie powinowactwa wiązania oraz zaangażowania kluczowych reszt, takich jak arginina 55.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do modulacji celu poprzez identyfikację ligandów tworzących liczne wiązania wodorowe, w tym 45 zaobserwowanych w kompleksie wiodącym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zwalidowane kompleksy ligand-receptor odpowiednie do opracowania analiz biochemicznych lub biofizycznych.
- Powtarzalność: Standaryzuje parametry dokowania (centrum siatki X=38.86, Y=10.987, Z=40.734) oraz scoring w celu zapewnienia spójności w wirtualnym przesiewie.
- Skalowalność: Umożliwia ocenę dużych bibliotek ligandów (skonstruowano 117 cząsteczek) przy użyciu zautomatyzowanych procesów dokowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Koncentruje się na cyklofilinie A, która jest zaangażowana w proliferację i przeżywalność komórek nowotworowych w wielu typach guzów.
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia pomost mechanistyczny od projektowania in silico do przyszłej walidacji in vitro i in vivo.
- Minimalizacja ryzyka: Ocenia złożoność stabilności za pomocą RMSD oraz promienia żyracji, wspierając decyzje go/no-go przed syntezą związków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając wstępną selekcję komputerową przed badaniami laboratoryjnymi.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez modelowanie mechanizmu hamowania funkcji cyklofiliny A w osi D-CDK przez ligandy.
- Przesiewanie: Dostarczanie wyników gotowych do analizy w formie ustandaryzowanych póz dokowania i rankingów energii wiązania w celu priorytetyzacji związków.
- Analityka: Zapewnienie ilościowych wskaźników (energia wiązania, liczba wiązań wodorowych, RMSD) do porównania efektywności ligandów i optymalizacji ich struktury.
- Badania translacyjne: Powiązanie wyników obliczeniowych z etapem przedklinicznym poprzez walidację stabilności kompleksu w symulacji trwającej 1000 ps.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stworzenie powtarzalnego schematu postępowania w celu celowania w inne oddziaływania białko-białko przy użyciu tej samej integracji narzędzi (Chemsketch, AutoDock, PyMOL, Gromacs).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Minimalizacja ryzyka mechanistycznego poprzez przewidywanie oddziaływań ligand-receptor oraz identyfikację krytycznych aminokwasów wiążących.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przepływu pracy pomiędzy narzędziami redukuje zmienność i umożliwia współpracę międzyzespołową.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez filtrowanie związków na podstawie przewidywanej stabilności i zaangażowania celu.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie priorytetyzacji chemotypów skorygowanej o ryzyko, w oparciu o wysokie wyniki dokowania oraz stabilność potwierdzoną za pomocą MD.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wiedza specjalistyczna w zakresie modelowania molekularnego, oprogramowania do dokowania (AutoDock) oraz platform symulacyjnych (Gromacs).
- Dostęp do infrastruktury obliczeniowej do generowania siatek, dokowania i symulacji MD układów białko-ligand.
- Standaryzacja protokołów przygotowania ligandów, przypisywania ładunków (Kollman) oraz zapisywania parametrów siatki.
- Uwagi dotyczące adaptacji dla różnych systemów receptorowych poza 1NMK, w tym ponowne centrowanie pola siatki i analiza specyficzna dla poszczególnych reszt.
- Ograniczenia obejmują zależność od dokładności pola siłowego (CHARMM 36) oraz skal czasowych symulacji niezbędnych do uchwycenia rzadkich zdarzeń wiązania.
