Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem
20 grudnia 2024
Ten protokół opisuje, w jaki sposób połączenie infekcji EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP oferuje cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.
Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączenie zakażenia EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP stanowi cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV. Skojarzona terapia przeciwretrowirusowa znacznie poprawiła jakość życia osób żyjących z wirusem HIV. Aby zrozumieć, w jaki sposób HIV wpływa na ośrodkowy układ nerwowy, niezbędny jest wiarygodny i wykonalny model HIV.
Wcześniej na modelu szczurzym opracowano nowy system biologiczny wykorzystujący chimeryczny wirus HIV, EcoHIV w koacji, w celu zbadania zaburzeń neuropoznawczych i dysfunkcji synaptycznych. Istotnym wyzwaniem pozostaje wyjaśnienie neuroanatomicznego rozmieszczenia EcoHIV, a w szczególności jego zróżnicowanej ekspresji w różnych typach komórek mózgu. W obecnym badaniu EcoHIV ze znakowaniem fluorescencyjnym mScarlet został zmodyfikowany i wstrzyknięty po orczole myszom knock-in Tmem119-EGFP w celu ustalenia, czy mikroglej jest głównym typem komórek odpowiedzialnych za ekspresję wirusa i rezerwuarem HIV w mózgu.
Na początek przenieś zdysocjowane komórki mózgowe płodu szczura na wstępnie pokrytą poli-L-lizyną 12-dołkową płytkę ze szklanymi wkładkami zawierającymi jeden mililitr DMEM-F12 plus 10% FBS. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę pożywką Neurobasel uzupełnioną witaminą B27 i kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy tygodnie.
Następnie dodaj 60 mikrolitrów EcoHIV-mScarlet do hodowli komórek mózgowych i inkubuj przez sześć dni. Po inkubacji utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu. Wykonaj barwienie immunologiczne na zakażonych komórkach mózgowych przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwotnych i zobrazuj je pod mikroskopem konfokalnym pod obiektywem 40x.
Mikroglej został zidentyfikowany jako główny zakażony typ komórek w hodowlach komórek mózgowych szczurów, o czym świadczy kolokalizacja mScarlet z markerami CD11b/c i Iba1. Na początek otwórz skórę głowy dorosłej myszy pozbawionej głowy i przenieś tkankę mózgową na inną szalkę Petriego zawierającą pięć mililitrów wysterylizowanego HBSS. Oderwij opony mózgowe i przenieś korę czołową do dwóch mililitrów HBSS.
Następnie dodaj do mieszaniny 20 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, obracając probówkę co kilka minut. Przenieś zdysocjowane komórki do wstępnie pokrytej poli-L-lizyną kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierającej 10 mililitrów pożywki DMEM-F12 i 10% FBS.
Hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż osiągną 90% konfluencji. Następnie strawij komórki mózgowe dwoma mililitrami 0,25% trypsyny-EDTA. Subkulturuj strawione komórki mózgowe w 35-milimetrowym szklanym naczyniu zawierającym pięć mililitrów pożywki wzrostowej DMEM-F12, aż osiągną 80% konfluencji.
Następnie dodaj osiem mikrolitrów EcoHIV-mScarlet do komórek glejowych myszy i inkubuj przez dwa dni. Dorosłe pierwotne komórki glejowe myszy zostały pomyślnie zakażone EcoHIV-mScarlet po dwóch dniach leczenia. Aby rozpocząć, zabezpiecz znieczuloną mysz Tmem119-EGFP w pozycji bocznej.
Rozmrozić EcoHIV-mScarlet na lodzie. Wlać roztwór wirusa do strzykawki do wstrzykiwania wewnątrzgałkowego za pomocą igły o rozmiarze 33. Umieść mysz w prawej pozycji bocznej z głową skierowaną w lewo.
Zidentyfikuj obszar wstrzyknięcia wokół oka. Powoli i delikatnie wprowadzić igłę do przyśrodkowej kości oka. Następnie wsuń igłę do naczyń za gałką oczną.
Wstrzyknąć 6,5 mikrolitra EcoHIV-mScarlet do zatoki zaoczodołowej. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie wyjąć igłę. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach w okapie oparów chemicznych.
Otwórz skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Następnie oddziel przeponę i otwórz klatkę piersiową nożyczkami. Teraz włóż półtoragórską igłę o rozmiarze 22 do lewej komory.
Otwórz prawe przedsionek nożyczkami. Wykonaj perfuzję prawego przedsionka za pomocą 50 mililitrów wstępnie schłodzonego 100-milimolowego PBS, a następnie przepełnij 100 mililitrami wstępnie schłodzonego 4% paraformaldehydu. Usuń cały mózg myszy.
Po utrwaleniu mózgu w 4% paraformaldehydzie, zabezpiecz tkankę mózgową za pomocą kleju tkankowego na metalowej platformie Vibratome. Wytnij sekcje koronalne o grubości 50 mikrometrów za pomocą ostrzy ze stali węglowej. Następnie umieść plastry mózgu na szklanych szkiełkach za pomocą pędzla.
Natychmiast dodaj 0,1 mililitra środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do każdej sekcji. Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 50 milimetrów na sekcjach mózgu i susz szkiełka Superfrost w ciemności przez jeden dzień. Następnego dnia użyj mikroskopu konfokalnego o długości fali 488 nanometrów i 594 nanometrów, aby uzyskać wielokanałowe obrazy interesującego obszaru mózgu.
Sygnały EcoHIV-mScarlet obserwowano przede wszystkim w komórkach mikrogleju znakowanych EGFP w mózgu myszy Tmem119-EGFP. Nie wykryto istotnego zakażenia neuronów w hodowanych komórkach mózgowych szczurów leczonych EcoHIV-mScarlet.
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano myszy Tmem119-EGFP zainfekowane wirusem EcoHIV w celu zbadania zmian w mikrogleju oraz obecności rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni dla zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV. Dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik obrazowania badanie to wyjaśnia rozkład EcoHIV w obrębie ośrodkowego układu nerwowego oraz jego interakcję z komórkami mikrogleju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby zakaźne
- Zaburzenia poznawcze
Wstęp
- Wpływ HIV na ośrodkowy układ nerwowy nie jest w pełni poznany.
- Istniejące modele służące do badania zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV są ograniczone.
- Chimeryczny wirus EcoHIV służy jako nowe narzędzie biologiczne do tych badań.
- Uważa się, że komórki mikrogleju odgrywają kluczową rolę w neuroanatomicznym rozprzestrzenianiu się wirusa.
Cel badania
- Ocena roli mikrogleju w infekcji EcoHIV w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
- Ocena potencjału EcoHIV jako modelu do zrozumienia zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.
- Identyfikacja konkretnych typów komórek odpowiedzialnych za ekspresję wirusa w mózgu.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek i immunobarwienie zostały przeprowadzone na pobranych komórkach mózgu z modeli Tmem119-EGFP oraz szczurzych.
- Do komórek glejowych wprowadzono EcoHIV-mScarlet w celu monitorowania infekcji.
- Do obrazowania wykorzystano mikroskopię konfokalną, koncentrując się szczególnie na odpowiedzi mikrogleju na infekcję.
- Zastosowano specyficzne protokoły dysocjacji tkanki mózgowej i hodowli komórek.
- Precyzyjnie określono czas oraz warunki inkubacji i fiksacji.
Główne wyniki
- EcoHIV-mScarlet infekował w modelu głównie komórki mikrogleju, a nie neurony.
- Zaobserwowano znaczną kolokalizację mScarlet z markerami mikrogleju.
- Wyniki sugerują, że mikroglej służy jako kluczowy rezerwuar HIV w mózgu.
- Badanie podkreśla znaczenie zrozumienia interakcji między wirusami a komórkami glejowymi.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje użyteczność modelu EcoHIV w badaniu wpływu HIV na mózg.
- Uzyskane informacje mogą pomóc w opracowaniu strategii leczenia zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.
- Zrozumienie roli mikrogleju w infekcji HIV poszerza wiedzę na temat patogenezy wirusowej w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wyjaśnienie kwestii komórkowych rezerwuarów HIV w mózgu ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka w modelach zaburzeń neuropoznawczych oraz rozwoju badań translacyjnych nad patologią OUN powiązaną z HIV. System myszy Tmem119-EGFP zakażonych szczepem EcoHIV umożliwia precyzyjną identyfikację infekcji mikrogleju, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów i badaniach mechanistycznych. Model ten usprawnia proces przechodzenia od odkryć do etapu przedklinicznego w badaniach nad neuro-HIV oraz pozwala na lepszą priorytetyzację interwencji ukierunkowanych na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie roli mikrogleju jako funkcjonalnego rezerwuaru HIV w OUN.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez rozróżnienie ekspresji wirusa specyficznej dla typu komórek.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie hipotez mechanistycznych dotyczących patogenezy HAND.
- Zapewnia solidny system selekcji celów w OUN w ramach portfolio badań nad neuroHIV.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele gryzoni do późniejszego przesiewania związków ukierunkowanych na rezerwuary mikrogleju.
- Umożliwia powtarzalną ilościową ocenę infekcji w zdefiniowanych populacjach komórek na podstawie obrazowania.
- Wspiera standaryzację testów do oceny czynników anty-HIV lub neuroprotekcyjnych w kontekście OUN.
- Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy do badań porównawczych różnych szczepów wirusów lub interwencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z systemami istotnymi dla chorób w modelowaniu HAND oraz wirusowej persystencji w OUN.
- Umożliwia przejście od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji strategii terapeutycznych.
- Wspiera decyzje o postępach w rozwoju terapii HIV przenikających do OUN, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Zapewnia dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez obrazowanie zainfekowanej mikroglei in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten łączy wczesny etap odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając prowadzenie studiów opartych na hipotezach dotyczących neurobiologii HIV oraz walidację celów w systemie istotnym z punktu widzenia choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych dotyczących infekcji mikrogleju i statusu rezerwuaru w OUN.
- Przesiew: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników obrazowania obciążenia infekcją w mikrogleju.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wskaźników infekcji pomiędzy różnymi typami komórek i warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia mechanistyczne z modelami przedklinicznymi HAND i przetrwalności wirusa w OUN.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny interwencji celujących w rezerwuary HIV w OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów w OUN oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ilościowe oznaczanie infekcji oraz przepływy pracy w obrazowaniu w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go w przypadku terapii HIV celowanych w OUN oraz strategii neuroprotekcyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów odkrywczych i przedklinicznych ukierunkowanych na HAND, z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu neurobiologii gryzoni, pracy z wektorami wirusowymi oraz zaawansowanego obrazowania.
- Wymagany jest dostęp do mikroskopii konfokalnej oraz infrastruktury analitycznej opartej na fluorescencji.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów infekcji, obrazowania i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych modeli chorób OUN może wymagać walidacji specyficzności typów komórkowych.
- Interpretacja jest ograniczona do rezerwuarów mikroglialnych, zgodnie z aktualnymi danymi z obrazowania i markerami.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:40
EcoHIV-mScarlet Infection in Primary Rat Brain Cells for Microglial Localization
2:59
EcoHIV-mScarlet Infection in Adult Mice Primary Glial Cells and Fluorescence Imaging
4:38
EcoHIV-mScarlet Retroorbital Injection and Brain Tissue Visualization in Tmem119-EGFP Mice
