Name: Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji komórek zakażonych EcoHIV w mózgu myszy transgenicznych Tmem119-EGFP przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać rolę mikrogleju jako rezerwuaru wirusa HIV w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów NIH DA059310, DA058586, AG082539 i GM109091. Doceniamy hojny dar EcoHIV-NL4-3-EGFP od dr Potasha z Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny zatwierdził wszystkie protokoły dotyczące zwierząt (numer federalny: D16-00028). Wszystkie eksperymenty były ściśle zgodne z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy knock-in Tmem119-EGFP (30-dniowe, męskie, 23-26 g masy ciała) uzyskano ze źródła komercyjnego i umieszczono w obiektach akredytowanych przez AAALAC. Wszystkie zwierzęta były trzymane w 12/12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Szczegółowe informacje na temat zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Opakowanie EcoHIV-mScarlet w komórkach 293FT
<ol>
	<li>Inkubować 293 komórki FT w pokrytej żelatyną kolbie o długości 75cm2. Utrzymuj wzrost komórek do 30% zlewania się podczas transfekcji.</li>
	<li>Przeprowadzić transfekcję plazmidowego DNA (15 μg) EcoHIV-mScarlet (plik uzupełniający 1) przy użyciu Lipofectamine 3000 (22,5 μl) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Hodować komórki w pożywce DMEM z 10% surowicą FBS przez 3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać pożywkę warunkową z zawiesiną wirusa. Wirować przy 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać pewną ilość koncentratora Lenti-x (w stosunku 1:3) do mieszaniny wirusowej (na przykład 8 ml koncentratora z 24 ml mieszaniny wirusowej). Delikatnie odwróć rurkę pięć razy.</li>
	<li>Mieszaninę koncentratora wirusa i lenti należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Odwirować w temperaturze 1 500 × g, 45 min, 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe, za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad za pomocą wstępnie schłodzonych 200 μl 100 mM PBS. Wirus należy przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Szczegóły dotyczące pakowania EcoHIV-mScarlet w komórkach 293FT zostały opisane w naszym poprzednim badaniu16. Nie należy wirować ani wprowadzać pęcherzyków powietrza do roztworu wirusowego.</li>
</ol>
2. Zakażenie EcoHIV-mScarlet w pierwotnych komórkach mózgowych szczurów
<ol>
	<li>Wykonaj pierwotną izolację komórek mózgowych od płodów szczurów (18 dni) zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem16.</li>
	<li>Przenieś zdysocjowane komórki na wstępnie powlekane 12-dołkowe płytki z poli-L-lizyny ze szklanymi wkładkami zawierającymi 1 ml pożywki DMEM/F12 plus 10% FBS. Zamień pożywkę następnego dnia na pożywkę Neurobasel na suplement B27.</li>
	<li>Hodowla pierwotnych komórek mózgowych płodu w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 3 tygodnie.</li>
	<li>Dodać EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/ml) do pożywki hodowlanej. Inkubuj wyhodowane komórki mózgowe z EcoHIV-mScarlet przez 6 dni.</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 4% PFA i wykonaj barwienie immunologiczne na zakażonych komórkach mózgowych za pomocą specyficznych przeciwciał pierwotnych (CD11b / c, Iba1).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 40× w systemie mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
3. Zakażenie wirusem EcoHIV-mScarlet w pierwotnych komórkach glejowych od dorosłych myszy
<ol>
	<li>Znieczulać dorosłe myszy 5% sewofluranem przez 5 minut (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Wysterylizuj skórę głowy za pomocą 70% EtOH.</li>
	<li>Po potwierdzeniu, że mysz nie reaguje już na szkodliwe bodźce, użyj wysterylizowanych, zaostrzonych nożyczek, aby wykonać dekapitację. Przenieś głowę na nową szalkę Petriego wypełnioną 5 ml HBSS.</li>
	<li>Otwórz skórę głowy i przenieś tkankę mózgową na inną szalkę Petriego zawierającą 5 ml wysterylizowanego HBSS. Oderwij opony mózgowe i przenieś korę czołową do 2 ml HBSS.</li>
	<li>Do mieszaniny dodać 20 μl 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej; Delikatnie obracaj rurką co kilka minut.</li>
	<li>Przenieś zdysocjowane komórki do wstępnie pokrytej poli-L-lizyną kolby o długości 75cm2 zawierającej 10 ml pożywki DMEM/F12 i 10% FBS.</li>
	<li>Hodowla komórek w temperaturze 37 °C, inkubator 5% CO2 , aż do 90% konfluencji. Trawić komórki mózgowe za pomocą 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Subkulturuj komórki mózgowe w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem zawierających 5 ml pożywki wzrostowej DMEM/F12 do 80% konfluencji.</li>
	<li>Dodać EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/ml) do pożywki hodowlanej. Inkubuj komórki glejowe myszy przez 2 dni.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj czerwone (mScarlet) sygnały fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Retroorbitalne wstrzyknięcie wirusa EcoHIV-mScarlet myszom Tmem119-EGFP 
<ol>
	<li>Użyj 3% sewofluranu do znieczulenia myszy Tmem119-EGFP (zarówno samców, jak i samic myszy w wieku 30 dni), aż przestaną reagować na szkodliwe bodźce.</li>
	<li>Zabezpiecz myszy w pozycji bocznej z okiem do wstrzykiwań skierowanym do góry i oddychaj przez stożek nosowy, który jest połączony z systemem anestezjologicznym. Użyj odpowiedniego rozmiaru stożka nosowego, aby zapewnić ciągłe znieczulenie.</li>
	<li>Rozmrozić EcoHIV-mScarlet na lodzie. Wlać roztwór wirusa do strzykawki do wstrzykiwania wewnątrzgałkowego za pomocą igły 33 G.</li>
	<li>Umieść mysz w prawej bocznej pozycji leżącej i trzymaj głowę skierowaną w lewo. Określić położenie kantu przyśrodkowego jako miejsce wstrzyknięcia.</li>
	<li>Po podparciu oka powoli i delikatnie wbij igłę (kąt 45 stopni) w przyśrodkową kantę oka. Ostrożnie wprowadzić igłę do przodu do naczyń za gałką oczną (zatoka zadoczodołowa).</li>
	<li>Delikatnie wstrzyknąć 6,5 μl EcoHIV-mScarlet (1,26 × 106 TU/mL, obustronne szczepienie oka) do zatoki zaoczodołowej. Ostrożnie wyjmij igłę z zatoki zadoczodołowej i delikatnie uciskaj powieki, aby zapewnić hemostazę.</li>
	<li>Nałóż lubrykant na oko, aby zapobiec wysuszeniu lub uszkodzeniu rogówki.</li>
	<li>Pozwól myszom dojść do siebie w komorze regeneracyjnej z poduszką grzewczą, aż się obudzą. 
	UWAGA: Skos igły nie powinien być umieszczony zbyt głęboko, aby nie doszło do pęknięcia tętnic lub złamania kości. Czas infuzji wirusa zależy od wielu czynników (np. objętości wstrzyknięcia, miana, wielkości zwierzęcia). W przypadku infuzji wirusa EcoHIV zaobserwowano znaczącą ekspresję tydzień po wstrzyknięciach zaoczodołowych11,16,17.</li>
</ol>
5. Wizualizacja wycinków tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Głęboko znieczulij myszy za pomocą 5% sewofluranu. Przejdź do kroku 5.2, gdy myszy nie wykazują żadnej reakcji na szkodliwe bodźce i nie mają odruchów.</li>
	<li>Trzymaj myszy w pozycji leżącej na plecach w okapie chemicznym.</li>
	<li>Otwórz skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Oddziel membranę i otwórz klatkę piersiową nożyczkami.</li>
	<li>Włóż igłę 22 G1 1/2 do lewej komory. Otwórz prawe przedsionek nożyczkami.</li>
	<li>Wykonaj 50 ml wstępnie schłodzonego 100 mM PBS. Wykonaj 100 ml wstępnie schłodzonego 4% buforu paraformaldehydu16.</li>
	<li>Usuń cały mózg myszy 16.</li>
	<li>Utrwal na noc za pomocą 4% paraformaldehydu.</li>
	<li>Zabezpiecz tkankę mózgową za pomocą kleju tkankowego na metalowej platformie Vibratome. Wytnij odcinki koronalne o grubości 50 μm za pomocą ostrzy ze stali węglowej.</li>
	<li>Umieść plastry mózgu na szkiełkach za pomocą pędzla. Natychmiast dodaj 0,1 ml środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do każdej sekcji.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm na sekcjach mózgu. Suszyć szkiełka super-frost w ciemności przez 1 dzień.</li>
	<li>Skonfiguruj system mikroskopu konfokalnego na powiększenie 60× (A/1,4, olej) i ustaw interwał w płaszczyźnie Z na 0,15 μm, z otworkiem o rozmiarze 30 μm i promieniu otworka rzutowanym wstecznie 167 nm.</li>
	<li>Wykorzystaj długości fal 488 nm i 594 nm, aby uzyskać wielokanałowe obrazy obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania.</li>
</ol>

EcoHIV Infection in Tmem119-EGFP Mice for Studying Microglial Alterations

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
<li>González-Scarano, F., Martín-García, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The neuropathogenesis of AIDS.</a> Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

W niniejszym badaniu stwierdzono, że (1) nowy EcoHIV-mScarlet z powodzeniem infekował pierwotne komórki mózgowe szczura in vitro; (2) potrójne znakowanie mScarlet, CD11b / c i Iba1 zidentyfikowało mikroglej jako dominujący typ komórek dla tej ekspresji EcoHIV w komórkach mózgowych szczurów in vitro; (3) pierwotne komórki mózgowe myszy pochodzące od dorosłych in vitro dodatkowo dowodzą infekcji EcoHIV-mScarlet; (4) Dystrybucja EcoHIV-mScarlet w linii myszy knock-in Tmem119-EGFP wykazała specyficzny dla mikrogleju wzorzec dystrybucji infekcji EcoHIV.
Nowe badania sugerowały, że różne typy komórek mózgowych zidentyfikowanych w ośrodkowym układzie nerwowym (neurony, astrocyty, mikroglej, oligodendrocyty itp.) wykazują zmiany funkcjonalne i transkryptomiczne podczas HIV i zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV18,19. Na przykład astrocyty przyczyniają się do 30%-70% mózgu i wykonują nadzór w celu utrzymania homeostazy mózgu20. Astrocyty modulują również funkcje immunologiczne i regulują wydzielanie wielu cytokin i chemokin, szczególnie w sytuacji zapalenia mózgu i neurodegeneracji u HIV21,22. Zakażenie mikrogleju wirusem HIV nie tylko powoduje ciągłe uwalnianie białek wirusowych oraz prozapalnych cytokin i chemokin, ale także stanowi główne źródło rezerwuarów wirusa HIV 23,24,25,26. Ponadto aktywowany mikroglej przyczynia się do krytycznej funkcji immunologicznej w OUN; jednak przedłużona aktywacja może również nasilać neurodegenerację w progresji HIV10,27. Oligodendrocyty również odgrywają ważną funkcję, w tym uwalniają kilka neurotrofin (takich jak czynnik wzrostu nerwów, neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego itp.)28. Poprzednie badanie wykazało, że liczba oligodendrocytów znacznie zmniejszyła się w mózgach pacjentów z AIDS, co może wskazywać na bezpośrednie uszkodzenie oligodendrocytów przez białka wirusa HIV29. W związku z tym specyficzny typ manipulowanego komórkami modelu zakażenia wirusem HIV powinien dostarczyć podstawowych środków identyfikacji zróżnicowanych funkcji różnych komórek mózgowych po zakażeniu. W obecnym badaniu opracowano system biologiczny naśladujący cechy HIV-1 poprzez chimeryczną inokulację HIV (EcoHIV). To szczepienie wirusa HIV połączono również z linią myszy knock-in Tmem119-EGFP w celu wygenerowania i walidacji zmodyfikowanego mikrogleju modelu wirusa HIV u gryzoni.
Należy jednak zdać sobie sprawę z ograniczeń niniejszego badania. Było kilka ujemnych komórek Iba1 / CD11b / c, które prezentowały sygnały fluorescencyjne mScarlet in vitro. Inne typy komórek mózgowych, takie jak makrofagi mózgowe lub perycyty, mogą być zaangażowane w zakażenie EcoHIV lub alternatywnie, środowisko hodowli komórkowej może sprzyjać nieprawidłowym wzorcom infekcji w porównaniu z inokulacją in vivo . Przyszłe badania na całych zwierzętach powinny dokładniej wyjaśnić funkcję mikrogleju mScarlet+ w procesie zakażenia EcoHIV i dokładniej określić regionalną dystrybucję mikrogleju mScarlet+EcoHIV w mózgu. Ponadto zmiany neurokognitywne zachodzące w wyniku infekcji mikrogleju mogą być również uwzględnione w tym modelu gryzoni. Reasumując, inokulacja EcoHIV-mScarlet myszy knock-in Tmem119-EGFP zapewnia nowy model i strategię badawczą do badania mechanizmów zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV napędzanych przez mikroglej.

Pomimo ogromnych korzyści płynących z terapii antyretrowirusowej, osoby żyjące z HIV (PLWH) nadal doświadczają zaburzeń neurokognitywnych. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy neuronalne zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV (HAND), istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli HIV w celu dalszego wyjaśnienia udziału określonego typu komórek w NeuroHIV.
Transgeniczny szczur HIV-1, który ma konstytutywną ekspozycję na białka wirusa HIV-1, jest popularnym modelem gryzoni używanym do badania zaburzeń neuropoznawczych1,2,3,4i zmiany neuroanatomiczne5,6,7 związane z HAND. Funkcjonalna delecja domen gag i pol zapobiega replikacji wirusa, sprawiając, że transgeniczny szczur HIV-1 jest niezakaźny8,9. Niedawno, chimeryczny model zakażenia HIV (EcoHIV) u myszy został początkowo opisany przez Potash et al.10, a później rozszerzony na szczury, co może być korzystne dla dalszych badań nad HAND i zaburzeniami związanymi z używaniem substancji11. W tym nowym systemie biologicznym zaobserwowano ogólnoustrojowe zakażenie HIV-1 wraz z wieloma cechami klinicznymi HIV-1 u ludzi, w tym zajęciem limfocytów i makrofagów, przeciwwirusową odpowiedzią immunologiczną, inwazyjnością neuroinwazyjną i zapaleniem mózgu.
Mikroglej odgrywa kluczową rolę jako wyspecjalizowane makrofagi rezydujące w mózgu w utrzymaniu funkcji mózgu i homeostazy. Aby odróżnić mikroglej od blisko spokrewnionych typów komórek (np. monocytów krwi, makrofagów okołonaczyniowych, makrofagów oponowych), w obecnym badaniu wykorzystano linię myszy knock-in Tmem119-EGFP. Wcześniejsze badania wykazały, że białko transbłonowe 119 (Tmem119) wykazuje wyłącznie specyficzny dla mikrogleju wzorzec ekspresji w tkance mózgowej gryzoni i człowieka12,13,14,15. Sygnał EGFP u myszy knock-in Tmem119-EGFP zaobserwowano w całym mózgu i zlokalizowano specyficznie w komórkach mikrogleju.
W obecnym badaniu, myszom Tmem119-EGFP typu knock-in zaszczepiono wirusem EcoHIV-mScarlet i zidentyfikowano komórki z pozytywnym wynikiem dla EcoHIV w ośrodkowym układzie nerwowym. W tym miejscu przedstawiamy protokół inokulacji EcoHIV-mScarlet u myszy knock-in Tmem119-EGFP, zapewniając wiarygodny model terapeutycznie ukierunkowanego na zmiany mikrogleju w HIV.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, Mała igła Hub RN, (Styl punktowy: 3, Długość igły: 19,25 mm)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Żelatyna 75cm&sup2; Prostokątna kolba do hodowli komórkowych z przechyloną szyjką z technologią wentylacji Cap</td><td>Life 354488</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Mikrowirówka zatrzaskowa Probówki Biopur Safe-Lock</td> Life <td>Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Pióra Ostrza ze stali węglowej o podwójnej krawędzi</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Fisher&nbsp; Pożywki mikrobiologiczne: LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane przeciwciało anty-CD11b</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td> 1<td>:50 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Strzykawka do wstrzykiwania wewnątrzgałkowego (6,5 i mikro; L), Igła wymienna</td><td>Hamilton</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000&nbsp;</td><td>Technologie życia</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500216</td><td></td></tr> zestaw <tr><td>ELISA p24 związany z lentiwirusem Cell</td><td>Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Technologie o obniżonej wartości surowicy</td><td></td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiSlicer&nbsp; Wibracyjna krajalnica do tkanek</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro CA44 Klej tkankowy</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Profesjonalne Retrievery Okazów</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało monoklonalne anty-Iba1</td><td>Abcam</td><td>ab178847</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Złączka zaciskowa RN 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley ciężarna szczur</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klapki SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Zestaw do barwienia jądra</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja komórek zakażonych ekohiv u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

Skojarzona terapia antyretrowirusowa (cART) znacznie poprawiła jakość życia osób żyjących z HIV (PLWH). Jednak ponad 4 miliony PLWH jest w wieku powyżej pięćdziesięciu lat i doświadcza towarzyszących zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV (HAND). Aby zrozumieć, w jaki sposób HIV wpływa na ośrodkowy układ nerwowy, niezbędny jest wiarygodny i wykonalny model HIV. Wcześniej opracowano nowy system biologiczny wykorzystujący chimeryczną inokulację wirusa HIV (EcoHIV) w modelu szczurzym w celu zbadania zaburzeń neuropoznawczych i dysfunkcji synaptycznych. Niemniej jednak nadal pozostaje poważnym wyzwaniem wyjaśnienie neuroanatomicznego rozmieszczenia wirusa EcoHIV, a w szczególności jego zróżnicowanej ekspresji w różnych typach komórek mózgu. W obecnym badaniu EcoHIV z znakowaniem fluorescencyjnym mScarlet został zmodyfikowany i wstrzyknięty po orbicie myszom knock-in Tmem119-EGFP (które wyrażają wzmocnione białko zielonej fluorescencji głównie w mikrogleju) w celu ustalenia, czy mikroglej jest głównym typem komórek odpowiedzialnych za ekspresję wirusa i rezerwuarami HIV w mózgu. Obecne dane pokazują, że: (1) in vitro sygnały fluorescencyjne EcoHIV-mScarlet były głównie zlokalizowane w komórkach podobnych do mikrogleju wśród pierwotnych komórek mózgowych gryzoni; (2) in vivo, wstrzyknięcie EcoHIV-mScarlet do myszy Tmem119-EGFP wywołało znaczną ekspresję HIV w mózgu myszy. Kolokalizacja sygnałów mScarlet i EGFP sugeruje, że mikroglej jest głównym typem komórek przenoszących wirusa HIV w mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, EcoHIV u gryzoni stanowi cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju, rezerwuarów wirusa w mózgu oraz neurologicznych mechanizmów zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV.

Fragment mScarlet (1858 bp) zawierający miejsca rozpoznawane przez enzymy „Cla1” na końcu 3' oraz „Not1” na końcu 5' został wstawiony do wektora lentiwirusowego pNL4-3-EcoHIV (Rycina 1). Aby zweryfikować ekspresję EcoHIV-mScarlet, pierwotne komórki mózgu wyizolowane z kory zarodków szczura E18 poddano działaniu EcoHIV-mScarlet (60 µL, 1,26 × 106 TU/mL) przez 6 dni in vitro. Dane przedstawione na Rycynie 2 wykazały, że sygnały fluorescencji czerwonej mScarlet lokalizowały się głównie w komórkach typu glejowego, na co wskazywała odmienna morfologia komórek. Ponadto znakowanie CD11b/c i Iba1 (markerami komórkowymi mikrogleju) wykazało, że sygnały mScarlet współwystępowały z komórkami CD11b/c + i/lub Iba1 +. Dane te wskazują, że mikroglej był głównym typem komórek, w których dystrybuował się EcoHIV-mScarlet in vitro. W hodowanych komórkach nie stwierdzono istotnej infekcji neuronów (Rycina uzupełniająca 1). 
Następnie przetestowano infekcję EcoHIV-mScarlet na pierwotnych mieszanych komórkach glejowych dorosłych myszy. W tym celu najpierw wyizolowano i oczyszczono mieszane komórki glejowe z dorosłych myszy (2 miesiące), a następnie zainfekowano je EcoHIV-mScarlet (8 µL, 1,26 × 106 TU/mL) przez 2 dni. Obrazy na Rysunku 3 wykazały, że EcoHIV-mScarlet skutecznie zainfekował glej dorosłej myszy.
Aby dokładniej zbadać wzorzec dystrybucji EcoHIV-mScarlet w mózgu myszy, a w szczególności w celu zidentyfikowania typu zainfekowanych komórek, EcoHIV-mScarlet wstrzyknięto drogą okołogałkową do linii myszy knock-in Tmem119-EGFP, w której mikroglej był specyficznie znakowany sygnałami EGFP bez kolizji z innymi typami makrofagów5. Wyniki przedstawione na Rysunku 4 (również na Rysunku uzupełniającym 2) pokazują, że sygnały czerwonej fluorescencji mScarlet obserwowano w komórkach EGFP-dodatnich, co sugeruje, że mikroglej jest głównym typem komórek wykazujących ekspresję EcoHIV w mózgach myszy.
<img alt="Schemat mapy plazmidu EcoHIV-NL4-3-mscarlet, układ genów i miejsca restrykcyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Mapa wektora EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej, markery CD11b/c, mScarlet, Iba1 do analizy komórkowej, skala 50µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zakażenie EcoHIV-mScarlet w pierwotnych komórkach mózgu szczura. (A,E) Reprezentatywne obrazy barwienia CD11b/c w pierwotnych komórkach mózgu. Komórki mózgu wyizolowano z embrionów szczura w stadium E18 i zainfekowano wirusem EcoHIV-mScarlet przez 6 dni. (B,F) Reprezentatywne obrazy sygnałów fluorescencyjnych mScarlet w komórkach mózgu in vitro. (C,G) Reprezentatywne obrazy barwienia Iba1 w pierwotnych komórkach mózgu. (D,H) Nałożone obrazy potrójnego znakowania CD11b/c, mScarlet i Iba1. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej EcoHIV-mScarlet pokazujący lokalizację wirusa w komórkach, pasek skali 10 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zakażenie EcoHIV-mScarlet w pierwotnych mieszanych komórkach glejowych myszy. (A,B) Reprezentatywne obrazy konfokalne rozkładu mScarlet in vitro. Pierwotne mieszane komórki glejowe wyizolowano z dorosłych myszy C57BL6 (2-miesięcznych) i hodowano przez 2 tygodnie przed zakażeniem wirusem. EcoHIV-mScarlet dodano do pożywki hodowlanej na dwie doby, a obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 60× mikroskopu konfokalnego. Pasek skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna wykazująca znakowanie mScarlet/EGFP, analiza przekroju mózgu, skala 300 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Rozkład EcoHIV-mScarlet w linii myszy knock-in Tmem119-EGFP.(A,B) Nałożone obrazy sygnałów mScarlet/EGFP/ToPro3 w przekrojach mózgu. Żółta ramka wskazuje obszar docelowy na obrazie (B). Pasek skali: 300 µm. (C) Reprezentatywny obraz rozkładu mScarlet w warstwie splotowatej zewnętrznej regionu węchowego w linii myszy knock-in Tmem119-EGFP. (D) Reprezentatywny obraz rozkładu EGFP. Sygnały fluorescencyjne zlokalizowano w komórkach mikrogleju w linii myszy knock-in Tmem119-EGFP. (E) Reprezentatywny obraz barwienia jąder TO-PRO-3. Paski skali: 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Barwienie MAP2 i MOG pierwotnych komórek mózgu szczura zainfekowanych wirusem EcoHIV-mScarlet. Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Obrazy konfokalne infekcji EcoHIV-mScarlet w linii myszy z knock-in Tmem119-EGFP. Paski skali: 75 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Sekwencja DNA plazmidu EcoHIV-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół opisuje, w jaki sposób połączenie infekcji EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP oferuje cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.

Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączenie zakażenia EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP stanowi cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV. Skojarzona terapia przeciwretrowirusowa znacznie poprawiła jakość życia osób żyjących z wirusem HIV. Aby zrozumieć, w jaki sposób HIV wpływa na ośrodkowy układ nerwowy, niezbędny jest wiarygodny i wykonalny model HIV.Wcześniej na modelu szczurzym opracowano nowy system biologiczny wykorzystujący chimeryczny wirus HIV, EcoHIV w koacji, w celu zbadania zaburzeń neuropoznawczych i dysfunkcji synaptycznych. Istotnym wyzwaniem pozostaje wyjaśnienie neuroanatomicznego rozmieszczenia EcoHIV, a w szczególności jego zróżnicowanej ekspresji w różnych typach komórek mózgu. W obecnym badaniu EcoHIV ze znakowaniem fluorescencyjnym mScarlet został zmodyfikowany i wstrzyknięty po orczole myszom knock-in Tmem119-EGFP w celu ustalenia, czy mikroglej jest głównym typem komórek odpowiedzialnych za ekspresję wirusa i rezerwuarem HIV w mózgu.Na początek przenieś zdysocjowane komórki mózgowe płodu szczura na wstępnie pokrytą poli-L-lizyną 12-dołkową płytkę ze szklanymi wkładkami zawierającymi jeden mililitr DMEM-F12 plus 10% FBS. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką Neurobasel uzupełnioną witaminą B27 i kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy tygodnie.Następnie dodaj 60 mikrolitrów EcoHIV-mScarlet do hodowli komórek mózgowych i inkubuj przez sześć dni. Po inkubacji utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu. Wykonaj barwienie immunologiczne na zakażonych komórkach mózgowych przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwotnych i zobrazuj je pod mikroskopem konfokalnym pod obiektywem 40x.Mikroglej został zidentyfikowany jako główny zakażony typ komórek w hodowlach komórek mózgowych szczurów, o czym świadczy kolokalizacja mScarlet z markerami CD11b/c i Iba1. Na początek otwórz skórę głowy dorosłej myszy pozbawionej głowy i przenieś tkankę mózgową na inną szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów wysterylizowanego HBSS. Oderwij opony mózgowe i przenieś korę czołową do dwóch mililitrów HBSS.Następnie dodaj do mieszaniny 20 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, obracając probówkę co kilka minut. Przenieś zdysocjowane komórki do wstępnie pokrytej poli-L-lizyną kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierającej 10 mililitrów pożywki DMEM-F12 i 10% FBS.Hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż osiągną 90% konfluencji. Następnie strawij komórki mózgowe dwoma mililitrami 0,25% trypsyny-EDTA. Subkulturuj strawione komórki mózgowe w 35-milimetrowym szklanym naczyniu zawierającym pięć mililitrów pożywki wzrostowej DMEM-F12, aż osiągną 80% konfluencji.Następnie dodaj osiem mikrolitrów EcoHIV-mScarlet do komórek glejowych myszy i inkubuj przez dwa dni. Dorosłe pierwotne komórki glejowe myszy zostały pomyślnie zakażone EcoHIV-mScarlet po dwóch dniach leczenia. Aby rozpocząć, zabezpiecz znieczuloną mysz Tmem119-EGFP w pozycji bocznej.Rozmrozić EcoHIV-mScarlet na lodzie. Wlać roztwór wirusa do strzykawki do wstrzykiwania wewnątrzgałkowego za pomocą igły o rozmiarze 33. Umieść mysz w prawej pozycji bocznej z głową skierowaną w lewo.Zidentyfikuj obszar wstrzyknięcia wokół oka. Powoli i delikatnie wprowadzić igłę do przyśrodkowej kości oka. Następnie wsuń igłę do naczyń za gałką oczną.Wstrzyknąć 6,5 mikrolitra EcoHIV-mScarlet do zatoki zaoczodołowej. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie wyjąć igłę. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach w okapie oparów chemicznych.Otwórz skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Następnie oddziel przeponę i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Teraz włóż półtoragórską igłę o rozmiarze 22 do lewej komory.Otwórz prawe przedsionek nożyczkami. Wykonaj perfuzję prawego przedsionka za pomocą 50 mililitrów wstępnie schłodzonego 100-milimolowego PBS, a następnie przepełnij 100 mililitrami wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu. Usuń cały mózg myszy.Po utrwaleniu mózgu w 4% paraformaldehydzie, zabezpiecz tkankę mózgową za pomocą kleju tkankowego na metalowej platformie Vibratome. Wytnij sekcje koronalne o grubości 50 mikrometrów za pomocą ostrzy ze stali węglowej. Następnie umieść plastry mózgu na szklanych szkiełkach za pomocą pędzla.Natychmiast dodaj 0,1 mililitra środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do każdej sekcji. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 50 milimetrów na sekcjach mózgu i susz szkiełka Superfrost w ciemności przez jeden dzień. Następnego dnia użyj mikroskopu konfokalnego o długości fali 488 nanometrów i 594 nanometrów, aby uzyskać wielokanałowe obrazy interesującego obszaru mózgu.Sygnały EcoHIV-mScarlet obserwowano przede wszystkim w komórkach mikrogleju znakowanych EGFP w mózgu myszy Tmem119-EGFP. Nie wykryto istotnego zakażenia neuronów w hodowanych komórkach mózgowych szczurów leczonych EcoHIV-mScarlet.

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj metodę identyfikacji komórek zakażonych EcoHIV w mózgu myszy transgenicznych Tmem119-EGFP przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta pozwala badać rolę mikrogleju jako rezerwuaru wirusa HIV w układzie nerwowym.

Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

Przeglądaj więcej filmów