Name: Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Odkryj metodologię oceny wpływu ksenobiotyków na mitochondria szczurów, komarów i kleszczy przy użyciu testów respirometrycznych i enzymatycznych. To podejście wspiera rozwój bezpiecznych biopestycydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" z Universidad Industrial de Santander za sfinansowanie grantu nr 3739 odpowiadającego projektowi "Formulacja ixodicide i ixorepellentu zaprojektowana w laboratorium i zatwierdzona w terenie w celu zapobiegania inwazji kleszczy u bydła."

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki "Comité de ética en investigación científica CEINCI": Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Przemysłowego w Santander. Ponadto testy te były zgodne z wytycznymi Arrive i były zgodne z kolumbijską ustawą nr 84 z 1989 r. (rozdział IV, art. 23-26) i rezolucją 8430 (1993, tytuł IV, art. 83-93), która reguluje badania na zwierzętach w Kolumbii.
UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przeczytanie rozdziału o fosforylacji oksydacyjnej w dowolnej książce biochemicznej przed rozpoczęciem tego protokołu.
1. Odczynniki i roztwory
<ol>
	<li>Aby wyizolować mitochondria wątroby szczura, przygotuj 250 ml buforu do izolacji mitochondriów: 250 mM D-mannitolu, 10 mM HEPES pH 7,2 i 1 mM EGTA. Wyjąć 50 ml buforu izolacyjnego (będzie to nazywane buforem izolacyjnym bez BSA), a następnie dodać 0,2 g BSA do pozostałych 200 ml (będzie to nazywane buforem izolacyjnym z BSA).</li>
	<li>Aby homogenizować larwy Aedes aegypti, przygotuj 100 ml buforu: 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA pH 7,2.</li>
	<li>Przygotować bufor reakcyjny: 80 mM roztwór buforowy fosforanu sodu, pH 7,4, 50 μM EDTA.</li>
	<li>Przygotować zapas odczynników używanych do aktywności enzymatycznej przy pH 7,2, jak opisano poniżej: 25 mM NADH (świeżo przygotowany do każdego testu), 2 M bursztynian sodu, 4 mM cytochrom c (świeżo przygotowany do każdego testu), 200 μM rotenon, 0,5 mM KCN, 6 mM 2,6-dichlorofenolindofenol (DCPIP), 100 mM metosiarczan fenazyny (PMS) i 60 mM żelazocyjanek potasu. 
UWAGA: Do wszystkich eksperymentów i przygotowania odczynników używano wody ultraczystej o rezystywności 18,2 MΩ·cm w temperaturze 25 °C. Woda ta została wytworzona przy użyciu systemu oczyszczania Milli-Q, zapewniającego usuwanie zanieczyszczeń organicznych, nieorganicznych i mikrobiologicznych do poziomów poniżej wykrywalnych limitów, dzięki czemu nadaje się do zastosowań biochemicznych i biologii molekularnej o wysokiej czułości.</li>
</ol>
2. Sekcja wątroby, homogenizacja i izolacja mitochondriów od wątroby szczura
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem umieść wszystkie materiały i na lodzie, upewniając się, że wszystkie materiały są lodowate podczas całego testu, aby uniknąć uszkodzenia mitochondriów.</li>
	<li>Umieść 10 ml buforu do izolacji mitochondriów w lodowatej stożkowej probówce.</li>
	<li>Poddaj eutanazji samca szczura Wistar przez dekapitację szyjki macicy, unikając stosowania CO2, który może zakłócać testy oddychania. W tym celu Komitet ds. Etyki w Badaniach Naukowych Uniwersytetu Przemysłowego w Santander (CEINCI) zatwierdził metody na podstawie rezolucji 13 z 2022 r. 
	UWAGA: Szczury nie powinny ważyć więcej niż 170 g; Tłuszcz może również wpływać na analizy oddechowe.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie (około 4-5 cm) sterylnym skalpelem przez część brzuszną szczura.</li>
	<li>Całkowicie wypreparuj wątrobę, gdy widoczny jest obszar brzucha. Wątroba szczura jest wielopłatkowym narządem, ciemnoczerwonym o wymiarach ok. 10 cm x 5 cm.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić wątrobę w lodowatym buforze izolacyjnym i dwukrotnie przepłukać tym podłożem.</li>
	<li>Drobno zmielić wątrobę (o wielkości mniejszej niż 1 cm) ostrymi nożyczkami na szalce Petriego z 10 ml pożywki izolacyjnej.</li>
	<li>Umieść roztwór w probówce homogenizatora tkanek Potter Elvehjem i ostrożnie homogenizuj co najmniej dziesięć razy, z niską prędkością (~390 obr./min).</li>
	<li>Przenieść roztwór do stożkowej probówki i odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie wlej supernatant do nowej stożkowej probówki. Wyrzuć osad z częścią tkanki, krwi i nienaruszonych składników komórkowych.</li>
	<li>Napełnij probówkę większą ilością buforu izolacyjnego (~35 ml) i odwiruj przy 6000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad (mitochondria) w nowym buforze izolacyjnym bez BSA. 
	UWAGA: Do podparcia mitochondriów zaleca się użycie miękkiej szczoteczki.</li>
	<li>Następnie odwirować przy 7000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wyizolowane mitochondria w 2 ml buforu izolacyjnego bez BSA.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą metody Bradforda lub podobnej14.</li>
</ol>
3. Homogenizacja kolonii i larw Aedes aegypti.
UWAGA: Dla tej procedury kolonia Ae. aegypti była trzymana w klatkach hodowlanych (40 cm × 40 cm × 40 cm) w warunkach insektowych, takich jak wilgotność (70% ± 5%), fotoperiod (12:12) i temperatura (27 ± 5 °C). Jaja zebrano na bibule filtracyjnej.
<ol>
	<li>Upewnij się, że jaja wykluwają się na tacach z przefiltrowaną i odchlorowaną wodą na tydzień przed eksperymentem. Zidentyfikuj stadium rozwojowe na podstawie procesu linienia w cyklu larw. Obserwuj każdy proces linienia, aby zweryfikować jego stan L1, L2 i L3. Gdy larwa wejdzie do L3, odczekaj maksymalnie 12 godzin, aby zebrać materiał.</li>
	<li>Zbierz co najmniej 100 larw Ae. aegypti w instar L3-L4 w wodzie bez chloru (~30 ml wody). Weź larwy za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Przefiltrować larwy za pomocą bibuły filtracyjnej, wypłukać zebrane larwy i ponownie zawiesić je w buforze homogenizacyjnym Aedes aegypti (~2 ml).</li>
	<li>Przenieś roztwór z larwami do probówki homogenizatora tkanek Potter Elvehjem i ostrożnie homogenizuj co najmniej dziesięć razy z prędkością ~390 obr./min.</li>
	<li>Przenieś homogenizowaną tkankę i przefiltruj ją przez strzykawkę z watą szklaną, aby usunąć duże pozostałości egzoszkieletu.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą metody Bradforda lub podobnej15. 
	UWAGA: Nie jest konieczne izolowanie mitochondriów od larw komarów; Możliwe jest oszacowanie działania ksenobiotyków za pomocą ekstraktu białkowego uzyskanego na tym etapie.</li>
</ol>
4. Określenie wpływu ksenobiotyków na mitochondrialny łańcuch transportu elektronów
UWAGA: Ten protokół został zaprojektowany do oceny wpływu ksenobiotyków na bioenergetykę mitochondriów na izolowane mitochondria z wątroby szczura i homogenizowanej tkanki owadów.
Testy są podzielone na dwa: polarograficzne (NADH i oksydaza bursztynianowa) i spektrofotometryczne (dehydrogenaza NADH - kompleks I, dehydrogenaza bursztynianowa - kompleks II, reduktaza cytochromu c - kompleks III i oksydaza cytochromu c - kompleks IV).
<ol>
	<li>Testy polarograficzne: W tym celu należy użyć respirometrii o wysokiej rozdzielczości, aby zmierzyć całkowite utlenienie NADH i bursztynianu przez zużycieO2 i podać wyniki jako NADH i oksydazę bursztynianową.
	<ol>
		<li>Kalibruj przyrząd codziennie przed rozpoczęciem testów. Ten krok może się różnić w zależności od użytego oksygramu. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>W przypadku kalibracji Oroborosa należy dodać pożywkę reakcyjną do komór z nadmiarem co najmniej 0,2 ml powyżej objętości komory doświadczalnej (2 ml), aby wypełnić komorę i kapilarnę iniekcyjną pożywką.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włączyć mieszadła po dodaniu pożywki.</li>
		<li>Poczekaj, aż sygnał stężenia tlenu ustabilizuje się i zapisz go.</li>
		<li>Aby uzyskać kalibrację tlenu zerowego, dodaj mitochondria, zawiesiny komórek, drożdże piekarskie lub ditionit (zalecane są drożdże piekarskie), które umożliwiają wyczerpanie tlenu, i zapisz to. Poczekaj, aż sygnał osiągnie poziom tła (zwykle ± 2 pmol/mL/s dla systemu O2k).</li>
		<li>Wykonaj czynności NADH i oksydazy bursztynianowej, monitorując zużycie tlenu podczas dodawania buforu reakcyjnego, 0,1 mg białka (homogenizowanego mitochondrialnie lub larw) i substratu (0,17 mM NADH lub 10 mM bursztynianu sodu) do komory.</li>
		<li>Użyj inhibitorów białka transportu elektronów, aby potwierdzić, że obserwowane zużycie tlenu jest spowodowane mitochondrialnym łańcuchem oddechowym. Popularne to rotenon 1 μM i KCN 1mM16. W komorze oksygraficznej dodać odczynniki zgodnie z tabelą 1 (ważna jest kolejność).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy spektrofotometryczne 
	UWAGA: Aby ocenić transport elektronów przez kompleksy mitochondrialne, przeprowadzono testy enzymatyczne i zmierzono je za pomocą spektrofotometru i sztucznych akceptorów elektronów, takich jak PMS, DCPIP i cytochrom c. Zaleca się pomiar jednego enzymu dziennie. Przygotować i odczynniki co najmniej jeden dzień przed testami. Niektóre związki są światłoczułe; więcej zaleceń znajduje się w tabeli 2.
	<ol>
		<li>Dla aktywności dehydrogenazy NADH układy reakcyjne zawierają 50 mM roztworu buforowego fosforanu o pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg / ml białka mitochondrialnego, 1 μM rotenonu i 1 mM KCN. W komorze spektrofotometru dodaj odczynniki zgodnie z tabelą 2 (kolejność jest ważna)17. Zalecane kroki są następujące:
		<ol>
			<li>Przygotować 100 ml buforu fosforanowego zmieszanego z EDTA i dwukrotnie sprawdzić, czy pH się nie zmienia. Bufor należy przechowywać w lodówce, ale obowiązkowe jest przechowywanie go w temperaturze pokojowej (RT; około 25 °C) podczas oznaczania.</li>
			<li>Przygotować świeże roztwory podstawowe rotenonu, KCN, NADH i żelazocyjanku potasu (stabilne do 4 godzin). Sugerowana objętość to 1 ml stężonych roztworów (patrz pierwsza kolumna tabeli).</li>
			<li>Jeśli badany związek ma niską rozpuszczalność w wodzie, należy uwzględnić dodatkową kontrolę aktywności enzymu w projekcie eksperymentalnym, używając tylko rozpuszczalnika związku.</li>
			<li>Po pierwsze, należy monitorować aktywność dehydrogenazy NADH poprzez redukcję żelazocyjanku potasu przy 420 nm. Oblicz jego stężenie na podstawie molowego współczynnika ekstynkcji 1,04 mM-1·cm-1. Spektrofotometr posiada opcję obliczania maksymalnej aktywności w reakcji; Sprawdź instrukcję obsługi. Następnie należy podzielić zgłoszoną aktywność przez stężenie białka użytego do uzyskania specyficznej aktywności enzymu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ocenić aktywność dehydrogenazy bursztynianowej przez dodanie 20 mM bursztynianu sodu i 1 mM metosiarczanu fenazyny (PMS) z 60 μM 2,6-dichlorofenolindofenolem (DCPIP) jako sztucznymi akceptorami elektronów. W komorze spektrofotometru dodaj odczynniki zgodnie z tabelą 3 (kolejność jest ważna)17. Zalecenia są następujące:
		<ol>
			<li>Przygotować ten sam bufor, który jest używany do dehydrogenazy NADH. Utrzymuj go w tych samych warunkach.</li>
			<li>Przygotuj świeże roztwory podstawowe bursztynianu, PMS i DCPIP. Sugerowana objętość to 1 ml stężonych roztworów. Roztwory PMS i DCPIP należy przygotować w tym samym dniu testu.</li>
			<li>Jeżeli badany związek ma niską rozpuszczalność w wodzie, należy uwzględnić w projekcie doświadczalnym dodatkową kontrolę aktywności enzymu.</li>
			<li>Monitorować utlenianie bursztynianu przez redukcję DCPIP przy długości fali 600 nm. Oblicz jego stężenie na podstawie molowego współczynnika ekstynkcji 21,0 mM−1·cm−1, stosując prawo Beera. Następnie należy podzielić zgłoszoną aktywność przez stężenie białka użytego do uzyskania specyficznej aktywności enzymu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz aktywność reduktazy cytochromu c (kompleks III) przy użyciu NADH lub bursztynianu jako substratów utleniających się. Dzięki temu enzymowi transport elektronów z kompleksu I (przy użyciu NADH) lub kompleksu II (przy użyciu bursztynianu) przechodzi do ubichinonu, a następnie do kompleksu III, który przekazuje elektrony do cytochromu c. Po tej reakcji następuje redukcja cytochromu c. Przygotować układ reakcyjny zawierający 50 mM roztworu buforu fosforanowego o pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg białka mitochondrialnego, 50 μM VADH i 0,1 mM KCN. W komorze spektrofotometru dodaj odczynniki zgodnie z tabelą 4 (kolejność jest ważna)18. Zalecenia są następujące:
		<ol>
			<li>Przygotować ten sam bufor, który jest używany do dehydrogenazy NADH. Utrzymuj go w tych samych warunkach.</li>
			<li>Użyj tych samych NADH i KCN z dehydrogenazy NADH.</li>
			<li>Jeżeli badany związek ma niską rozpuszczalność w wodzie, należy uwzględnić w projekcie doświadczalnym dodatkową kontrolę aktywności enzymu.</li>
			<li>Monitorować redukcję cytochromu c przy 550 nm i obliczyć jego stężenie na podstawie współczynnika ekstynkcji molowej wynoszącego 19,8 mM−1·cm−1, stosując prawo Beera. Następnie należy podzielić zgłoszoną aktywność przez stężenie białka użytego do uzyskania specyficznej aktywności enzymu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz oksydazę cytochromu c (kompleks IV) wyrażoną jako aktywność oksydazy cytochromu c. W tym celu należy przygotować reakcję systemową zawierającą 50 mM roztworu buforowego fosforanu, pH 7,4, 2 mM EDTA i 0,1 mg białka mitochondrialnego (Tabela 5). W przypadku tych testów enzymatycznych należy zredukować cytochrom c poprzez zmieszanie równomolowych ilości cytochromu c i ditionitu sodu, zapewniając całkowitą redukcję cytochromu c.</li>
		<li>Następnie przepuścić otrzymaną mieszaninę przez usieciowaną kolumnę żelu dekstranowego przy użyciu tego samego roztworu buforowanego fosforanem, co faza ruchoma. Następnie określ ilościowo zebrane frakcje za pomocą spektrofotometru przy 550 nm19. Zalecenia są następujące:
		<ol>
			<li>Użyj tego samego buforu, który jest używany do dehydrogenazy NADH. Utrzymuj go w tych samych warunkach.</li>
			<li>Jeżeli badany związek ma niską rozpuszczalność w wodzie, w projekcie doświadczenia należy uwzględnić dodatkową kontrolę aktywności enzymu.</li>
			<li>Monitorować utlenianie cytochromu c przy długości fali 550 nm i obliczyć jego stężenie na podstawie współczynnika ekstynkcji molowej wynoszącego 19,8 mM−1·cm−1, stosując prawo Beera. Następnie należy podzielić zgłoszoną aktywność przez stężenie białka użyte do uzyskania aktywności właściwej enzymu. 
			UWAGA: Plik arkusza kalkulacyjnego przedstawiający proces obliczania aktywności właściwej enzymów, mierzonej za pomocą zużycia tlenu i spektrofotometrii, jest dołączony jako plik uzupełniający 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Changing Mitochondrial Function for Therapeutic and Bioinsecticide Applications

<ol><li>Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in health and diseases.</a> Cells. 9 (5), 1177(2020).</li>
<li>Kummer, E., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+protein+synthesis+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of protein synthesis in mitochondria.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (5), 307-325 (2021).</li>
<li>Bock, F. J., Tait, S. W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+multifaceted+regulators+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as multifaceted regulators of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (2), 85-100 (2019).</li>
<li>Fulda, S., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mitochondria+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting mitochondria for cancer therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (6), 447-464 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+target+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22MedComm%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a target in cancer treatment.</a> MedComm. 1 (2), 129-139 (2020).</li>
<li>Duque, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+activity+of+essential+oils+from+American+native+plants+against+Aedes+aegypti+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+an+introduction+to+their+possible+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Insecticidal activity of essential oils from American native plants against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): an introduction to their possible mechanism of action.</a> Sci Rep. 13 (1), 2989(2023).</li>
<li>Kesari, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+natural+biomolecule+picein+attenuates+Menadione+induced+oxidative+stress+on+neuroblastoma+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria.</a> Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).</li>
<li>Vanegas-Estévez, T., Duque, F. M., Urbina, D. L., Vesga, L. C., Mendez-Sanchez, S. C., Duque, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+elucidation+of+an+insecticide+from+natural+compounds+targeting+mitochondrial+proteins+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Design and elucidation of an insecticide from natural compounds targeting mitochondrial proteins of Aedes aegypti.</a> Pestic Biochem Physiol. 198, 105721(2024).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeted+nanocarriers+doubled+the+toxicity+of+oxidative+phosphorylation+and+ATP+synthesis+disruptive+insecticides+against+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Nano%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda.</a> Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).</li>
<li>Lees, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insecticide+screening+platforms+indicate+that+Mitochondrial+Complex+I+inhibitors+are+susceptible+to+cross-resistance+by+mosquito+P450s+that+metabolise+pyrethroids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids.</a> Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).</li>
<li>Leung, M. C. K., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+target+of+organophosphate+and+carbamate+pesticides%3A+Revisiting+common+mechanisms+of+action+with+new+approach+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies.</a> Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).</li>
<li>Al-Harbi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+insecticidal+effects+of+plants+essential+oils+extracted+from+basil%2C+black+seeds+and+lavender+against+Sitophilus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae.</a> Plants. 10 (5), 829(2021).</li>
<li>Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+activities+of+aromatic+plant+extracts+and+essential+oils+against+Sitophilus+oryzae+and+Callosobruchus+chinensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stored+Prod+Res%22%5BJournal%5D)">Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis.</a> J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradford+assay+for+determining+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bradford assay for determining protein concentration.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).</li>
<li>Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+the+oxidative+phosphorylation+of+rat+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).</li>
<li>Gonçalves, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+biological+activity+of+the+essential+oil+from+Thapsia+minor%2C+a+new+source+of+geranyl+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate.</a> Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).</li>
<li>Somlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+des+lactico-cytochrome+c+reductases+%28d-et+l-%29+de+la+levure+aerobie+par+les+lactates+%28d-+et+l%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Gen+Subj%22%5BJournal%5D)">Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l).</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).</li>
<li>Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+Oxidase+from+Bakers%27+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast.</a> J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).</li>
<li>Nelson, D. L., Cox, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%3A+International+Edition%22">Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition</a>. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function+in+permeabilized+and+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells.</a> J Vis Exp. 120, e54985(2017).</li>
<li>Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+mitochondrial+calcium+influx+in+isolated+mitochondria+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells.</a> J Vis Exp. (134), e57225(2018).</li>
<li>Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydroquinoline%2F4%2C5-dihydroisoxazole+hybrids+with+a+remarkable+effect+over+mitochondrial+bioenergetic+metabolism+on+melanoma+cell+line+B16F10%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10.</a> Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).</li>
<li>Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efecto+del+aceite+esencial+de+Eucalyptus+citriodora+sobre+el+metabolismo+energ%C3%A9tico+mitocondrial%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Colomb+Qu%C3%ADm%22%5BJournal%5D)">Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial.</a> Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).</li>
<li>Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+to+design+insecticides+against+Aedes+aegypti+using+in+silico+and+in+vivo+analysis+of+different+pharmacological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).</li>
<li>Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncouplers+act+synergistically+with+the+fumigant+phosphine+to+disrupt+mitochondrial+membrane+potential+and+cause+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death.</a> Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).</li>
<li>Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mitochondrial+uncoupling+protein+4+and+ATP-sensitive+potassium+channel+cumulatively+decreases+superoxide+production+in+insect+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria.</a> Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).</li>
<li>Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mitochondrial+electron+transport+chain+and+oxidative+stress+induced+by+alkaloid-like+%CE%B1-aminonitriles+on+Aedes+aegypti+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae.</a> Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).</li>
<li>Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affectation%2C+DNA+damage+and+AChE+inhibition+induced+by+Salvia+officinalis+essential+oil+on+Aedes+aegypti+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).</li>
<li>Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cymbopogon+flexuosus+%28nees+ex+steud.%29+w.+watson+essential+oil+effect+on+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Essent+Oil+Res%22%5BJournal%5D)">Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics.</a> J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Do zbadania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów wykorzystano metodę spektrofotometryczną i polarograficzną o wysokiej rozdzielczościO2. W badaniu szczegółowo oceniono wpływ olejku eterycznego Cymbopogon flexuosus i karwakrolu na utlenianie NADH i bursztynianu, a także transport elektronów przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów, przy użyciu dwóch różnych modeli biologicznych: wyizolowanych mitochondriów z wątroby szczura i homogenizowanych larw Aedes aegypti. Dodatkowo z...

Mitochondria zawsze były nazywane elektrownią komórek ze względu na ich chemiczne wytwarzanie energii podczas procesu fosforylacji oksydacyjnej1,2. Poza ich głównymi podstawowymi funkcjami metabolicznymi, mitochondria są również zaangażowane w wiele innych procesów komórkowych, począwszy od wewnątrzkomórkowych poziomów regulacji Ca2 +, procesów zapalnych i produkcji reaktywnych form tlenu po procesy indukcji śmierci komórki3. Bioenergetyka mitochondriów i ich rozregulowanie są związane z procesami wewnątrzkomórkowymi, które wpływają na funkcje komórkowe i ogólny stan zdrowia. Wywołało to rosnące zainteresowanie badaniami nad farmaceutycznym potencjałem ukierunkowanym na funkcję mitochondriów w celu opracowania innowacyjnych terapii i bezpiecznych bioproduktów4,5,6. Ponadto zrozumienie skomplikowanych wzajemnych zależności procesów mitochondrialnych i ich wpływu na funkcje komórkowe ma kluczowe znaczenie dla opracowania terapii celowanych i przedstawienia możliwości projektowania bioproduktów do kontroli chorób przenoszonych przez wektory i inwazji szkodników7,8.
Ukierunkowanie ksenobiotyków na konkretne składniki łańcucha transportu elektronów pojawiło się jako strategia modulowania funkcji mitochondriów w celu generowania biopestycydów. Wykazano, że naturalne i syntetyczne związki zawarte w preparatach pestycydowych, takie jak pestycydy ukierunkowane na mitochondria na bazie nanocząstek, wpływają na funkcję mitochondriów poprzez zmniejszenie potencjału mitochondrialnego i syntezy ATP w S. frugiperda9.
Dodatkowo, większość karbaminianów i produktów na bazie pyretroidów została zgłoszona jako inhibitory kompleksu I u komarów; jednak ich przedłużona ekspozycja stworzyła pewne populacje odporne na pyretroidy w Anopheles gambiae, często związane z podwyższonym poziomem P450, które mogą metabolizować te substraty10,11. Podobnie, rośliny i ich olejki eteryczne, ekstrakty i metabolity wtórne zostały udokumentowane jako potencjalne środki owadobójcze o szerokim zakresie śmiertelności w różnych stadiach rozwoju owadów12,13. Aktywność owadobójcza tych naturalnych związków może być związana z hamowaniem transportu elektronów w określonym punkcie mitochondrialnego łańcucha oddechowego poprzez modulację produkcji reaktywnych form tlenu, potencjału mitochondrialnego ΔΨm i syntezy ATP, które mogą wyzwalać procesy śmierci komórki6,8.
Naturalne związki, jako źródła formulacji pestycydów, oraz ich wpływ na mitochondria odgrywają kluczową rolę w projektowaniu nowych i bezpiecznych biopestycydów. W tym kontekście, w niniejszym artykule opisano metodologię identyfikacji zdolności ksenobiotyków do aktywacji lub hamowania transportu elektronów przez kompleksy mitochondrialne. To kompleksowe podejście pozwala na precyzyjny pomiar wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów przy użyciu różnych substratów, z wykorzystaniem zarówno metod respirometrycznych, jak i spektrofotometrycznych. Metodologia ta została zastosowana do analizy funkcji mitochondriów kluczowych gatunków wektorów, w tym Aedes aegypti, co doprowadziło do teoretyzowania obecności białek rozprzęgających i odrębnych preferencji substratów utleniających się specyficznych dla każdego gatunku.

<table><tbody><tr><td>2,6-dichlorofenolindofenol</td><td>Merck</td><td>119814</td><td>Przygotować w tym samym dniu użycia.</td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Carvacrol</td><td>Merck</td><td>W224511</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Merck</td><td>C2506</td><td>Światłoczuły konwerter przykryj go folią aluminiową. W roztworze należy go przechowywać w zamrażarce.</td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Merck</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Merck</td><td>>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna</td><td>Merck</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Merck</td><td>60178</td><td>W roztworze działa weel przez 2 tygodnie.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC Fotometr mikropłytkowy</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51119100</tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Oroboros O2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10203-03</td><td>https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/</td></tr> <tr><td>Metosiarczan fenazyny&nbsp;</td><td>Merck</td><td>P9625</td><td>Przygotować w tym samym dniu użycia.</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>244023</td><td>Przygotuj się w tym samym dniu użycia.</td></tr><tr>Rurka <td></td><td></td><td></td><td>do homogenizatora tkanek Potter Elvehjem</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Merck</td><td>557368</td><td>Rozpuszczalny w etanolu. Światłoczuły konwerter przykryj go folią aluminiową. W roztworze należy go przechowywać w zamrażarce.</td></tr><tr><td>Bursztynian sodu</td><td>Merck</td><td>S9637</td><td>W roztworze należy go przechowywać w zamrażarce.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td>Merck S0389</td><td></td></tr> <tr><td>i beta;-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej</td><td>Merck</td><td>N8129</td><td>Światłoczuły konwerter przykryj go folią aluminiową. W roztworze należy go przechowywać w zamrażarce.</td></tr></tbody></table>

odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

Mitochondria są często określane jako potęga komórki ze względu na ich kluczową rolę w produkcji energii poprzez łańcuch transportu elektronów (ETC). Ich znaczenie wykracza jednak daleko poza produkcję energii. Rozregulowanie bioenergetyki mitochondrialnej może wywołać kaskady wewnątrzkomórkowe, które wpływają na zdrowie i funkcjonowanie komórek. Biorąc pod uwagę ich znaczenie fizjologiczne, rośnie zainteresowanie badaniem potencjału farmakologicznego funkcji mitochondriów w celu opracowywania nowych terapii i bioproduktów. Modulacja bioenergetyki mitochondrialnej może zapewnić innowacyjne podejścia do rozwiązywania problemów, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne, choroby metaboliczne i nowotwory, a także do opracowywania bioproduktów do zwalczania szkodników i chorób przenoszonych przez wektory.
Ta praca przedstawia metodę oceny wpływu ksenobiotyków na łańcuch transportu elektronów (ETC) przy użyciu różnych substratów, w tym glutaminianu i NADH dla kompleksu I, bursztynianu dla kompleksu II oraz cytochromu c (zarówno utlenionego, jak i zredukowanego) dla kompleksów III i IV. Metodologia ta pozwala na ocenę aktywacji lub zahamowania transportu elektronów przez kompleksy mitochondrialne za pomocą respirometru i spektrofotometru. Mitochondria mogą pochodzić z izolowanych mitochondriów, rozdrobnionych komórek lub homogenizowanej tkanki różnych gatunków.
W laboratorium funkcja mitochondriów została przeanalizowana u szczurów Aedes aegypti i Wistar, ale ta metoda ma również zastosowanie do innych gatunków, takich jak Rhipicephalus microplus i Rhodnius prolixus. Podejście to stanowi podstawę do teoretyzowania na temat istnienia białek rozprzęgających i specyficznych dla gatunku preferencji substratów utlenialnych, na które wpływ mają ich unikalne wymagania energetyczne. Najnowsze odkrycia dostarczają cennych informacji na temat innowacyjnych strategii projektowania bioinsektycydów, które są ukierunkowane na funkcję mitochondriów, posiadając znaczny potencjał w skutecznym zwalczaniu chorób przenoszonych przez wektory i inwazji szkodników.

Przed analizą wyników uzyskanych przy użyciu niniejszego protokołu niezbędne jest przypomnienie podstaw biochemii łańcucha transportu elektronów w mitochondriach. Po pierwsze, NADH dostarcza parę elektronów do centrów utleniająco-redukcyjnych znajdujących się w kompleksie I. Tam rozpoczyna się transport elektronów, które przechodzą z kompleksu I do ubichinonu, następnie do kompleksu III, który przekazuje je na cytochrom c, i wreszcie do kompleksu IV, gdzie końcowym akceptorem elektronów jest tlen, redukowany do wody. Z d...

To badanie wprowadza metodologię badania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów za pomocą testów respirometrycznych i enzymatycznych. Bada modulację łańcucha transportu elektronów u różnych gatunków, dostarczając informacji na temat ukierunkowanego opracowywania biopestycydów przeciwko chorobom przenoszonym przez owady.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

Nasza grupa badawcza wykorzystuje mitochondria jako cel farmakologiczny do opracowywania różnych produktów, takich jak między innymi chemataputy, insektycydy. W tym filmie chcemy opisać metodologię oceny enzymów oddychania mitochondrialnego w bardziej przystępny, zrozumiały i użyteczny sposób. W naszym laboratorium opracowaliśmy protokół oceny różnego wpływu ksenobiotyków na mitochondria u szczurów, komarów i kleszczy, dostarczając pewnych informacji na temat specyficznej odpowiedzi mitochondrialnej.Podejście to wspiera biobezpieczną formułę pestycydów poprzez identyfikację zakłóceń bioenergetyki mitochondriów, które mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania toksyczności niedocelowej. Naszą różnicową przewagą jest protokół projektowania insektycydów, który rozpoczyna się od analizy in silico tysiąca cząsteczek, następnie walidacji in vitro tych, które spełniają kryteria bezpieczeństwa biologicznego, a kończy się testami in vivo. Ta metoda oszczędza czas i zasoby, jednocześnie przestrzegając najlepszych praktyk w produkcji pestycydów.W perspektywie średnioterminowej wybierzemy cząsteczki pochodzenia naturalnego, które można połączyć z modyfikacją genetyczną, celując w mitochondria owadów, dążąc do zwiększenia swoistości i bioasekuracji w organizmach niedocelowych. Na początek przygotuj 250 mililitrów buforu izolacyjnego mitochondriów z lub bez 0,2 grama BSA. Podać 10 mililitrów buforu do lodowato zimnej stożkowej probówki.Po eutanazji szczura należy całkowicie wyciąć jego wątrobę i umieścić ją w lodowatym buforze izolacyjnym, aby ją wypłukać. Po dwóch płukaniach zmielić tkankę wątroby ostrymi nożyczkami na szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów buforu izolacyjnego. Umieść roztwór w probówce homogenizatora tkanek Pottera-Elvehjema, aby homogenizować zmieloną tkankę co najmniej 10 razy z niską prędkością 390 obrotów na minutę.Następnie przenieść homogenizowany roztwór do stożkowej probówki i odwirować przy 600 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie wlej supernatant do nowej stożkowej probówki. Ponownie odwirować supernatant w temperaturze 7 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić powstały supernatant.Ponownie zawiesić izolowany osad mitochondrialny w dwóch mililitrach buforu izolacyjnego bez BSA. Sprawdź, czy jaja Aedes aegypti wykluwają się na tacach z przefiltrowaną odchlorowaną wodą na tydzień przed eksperymentem i monitoruj proces linienia larw. Gdy larwy osiągną stadium L3, odczekaj maksymalnie 12 godzin przed ich pobraniem.Za pomocą pipety Pasteura zbierz co najmniej 100 larw Aedes aegypti w początkach od L3 do L4 w około 30 mililitrach wody bez chloru. Po przefiltrowaniu przenieś roztwór z larwami do probówki homogenizatora tkanek Pottera-Elvehjema i dokładnie homogenizuj z prędkością około 390 obrotów na minutę co najmniej 10 razy. Przenieś homogenizowaną tkankę przez strzykawkę z watą szklaną, aby odfiltrować duże pozostałości egzoszkieletu.Na początek uzyskaj mitochondria wątroby szczura i homogenizowane larwy Aedes aegypti L3, L4. W przypadku testu polarograficznego należy kalibrować respirometr o wysokiej rozdzielczości każdego dnia przed rozpoczęciem jakichkolwiek testów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj pożywkę reakcyjną do komór, zapewniając nadmiar co najmniej 0,2 mililitra powyżej standardowej objętości komory doświadczalnej wynoszącej dwa mililitry.Monitoruj zużycie tlenu, aby zmierzyć aktywność NADH i oksydazy bursztynianowej po dodaniu buforu reakcyjnego, 0,1 miligrama białka i substratu. Poczekaj, aż sygnał stężenia tlenu ustabilizuje się i zapisz go. Dodaj inhibitory białka transportu elektronów do komory, aby potwierdzić, że obserwowane zużycie tlenu jest spowodowane mitochondrialnym łańcuchem oddechowym.Dla aktywności dehydrogenazy NADH należy najpierw przygotować układ reakcyjny zawierający wszystkie wymagane składniki i dodać odczynniki do celi spektrofotometru. Monitoruj aktywność dehydrogenazy NADH z redukcją żelazocyjanku potasu na 420 nanometrach. Do obliczenia stężenia należy użyć współczynnika ekstynkcji molowej wynoszącego 1,04 na milimolowiec na centymetr.Na koniec należy podzielić zgłoszoną aktywność przez stężenie białka użyte do uzyskania określonej aktywności enzymatycznej. Podobnie ocenić dehydrogenazę bursztynianową i aktywność reduktazy cytochromu c lub kompleksu III przy użyciu odpowiednich mieszanin reakcyjnych. Aby zmierzyć aktywność oksydazy cytochromu c lub kompleksu dożylnego, należy przygotować układ reakcyjny i wymieszać równe ilości molowe cytochromu c i ditionitianu sodu, zapewniając całkowitą redukcję.Przepuścić zredukowaną mieszaninę przez usieciowaną kolumnę żelu dekstranowego, używając buforu fosforanowego jako fazy ruchomej. Określ ilościowo frakcje zebrane w odległości 550 nanometrów w spektrofotometrze. Na koniec oblicz stężenie ze współczynnikiem ekstynkcji molowej wynoszącym 19,8 na milimol na centymetr, stosując prawo Beera.Podziel zgłoszoną aktywność przez stężenie białka, aby uzyskać określone wyniki aktywności enzymatycznej. Kavacrol w dawce 9,7 części na milion zmniejszył aktywność oksydazy NADH o około 9,35%, podczas gdy olejek eteryczny Cymbopogon flexuosus lub EO w ilości 10 części na milion zmniejszył utlenianie NADH i redukcję tlenu o około 34%wskazując na zahamowanie transportu elektronów między kompleksem I a kompleksem IV.Kavacrol zmniejszył aktywność oksydazy bursztynianowej o około 10,84% u larw Aedes aegypti, i Cymbopogon flexuosus EO zmniejszał aktywność oksydazy bursztynianowej nawet o 50% w izolowanych mitochondriach wątroby szczura, co sugeruje hamowanie między kompleksem II a kompleksem IV.Kavacrol zmniejszał aktywność reduktazy cytochromu c NADH oraz utlenianie cytochromu c i redukcję tlenu w kompleksie IV w larwach Aedes aegypti, podczas gdy Cymbopogon flexuosus EO zmniejszał aktywność oksydazy cytochromu c o około 58% w mitochondriach wątroby szczura.

unveiling-xenobiotic-transport-effects-isolated-mitochondria-insights

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Odkryj metodologię oceny wpływu ksenobiotyków na mitochondria szczurów, komarów i kleszczy przy użyciu testów respirometrycznych i enzymatycznych. To podejście wspiera rozwój bezpiecznych biopestycydów.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych (Wideo) | JoVE Journal

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Przeglądaj więcej filmów