Name: Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj izolację chondrocytów i chondroprogenitorów z ludzkiej chrząstki stawowej przy użyciu trawienia enzymatycznego oraz testów adhezji do fibronektyny i migracyjnych. Ta metoda wspiera badania nad inżynierią tkanek chrzęstnych i regeneracyjną medycyną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Pani Bhavini Krishnan i Pani Merin Mary Zachariah za ich wkład intelektualny oraz Centrum Badań nad Komórkami Macierzystymi (jednostka inStem Bengaluru), Wydziałowi Fizjologii, Chrześcijańskiemu Kolegium Medycznemu, Vellore, za wsparcie infrastrukturalne. Trwające projekty są wspierane przez Departament Biotechnologii (BT/PR32777/MED/31/415/2019), Rząd Indii, Radę Badań Naukowych i Inżynieryjnych (CRG/2022/004277), Rząd Indii oraz Granty na Badania Płynów, Christian Medical College, Vellore.

Protokół został zatwierdzony i jest zgodny z odpowiednimi przepisami i wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (Komitetu ds. Badań i Etyki). Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody, ludzkie stawy piszczelowo-udowe są pobierane od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) (wynik radiologiczny Kellgrena-Lawrence'a 4)30, którzy wymagają całkowitej wymiany stawu kolanowego w ramach leczenia. Stawy pacjentów z jakimikolwiek objawami nowotworów, infekcji lub zapalnego zapalenia stawów (takich jak reumatoidalne zapalenie stawów lub dna moczanowa) zostały wykluczone z badania. Zapewnia się, że wszystkie procedury są przeprowadzane w sterylnych warunkach, zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi przez cały proces eksperymentalny.
1. Uzyskanie stawów piszczelowo-udowych
<ol>
	<li>Pozyskanie stawów kolanowych (stawów piszczelowo-udowych) od dawców ludzkich wymagających amputacji powyżej kolana w ramach leczenia lub od osób z chorobą zwyrodnieniową stawów IV stopnia30 (dowody radiologiczne wskazujące na znaczne zmniejszenie przestrzeni stawowej w przypadku stwardnienia chrzęstnego) poddanych całkowitej wymianie stawu kolanowego. 
	UWAGA: Upewnij się, że uzyskano świadomą zgodę od pacjentów zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Zapewnienie przestrzegania zasad Komisji Etyki i Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.</li>
	<li>Wyklucz wszelkie stawy wykazujące objawy infekcji lub stanu zapalnego.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie zebranych jointów
<ol>
	<li>Pobrane stawy piszczelowo-udowe umieścić w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotuj sterylny obszar pod maską, umieszczając sterylny podkład. Zebrane jointy przenieść na podkładkę.</li>
	<li>Ustabilizuj przecięte stawy piszczelowo-udowe, trzymając kość podchrzęstną z chrząstką skierowaną w górę.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela (nr 22) w ciągu 1-2 godzin od uzyskania stawu należy pobrać prostokątne wióry chrząstki z obszarów nieobciążających dla pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.</li>
	<li>Pobrać odcinki chrząstki o wymiarach 8 mm x 10 mm od warstwy powierzchownej do warstwy głębszej.</li>
	<li>Umyj plastry chrząstki 1x roztworem PBS i umieść je na szalce Petriego zawierającej 1-2 ml zwykłego podłoża DMEM.</li>
	<li>Zmiel ładnie plastry chrząstki do rozmiaru mniejszego niż 1 mm x 1 mm x 1 mm za pomocą ostrza skalpela (nr 22). 
	UWAGA: Upewnij się, że plastry chrząstki lub mielona chrząstka nie wysychają; umieścić je w pożywce hodowlanej lub PBS pozbawionym surowicy.</li>
</ol>
3. Izolacja chondrocytów
<ol>
	<li>Umieść zmieloną chrząstkę w pionowej kolbie T-25 zawierającej 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle F12 (DMEM-F12) firmy Dulbecco z 0,15% kolagenazą typu II do trawienia enzymatycznego. Pozostawić kolbę w spokoju przez 12-14 godzin w inkubatorze CO2 , zapewniając standardowe warunki hodowli31. 
	UWAGA: Należy użyć zwykłej pożywki DMEM-F12 bez śladów surowicy, ponieważ surowica dezaktywuje działanie enzymatyczne.</li>
	<li>Po nocnym trawieniu przenieś pożywkę zawierającą uwolnione komórki do świeżej, sterylnej probówki wirówkowej zawierającej równą objętość DMEM-F12 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), używając sitka komórkowego do oddzielenia komórek od resztek. Uwolnione komórki to "chondrocyty".</li>
	<li>Odwirować przefiltrowane komórki z prędkością 1200 x g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Otrzymany osad należy rozpuścić w 1 ml pożywki i policzyć uwolnione żywe komórki za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy.</li>
	<li>Załaduj chondrocyty do kolby T-25 o stężeniu 10 000 komórek/cm² i rozwiń do wymaganej liczby pasaży za pomocą DMEM-F12 zawierającego 10% FBS. Dodatkowe składniki w pożywce to kwas askorbinowy (62 μg/ml), L-glutamina (2,5 mM/l), penicylina-streptomycyna (100 j.m./ml) i amfoterycyna-B (2 μg/ml).</li>
	<li>Odświeżaj pożywkę co 3 dni i zbieraj komórki podczas konfluencji za pomocą 0,125% trypsyny zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).</li>
</ol>
4. Izolacja chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs)
<ol>
	<li>12 godzin przed uwolnieniem chondrocytów przygotuj 10 ml 1x PBS zawierającego 1 mM MgCl2 (10 μL) i 1 mM CaCl2 (10 μL) oraz 100 μL Fibronektyny (10 μL/mL)32.</li>
	<li>Pokryj wymaganą liczbę dołków płytki 6-dołkowej (1,5 ml/9,3cm2) za pomocą przygotowanego roztworu.</li>
	<li>Szczelnie zamknij płytkę i wstaw do lodówki na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodatkowo należy uzyskać wióry chrzęstne w sposób podobny do opisanego w przypadku izolacji chondrocytów (kroki 2.1-2.5).</li>
	<li>Poddaj wióry chrząstki sekwencyjnemu trawieniu enzymatycznemu przez noc (0,2% pronazy przez 3 godziny; a następnie 0,04% kolagenazy typu II przez 12 godzin) w wytrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C w celu uzyskania pojedynczych chondrocytów.</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij z lodówki 6-dołkową płytkę pokrytą fibronektyną i usuń nadmiar Fibronectin. 
	UWAGA: Nadmiar fibronektyny należy usuwać powoli i delikatnie, nie naruszając powłoki na dnie studzienki. Obecność MgCl2 (10 μL) i 1 mM CaCl2 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia przyczepienia komórek.</li>
	<li>Dodaj 2-3 ml zwykłego podłoża DMEM-F12 do powlekanych studzienek.</li>
	<li>Uwolnione chondrocyty należy wysiać w powlekanych studzienkach o gęstości obciążenia 4000 komórek/studzienkę i pozostawić płytkę w spokoju na okres 20 minut.</li>
	<li>Po inkubacji usuń nadmiar pożywki i nieprzylegających komórek. Dodaj 2-3 ml standardowej pożywki wzrostowej używanej do chondrocytów (DMEM-F12 + 10% FBS).</li>
	<li>Utrzymuj przylegające komórki w standardowych warunkach hodowli przez 10-12 dni, aby uzyskać klony CPC (kolonie >32 komórek).</li>
	<li>Izolować za pomocą 0,125% trypsyny-EDTA przez 180 s, ponownie platerować klony w stosunku 1 klon/5 cm² i rozszerzać wzbogacone poliklonalne CP do wymaganej konfluencji. Uzyskane komórki są określane jako "FAA-CPC".</li>
	<li>Hodowla komórek dalej w pożywce DMEM-F12 + 10% FBS + transformujący czynnik wzrostu beta 2 (TGFβ2: 1 ng / ml) + czynnik wzrostu fibroblastów (FGF2: 5 ng / ml). 
	UWAGA: Inkubacja komórek na płytkach pokrytych fibronektyną nie powinna przekraczać 20 minut, ponieważ chondrocyty mogą również zacząć przylegać. Podczas 20-minutowego okresu adhezji podłoże musi być pozbawione surowicy. Następnie komórki, które przylegają do klonów, należy wyhodować w pożywce zawierającej dodatkowo FBS. Klony muszą być odizolowane tylko po upewnieniu się, że każdy klon ma więcej niż 32 komórki; Ma to na celu uniknięcie wzmacniaczy tranzytowych. Dalsza ekspansja klonów po trypsynizacji powinna obejmować dodatkowe wymienione czynniki wzrostu. Gęstość obciążenia 4000 chondrocytów/9,3cm2 płytki pokrytej fibronektyną, po 20-minutowej inkubacji, po której następuje płukanie, powoduje adhezję łącznie 80-100 komórek. Spośród nich około 20 klonów będzie rosło i osiągnie podwojenie populacji o 5 w ciągu 10-12 dni.</li>
</ol>
5. Izolacja migrujących chondroprogenitorów
<ol>
	<li>Ogolić eksplantaty chrząstki (10 mm x 5 mm x 1 mm ) z pobranego stawu stawowego i umieścić je na sterylnej 6-dołkowej płytce zawierającej pożywkę DMEM-F12 z 10% FBS i 10 mM Glutamax (2-3 eksplantaty/studzienkę)33.</li>
	<li>Pozostawić płytkę z eksplantatami w spokoju przez 48 godzin w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 2 dniach przenieś eksplantaty do probówki wirówkowej zawierającej 10 ml 0,1% roztworu kolagenazy w celu trawienia enzymatycznego. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 2 h. 
	UWAGA: Eksplantaty należy przepłukać 1x PBS przed trawieniem enzymatycznym, ponieważ śladowe ilości surowicy mogą dezaktywować działanie enzymu. Do mycia zanurz eksplantaty na szalce Petriego wypełnionej 2-3 ml 1x PBS; Ma to również na celu zapewnienie braku zanieczyszczenia uwolnionymi chondrocytami. Obchodzenie się z eksplantatami musi być ograniczone do minimum, a to ma na celu uniknięcie stresu u przodków, którzy rozpoczęli migrację.</li>
	<li>Po strawieniu przepłucz eksplantaty 1x PBS i umieść je z powrotem w tych samych dołkach płytki zawierającej świeże pożywki DMEM-F12 z 10% FBS i 10 mM pożywki Glutamax.</li>
	<li>Utrzymywać płytkę w standardowych warunkach hodowli w inkubatorze. Obserwuj migrację chondroprogenitorów w kolejnych dniach.</li>
	<li>Po osiągnięciu sub konfluencji zbierz MCP, używając 0,125% trypsyny zawierającej EDTA.</li>
	<li>Rozbuduj MCP za pomocą standardowego podłoża rozszerzalnego, które zawiera DMEM-F12, który zawiera 10% FBS i 10 mM Glutamaxu.</li>
</ol>
6. Charakterystyka fenotypowa chondrocytów, FAA-CP i MCP
<ol>
	<li>Analiza cytometryczna przepływowa (FACS) 
	UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w przypadku analizy FACS zebranych grup komórek.
	<ol>
		<li>Trypsynizować komórki zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu 0,125% trypsyny i odwirować przy 1200 x g, 5 min, temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant, umyj i ponownie zawieś osad za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do oznaczonych probówek dla FACS.</li>
		<li>Podzielić zawiesinę równo na dwie probówki: "niebarwioną" probówkę, która działa jako kontrola (zawiesina komórek bez przeciwciała) i "barwione" probówki, które działają jako testy (zawiesina komórek z przeciwciałem).</li>
		<li>Postępuj zgodnie z kartą danych technicznych poszczególnych przeciwciał/markerów klastra różnicowania (CD) do barwienia. Przeciwciała do porównania obejmują CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (dodatnie markery ekspresji); CD34-PE, CD45-FITC i CD14-FITC (markery wyrażeń ujemnych)34,35; CD166-BB515 i CD146-PE (potencjalne markery chondrogenne)36,37. 
		UWAGA: Markery CD są wrażliwe na światło. Aby upewnić się, że kroki są wykonywane w ciemności.</li>
		<li>Inkubować zawiesinę komórkową z przeciwciałem przez 30 minut w ciemności.</li>
		<li>Po barwieniu dodać 1 ml 1x PBS do probówek i odwirować w temperaturze 1200 x g, 5 min, w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
		<li>Odrzucić trzy czwarte supernatantu. Zawiesić osad w pozostałej zawartości sklarowanego osadu przez delikatne rozcieranie.</li>
		<li>Przejdź do analizy FACS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. qRT-PCR
UWAGA: analiza ekspresji genów qRT-PCR obejmuje ocenę kolagenu typu I (COL1A1), kolagenu typu X (COL10A1) i czynnika transkrypcyjnego związanego z Runt (RUNX2) dla ekspresji przerostowej oraz SOX-9, Aggrekanu (ACAN) i kolagenu typu II (COL2A1) dla chondrogenezy.
<ol>
	<li>Wyodrębnij RNA z grup komórkowych za pomocą dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po ekstrakcji oceń stosunek A260/A280 i stężenie RNA.</li>
	<li>Wykorzystaj 280 ng wyekstrahowanego RNA do budowy komplementarnego DNA (cDNA).</li>
	<li>Rozpocznij qRT-PCR za pomocą Sybr Green, każda reakcja zawiera końcowe stężenie 7 ng cDNA na termocyklerze.</li>
	<li>Znormalizuj względną ekspresję mRNA każdego genu do referencyjnego genu porządkowego GAPDH (ΔCt).</li>
	<li>Oblicz względną ekspresję każdego genu za pomocą techniki 2-ΔΔCt, porównując wartość ΔCt każdego pojedynczego genu z wartością FAA-CP (ΔΔCt)37.</li>
</ol>
8. Różnicowanie wieloliniowe
UWAGA: Komercyjnie dostępne podłoża różnicujące indukują różnicowanie trójliniowe na linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne.
<ol>
	<li>W celu różnicowania adipogennego, komórki nasienne o gęstości obciążenia 1000 komórek/cm2 na płytce do hodowli komórkowej i hodowli przy użyciu pożywki do różnicowania adipogennego (zmiana pożywki - raz na 3 dni) do subkonfluencji 80% przez 3 tygodnie.</li>
	<li>W celu różnicowania osteogennego i chondrogennego postępuj zgodnie z 28-dniowym systemem hodowli granulek38.</li>
	<li>Odwirować 0,5 x 106 komórek przy 400 x g przez 12 minut w temperaturze 37 °C w celu utworzenia osadów i zainicjowania różnicowania za pomocą pożywki do różnicowania osteogennego i chondrogennego.</li>
	<li>Zamocuj, osadź i pokrój granulki w celu potwierdzenia barwienia (krok 9).</li>
</ol>
9. Barwienie potwierdzające
<ol>
	<li>W przypadku komórek linii adipogennej utrwal komórki buforowaną formaliną, przemyj i wybarwij czerwienią olejową O (0,5%). Wybarwić również kontrole (hodowane na standardowym podłożu DMEM z 10% FBS).</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem i uzyskaj obrazy.</li>
	<li>W przypadku zróżnicowanych komórek linii osteogennej zabarwić czerwienią alizarynową (2%). 
	UWAGA: Dla chondrogennych komórek zróżnicowanych stosuje się wiele protokołów barwienia potwierdzającego.</li>
	<li>Barwienie Alcian Blue: Zabarwić utrwalone komórki błękitem Alcian przez 5 minut i przeciwbarwić neutralną czerwienią.</li>
	<li>W celu oceny zawartości glikozaminoglikanu (GAG) należy wykonać barwienie Safraniną O: Wybarwić szkiełka żelazną hematoksyliną Wiegerta, a następnie inkubować z kwaśnym alkoholem (1%), szybkim zielonym roztworem (0,05%), kwasem octowym (1%) i roztworem Safraniny O (1%).</li>
	<li>Barwienie błękitem toluidyny: Barwić szkiełka błękitem toluidynowym (0,1%) przez 5 minut.</li>
	<li>Barwienie PicroSirius Red: Zabarwić szkiełka barwnikiem Picrosirius Red (0,1%) i przeciwbarwić barwnikiem Hematoxyliny. 
	UWAGA: Po zabarwieniu odwodnić szkiełka za pomocą stopniowanego alkoholu i oczyścić za pomocą ksylenu. Zamontuj szkiełka za pomocą mocowania Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX), obserwuj je pod mikroskopem i uzyskuj obrazy.</li>
	<li>W celu barwienia immunohistochemicznego (kolagen typu II) chondrogennego zróżnicowanego osadu, należy poddać skrawki osadu enzymatycznemu pobraniu antygenu przy użyciu enzymów pronazy (1 mg / ml) i hialuronidazy (2,5 mg / ml).</li>
	<li>Inkubować skrawki z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-kolagenowym typu II, a następnie drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim znakowanym 1:250 HRP.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka chromogenem 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) i przeciwbarwić je za pomocą Hematoksyliny.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem i rób obrazy.</li>
</ol>
10. Określanie zawartości GAG/DNA
<ol>
	<li>Trawić zróżnicowane chondrogenne osady przy użyciu roztworu papainy i cysteiny w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Oszacuj stężenie DNA za pomocą odczynnika Picrogreen38 i uzyskaj intensywność fluorescencji na długościach fal - wzbudzenie: 480 nm, emisja: 520 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.</li>
	<li>Oceń całkowitą zawartość GAG za pomocą metody barwnika błękitu dimetylometylenowego38.</li>
	<li>Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 525 nm za pomocą czytnika płytek ELISA.</li>
	<li>Znormalizuj wartości GAG do wartości DNA i oblicz całkowity stosunek GAG/DNA.</li>
</ol>

Chondroprogenitor and Chondrocyte Isolation from Human Articular Cartilage

<ol><li>Muthu, S., Visawanathan, V., Chellamuthu, G., Thabrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+effectiveness+of+various+treatments+for+cartilage+defects+compared+to+microfracture%3A+A+network+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cartilage+Joint+Preserv%22%5BJournal%5D)">Clinical effectiveness of various treatments for cartilage defects compared to microfracture: A network meta-analysis of randomized controlled trials.</a> J Cartilage Joint Preserv. 4 (2), 100163(2023).</li>
<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of articular cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Brittberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+articular+cartilage+repair-An+up-to-date+review%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Joint%22%5BJournal%5D)">Clinical articular cartilage repair-An up-to-date review.</a> Annals of Joint. 3 (0), (2018).</li>
<li>Muthu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cartilage+regeneration%3A+emerging+hypotheses+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies.</a> Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).</li>
<li>Lavrentieva, A., Hatlapatka, T., Neumann, A., Weyand, B., Kasper, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+osteogenic+and+chondrogenic+differentiation+of+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Potential for osteogenic and chondrogenic differentiation of MSC.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 129, 73-88 (2013).</li>
<li>Fernandez-Moure, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cells+from+cortical+bone%3A+a+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenic potential of mesenchymal stem cells from cortical bone: a comparative analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 203(2015).</li>
<li>Goldberg, A., Mitchell, K., Soans, J., Kim, L., Zaidi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+and+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The use of mesenchymal stem cells for cartilage repair and regeneration: a systematic review.</a> J Orthop Surg Res. 12, 39(2017).</li>
<li>Zha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+in+cartilage+regeneration%3A+From+characterization+to+application%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of mesenchymal stem cells in cartilage regeneration: From characterization to application.</a> NPJ Regen Med. 6 (1), 1-15 (2021).</li>
<li>Hayes, A. J., Tudor, D., Nowell, M. A., Caterson, B., Hughes, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+sulfation+motifs+as+putative+biomarkers+for+isolation+of+articular+cartilage+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells.</a> J Histochem Cytochem. 56 (2), 125-138 (2008).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+of+articular+cartilage+contains+a+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 6), 889-897 (2004).</li>
<li>Williams, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+clonal+characterization+of+a+progenitor+cell+sub-population+in+normal+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and clonal characterization of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage.</a> PloS One. 5 (10), e13246(2010).</li>
<li>Vinod, E., Parameswaran, R., Ramasamy, B., Kachroo, U. Pondering the potential of hyaline cartilage-derived chondroprogenitors for tissue regeneration: A systematic review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVinod%2C+E+%22Cartilage%22">Cartilage</a>. , (2020).</li>
<li>Khan, I. M., Bishop, J. C., Gilbert, S., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+chondroprogenitors+maintain+telomerase+activity+and+Sox9+expression+during+extended+monolayer+culture+and+retain+chondrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Clonal chondroprogenitors maintain telomerase activity and Sox9 expression during extended monolayer culture and retain chondrogenic potential.</a> Osteoarthritis Cartilage. 17 (4), 518-528 (2009).</li>
<li>Fellows, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+divergent+progenitor+cell+sub-populations+in+human+osteoarthritic+cartilage%3A+the+role+of+telomere+erosion+and+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of a divergent progenitor cell sub-populations in human osteoarthritic cartilage: the role of telomere erosion and replicative senescence.</a> Sci Rep. 7, 41421(2017).</li>
<li>Vinod, E., Kachroo, U., Amirtham, S. M., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fresh+chondrocytes%2C+cultured+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fresh chondrocytes, cultured chondrocytes and chondroprogenitors derived from human articular cartilage.</a> Acta Histochem. 122 (1), 151462(2019).</li>
<li>Korpershoek, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+highly+proliferative+and+multipotent+meniscus+progenitors+through+differential+adhesion+to+Fibronectin%3A+A+novel+approach+in+meniscus+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of highly proliferative and multipotent meniscus progenitors through differential adhesion to Fibronectin: A novel approach in meniscus tissue engineering.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8614(2021).</li>
<li>Wang, J., Roberts, S., Li, W., Wright, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+regional+human+meniscus+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of regional human meniscus progenitor cells.</a> Front Bioeng Biotechnol. 10, 1003966(2022).</li>
<li>Koelling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+chondrogenic+progenitor+cells+from+repair+tissue+during+the+later+stages+of+human+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Migratory chondrogenic progenitor cells from repair tissue during the later stages of human osteoarthritis.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 324-335 (2009).</li>
<li>Seol, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+progenitor+cells+respond+to+cartilage+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury.</a> Arthritis Rheum. 64 (11), 3626-3637 (2012).</li>
<li>Xue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+stem+cells+in+different+subtypes+of+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of stem cells in different subtypes of cartilage tissue.</a> Expert Opin Biol Ther. 15 (5), 623-632 (2015).</li>
<li>McCarthy, H. E., Bara, J. J., Brakspear, K., Singhrao, S. K., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+equine+articular+cartilage+progenitor+cells+and+bone+marrow-derived+stromal+cells+as+potential+cell+sources+for+cartilage+repair+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+J%22%5BJournal%5D)">The comparison of equine articular cartilage progenitor cells and bone marrow-derived stromal cells as potential cell sources for cartilage repair in the horse.</a> Vet J. 192 (3), 345-351 (2012).</li>
<li>Elsaesser, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+migrative+subpopulation+of+adult+human+nasoseptal+chondrocytes+with+progenitor+cell+features+and+their+potential+for+in+vivo+cartilage+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+%26+Biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a migrative subpopulation of adult human nasoseptal chondrocytes with progenitor cell features and their potential for in vivo cartilage regeneration strategies.</a> Cell & Biosci. 6, 11(2016).</li>
<li>Batschkus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+secretome+of+human+chondrogenic+progenitor+cells+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Mapping the secretome of human chondrogenic progenitor cells with mass spectrometry.</a> Ann Anat. 212, 4-10 (2017).</li>
<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+chondroprogenitors+retain+superior+intrinsic+chondrogenic+potential+for+regenerative+cartilage+repair+as+compared+to+human+fibronectin-derived+chondroprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human fibronectin-derived chondroprogenitors.</a> Sci Rep. 11, 23685(2021).</li>
<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarticular+injection+of+allogenic+chondroprogenitors+for+treatment+of+osteoarthritis+in+rabbit+knee+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Orthop+Trauma%22%5BJournal%5D)">Intraarticular injection of allogenic chondroprogenitors for treatment of osteoarthritis in rabbit knee model.</a> J Clin Orthop Trauma. 10 (1), 16-23 (2018).</li>
<li>Xue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+progenitor+cells+combined+with+PHBV+in+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Cartilage progenitor cells combined with PHBV in cartilage tissue engineering.</a> J Trans Med. 17 (1), 104(2019).</li>
<li>Carluccio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+activated+by+platelet+lysate+in+human+articular+cartilage+as+a+tool+for+future+cartilage+engineering+and+reparative+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells activated by platelet lysate in human articular cartilage as a tool for future cartilage engineering and reparative strategies.</a> Cells. 9 (4), E1052(2020).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+delivery+of+extracellular+vesicles+secreted+by+chondrogenic+progenitor+cells+from+MRL%2FMpJ+superhealer+mice+enhances+articular+cartilage+repair+in+a+mouse+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Intra-articular delivery of extracellular vesicles secreted by chondrogenic progenitor cells from MRL/MpJ superhealer mice enhances articular cartilage repair in a mouse injury model.</a> Stem Cell Res Ther. 11 (1), 93(2020).</li>
<li>Wang, H. C., Lin, T. H., Hsu, C. C., Yeh, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+osteochondral+defects+through+the+differentiation+potential+of+cartilage+stem%2Fprogenitor+cells+cultivated+on+porous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Restoring osteochondral defects through the differentiation potential of cartilage stem/progenitor cells cultivated on porous scaffolds.</a> Cells. 10 (12), 3536(2021).</li>
<li>Kellgren, J. H., Lawrence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiological+assessment+of+osteo-arthrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Radiological assessment of osteo-arthrosis.</a> Ann Rheum Dis. 16 (4), 494-502 (1957).</li>
<li>Vinod, E., Kachroo, U., Rebekah, G., Yadav, B. K., Ramasamy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+articular+chondrocytes+and+chondroprogenitors+derived+from+non-diseased+and+osteoarthritic+knee+joints+to+assess+superiority+for+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human articular chondrocytes and chondroprogenitors derived from non-diseased and osteoarthritic knee joints to assess superiority for cell-based therapy.</a> Acta Histochem. 122 (6), 151588(2020).</li>
<li>Nelson, L., McCarthy, H. E., Fairclough, J., Williams, R., Archer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+viable+pool+of+stem+cells+within+human+osteoarthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Evidence of a viable pool of stem cells within human osteoarthritic cartilage.</a> Cartilage. 5 (4), 203-214 (2014).</li>
<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+the+isolation+and+culture+of+Migratory+chondroprogenitors+from+Human+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for the isolation and culture of Migratory chondroprogenitors from Human articular cartilage.</a> Connect Tissue Res. 64 (4), 389-399 (2023).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Vinod, E., Boopalan, P. R. J. V. C., Sathishkumar, S. Reserve or resident progenitors in cartilage? Comparative analysis of chondrocytes versus chondroprogenitors and their role in cartilage repair. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVinod%2C+E+%22Cartilage%22">Cartilage</a>. , (2017).</li>
<li>Dicks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+chondroprogenitors+from+human+iPSCs+based+on+cell+surface+markers+identified+using+a+CRISPR-Cas9-generated+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of chondroprogenitors from human iPSCs based on cell surface markers identified using a CRISPR-Cas9-generated reporter.</a> Stem Cell Res Ther. 11 (1), 66(2020).</li>
<li>Vinod, E., et al. Prospective isolation and characterization of chondroprogenitors from human chondrocytes based on CD166/CD34/CD146 surface markers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVinod%2C+E+%22Cartilage%22">Cartilage</a>. , (2021).</li>
<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+chondroprogenitors+retain+superior+intrinsic+chondrogenic+potential+for+regenerative+cartilage+repair+as+compared+to+human+Fibronectin-derived+chondroprogenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Migratory chondroprogenitors retain superior intrinsic chondrogenic potential for regenerative cartilage repair as compared to human Fibronectin-derived chondroprogenitors.</a> Sci Rep. 11 (1), 23685(2021).</li>
<li>Vinod, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+cartilage-derived+chondrocytes+and+chondroprogenitors+display+a+greater+commitment+to+chondrogenesis+than+adult+cartilage+resident+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human fetal cartilage-derived chondrocytes and chondroprogenitors display a greater commitment to chondrogenesis than adult cartilage resident cells.</a> PloS One. 18 (4), e0285106(2023).</li>
<li>Joos, H., Wildner, A., Hogrefe, C., Reichel, H., Brenner, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+beta+and+tumor+necrosis+factor-alpha+inhibit+migration+activity+of+chondrogenic+progenitor+cells+from+non-fibrillated+osteoarthritic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha inhibit migration activity of chondrogenic progenitor cells from non-fibrillated osteoarthritic cartilage.</a> Arthritis Res Ther. 15 (5), R119(2013).</li>
<li>Vinod, E., Parameswaran, R., Amirtham, S. M., Rebekah, G., Kachroo, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%2C+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+and+chondrocytes+to+determine+cell+superiority+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of human bone marrow mesenchymal stem cells, articular cartilage derived chondroprogenitors and chondrocytes to determine cell superiority for cartilage regeneration.</a> Acta Histochem. 123 (4), 151713(2021).</li>
<li>Vinod, E., Padmaja, K., Ramasamy, B., Sathishkumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+articular+cartilage+derived+chondroprogenitors+for+cartilage+repair+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthopaed%22%5BJournal%5D)">Systematic review of articular cartilage derived chondroprogenitors for cartilage repair in animal models.</a> J Orthopaed. 35, 43-53 (2022).</li>
</ol>

Potencjalna regeneracja chrząstki stawowej, zawierającej tkankę szklistą, może być osiągnięta poprzez optymalizację jej dwóch natywnych typów komórek: chondrocytów i chondroprogenitorów. Podczas gdy szeroko zakrojone badania nad chondrocytami dostarczyły cennych informacji na temat ich roli w naprawie chrząstki, pytania o naturę zregenerowanej tkanki skłoniły do podjęcia wysiłków na rzecz poprawy ich fenotypu i zbadania alternatywnych terapii3. Chondroprogenitory, zidentyfikowane jako stosunkowo nowa subpopulacja komórkowa, są obiecujące ze względu na ich nieodłączne właściwości mezenchymalne, zwiększoną chondrogenezę i ograniczone cechy przerostowe12. Dwie podstawowe techniki zbierania i wzmacniania komórek progenitorowych obejmują różnicową adhezję fibronektyny i test eksplantacyjny oparty na migracji 18,32. Opisano również izolację ludzkich FAA-CP przy użyciu tkanki łąkotki, zgłaszając wysoki potencjał proliferacyjny i multipotencjalny16,17. Badania charakterystyki in vitro porównujące FAA-CP i MCP z chondrocytami wskazują na wyższy potencjał FAA-CP i MCP do wykazywania wyższych fenotypów chondrogennych i mniej przerostowych, co odzwierciedla korzystny profil ze zwiększoną akumulacją i produkcją GAG 15,24,31,39. Ograniczone badania in vivo sugerują, że chondroprogenitorzy mogą łagodzić postęp choroby zwyrodnieniowej stawów i wykazywać korzystne wyniki w naprawie ubytków kostno-chrzęstnych, gdy są stosowane w połączeniu z biorusztowaniami. W ostatnich latach podjęto znaczne wysiłki badawcze w celu wzmocnienia i odkrycia pełnego potencjału chondroprogenitorów.
W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół izolacji komórek rezydujących w chrząstce. Pierwotnymi i najczęstszymi komórkami uwalnianymi z chrząstki są chondrocyty. Jednak chrząstka trawiona enzymatycznie to niejednorodna populacja komórek, która zawiera nie tylko chondrocyty, ale także komórki progenitorowe w bardzo niskim stężeniu, co wymaga wzbogacenia w warunkach in vitro .
Obserwując poszlaki wskazujące na udział tych komórek w napędzaniu wzrostu apozycyjnego, Dowthwaite i in. podjęli się izolacji i charakterystyki chondroprogenitorów. Te progenitory zostały wyprowadzone z powierzchownej warstwy chrząstki stawowej poprzez wykorzystanie testu adhezji fibronektyny10. Ta odrębna populacja została wyekstrahowana z płodów cieląt w procesie obejmującym selektywną adhezję do fibronektyny. Wykazano, że posiada elastyczność fenotypową i wysoką zdolność do tworzenia kolonii, wraz z ekspresją genu selekcjonora losu komórki Notch-1. Oprócz tych wstępnych badań, charakterystyka komórek progenitorowych z ludzkiej chrząstki stawowej ujawniła podwyższone poziomy ekspresji SOX9 i Notch1, preferencję dla CD49e / CD29 i zwiększoną aktywność telomerazy w porównaniu z dojrzałymi chondrocytami12,32. Protokół ten został również ustalony w tkance ludzkiej chrząstki z chorobą zwyrodnieniową stawów, a doniesienia wskazują na jego obecność nie tylko w chrząstce powierzchownej, ale także w głębszych warstwach chrząstki, przy czym wiele grup stosuje kultury poliklonalne do kultur monoklonalnych11,12.
Z drugiej strony, Koelling i in. badali potencjalny udział chondroprogenitorów w naprowadzaniu i migracji w odpowiedzi na uszkodzenie chrząstki, przyczyniając się w ten sposób do naprawy tkanek18. Ponadto Seol i wsp. wykazali, że w odpowiedzi na uszkodzenie chrząstki przodkowie wykazywali zwiększoną migrację poprzez białko High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) i chemotaksję za pośrednictwem RAGE19. Elsaesser i wsp. zaobserwowali również lepszą zdolność migracyjną chondroprogenitorów nosowych w porównaniu z chondrocytami i BM-MSCs22. Badanie przeprowadzone przez Joos i wsp. wykazało, że uwalnianie płytkowego czynnika wzrostu-BB (PDGF-BB) i insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1) zwiększyło migrację chondroprogenitorów, podczas gdy interleukina 1 beta (IL-1β) i czynnik martwicy nowotworu-alfa (TNFα) hamowały ruch progenitora po urazie40. Niedawno przeprowadzono raport porównujący cztery różne metody izolacji MCP pod względem metod izolacji i warunków hodowli, a zalecana metoda została wyjaśniona w tym artykule33. Podejście polegające na izolowaniu progenitorów na podstawie ich zdolności migracyjnych zaowocowało powstaniem komórek, które nie tylko wykazywały wysoki potencjał chondrogeniczny, ale także wykazywały cechy podobne do mezenchymalnych komórek macierzystych.
W laboratorium, zgodnie ze znormalizowanymi protokołami, udało się wyizolować wszystkie trzy podtypy. Ponadto pionierskie badania porównawcze wykazały lepsze cechy FAA-CP w porównaniu z chondrocytami 12,15,41. Zbadano również porównania między chondroprogenitorami, ujawniając, że MCP wykazują większy potencjał24. Należy pamiętać, że ponieważ trzy podtypy są izolowane z tej samej tkanki, a przodek w swojej natywnej postaci jest bardzo niski w swojej obecności po początkowym uwolnieniu z chrząstki stawowej - która zawiera głównie chondrocyty - istnieje potrzeba ich wzbogacenia za pomocą kultur in vitro.
Kompleksowe metody oceny obejmowały sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), analizę mikroskopową elektronów, badania miareczkowania czynnika wzrostu, techniki znakowania komórek, immunoprofilowanie oraz ocenę ich potencjału terapeutycznego w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów i wad chrzęstnych przy użyciu modeli in vivo 12,24,42.
Obecne wyniki wskazują, że izolacja wszystkich trzech podtypów jest możliwa nawet w przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów, choć wymaga wydłużonego czasu ekspansji. W szczególności podkreślamy znaczenie unikania dodawania czynników wzrostu podczas wzrostu klonalnego, podkreślając kluczową potrzebę wprowadzenia dodatkowych czynników podczas ekspansji tych komórek. Kluczowe kroki, takie jak czas inkubacji na płytkach pokrytych fibronektyną, dodanie czynników wzrostu w różnych punktach czasowych i minimalne obchodzenie się z eksplantatami, wśród innych wymienionych niezbędnych, odgrywają znaczącą rolę w hodowli i ekspansji zebranych komórek. Istotne jest również, aby upewnić się, że komórki osiągną zbieg nie większy niż 75%-80% w danym punkcie czasowym.
Potencjał chondroprogenitorów wzbudził duże zainteresowanie ze względu na ich wyższość nad powszechnie stosowanymi terapiami komórkowymi w dziedzinie naprawy chrząstek, a mianowicie BM-MSC i chondrocytami. Ci przodkowie są obiecujący, a kilka eksperymentów in vivo wykazało ich skuteczność w zastępowaniu obecnego standardu opieki. Jako niedawno odkryta podgrupa, charakterystyka i informacje na temat ich fenotypu są nadal w toku, a pierwsze badanie kliniczne z wykorzystaniem FAA-CP w leczeniu wad chrzęstnych ma rozpocząć się w 2024 roku. W związku z tym izolacja i ekspansja komórek pochodzących z chrząstki, w szczególności chondroprogenitorów, mają kluczowe znaczenie i są obiecujące dla naprawy opartej na komórkach w dziedzinie regeneracji chrząstki.

Pojawienie się terapii regeneracyjnej opartej na komórkach stanowi znaczące podejście do leczenia dolegliwości związanych z chrząstkami, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) i wady chrzęstne1. Zaburzenia te, charakteryzujące się rozpadem lub uszkodzeniem chrząstki w stawach, stanowią poważne wyzwanie podczas leczenia. Samonaprawa chrząstki stawowej jest ograniczona ze względu na jej architekturę tętniaka, unaczynienie i niską aktywność mitotyczną2.
Najczęściej wykorzystywanymi komórkami do regeneracji tkanki chrzęstnej są Mezenchymalne Komórki Macierzyste (MSC) i chondrocyty3. Jednak kilka badań wykazało ograniczenia w używaniu tych komórek do regeneracji4. Ograniczenia te obejmują końcowe różnicowanie chondrocytów podczas przedłużonej ekspansji in vitro w celu osiągnięcia wymaganej liczby komórek oraz skłonność do przerostu MSC. Czynniki te mogą prowadzić do powstania tkanki naprawczej z nieoptymalną kombinacją chrząstki włóknistej i szklistej 5,6,7,8.
Odkrycie komórek chondroprogenitorowych (CPC) powstało w wyniku poszukiwania alternatywnych komórek w chrząstce stawowej9. Wzbudziły one ogromne zainteresowanie ze względu na ich podobieństwo do MSCs i ich doskonały potencjał chondrogeniczny, a wszystko to przy jednoczesnym wykazywaniu zmniejszonej hipertrofii - niezbędnej kombinacji, poszukiwanej 10,11. W przeciwieństwie do chondrocytów, te populacje progenitorowe wykazują zwiększoną aktywność replikacyjną i telomerazy, a także zwiększoną ekspresję neurogennego białka homologicznego locus notch 1 (NOTCH-1) i czynnika transkrypcyjnego SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Istnieją dwie standardowe metody izolowania CPC zgłaszane zarówno z chrząstki, jak i łąkotki, w tym jedna oparta na ekspresji ich receptora integrynowego (CD49e/CD29), wyizolowana za pomocą testu adhezji fibronektyny - Chondroprogenitors pochodzące z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs), a druga oparta na ich zwiększonym potencjale migracyjnym z eksplantatów chrząstki - Migratory Chondroprogenitors (MCPs)11,13,16,17,18,19. Liczne badania in vitro wykazują chondrogenną wyższość i zmniejszoną przerost zarówno FAA-CPC, jak i MCP w porównaniu z chondrocytami i szpikiem kostnym (BM)-MSCs20,21,22,23.
Ostatnie badania in vitro porównujące FAA-CPC z MCP wykazały zwiększoną zdolność do regeneracji chrząstki u tej drugiej populacji przodków w normalnych warunkach tlenowych24. Te optymistyczne wyniki badań in vitro wskazują na regenerację podobną do szklistej rośliny, zachęcając do dalszych eksperymentów in vivo. Niemniej jednak doniesiono, że obie populacje CPC skutecznie naprawiają i regenerują chrząstkę w chorobie zwyrodnieniowej stawów i innych zaburzeniach chrzęstno-kostnych w modelach zwierzęcych25,26,27,28,29.
Nasze laboratorium aktywnie przyczyniło się do standaryzacji technik izolacji CPC i porównania ich cech fenotypowych z chondrocytami i MSC. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół wyjaśniający etapy związane z izolacją i hodowlą komórek rezydujących w chrząstce, a mianowicie chondrocytów, FAA-CPC i MCP.

<table><tbody><tr><td>Ostrze 22-skalpelowe&nbsp;</td><td>SZKLANA VAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>J6012</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Czerwony&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>130223</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna-B (2 &mu; g/ml).</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy (62 &mu; g/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>BC CytoFLEX LX cytometr przepływowy&nbsp;</td><td>Oprogramowanie BECKMAN</td><td>COULTER CYTExpert Wersja 2.5</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>&nbsp; C34006</td><td></td></tr><tr><td>CD105-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561443 <tr><td>CD106-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 551147 <tr><td>CD14-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555397 <tr><td>CD29-APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 559883 <tr><td>CD34-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>348057 CD45-FITC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td> 347463</tr><tr><td>CD49b-FITC</td><td>MILTENYL BIOTEC&</td><td>nbsp; MACS 130/100337</td><td></td></tr><tr><td>CD49E-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555617 <tr><td>CD73-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 550257 <tr><td>CD90-PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>561970</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>DE NOVIX</td><td>Cell Drop BF</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>HIMEDIA</td><td>TCP024</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2&nbsp;</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>MODEL-371</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu X (COL10A1), czynnik transkrypcyjny związany z runt (RUNX2), czynnik transkrypcyjny SRY-Box 9 (SOX-9), agrekan (ACAN) i kolagen typu II (COL2A1)&nbsp;</td><td>EUROGENTEC, BELGIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>WORTHINGTON</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>D8900-1L</td><td></td></tr><tr><td>CZYTNIK PŁYTEK ELISA</td> URZĄDZENIA <td>MOLEKULARNE</td><td>Czytnik SpectraMax i3x</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>FISHER SIENTIFIC</td><td>2353459</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>CLOUD CLONE CORP</td><td>APA551Hu01</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna (10 &mikro; L/mL)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>System syntezy pierwszej nici</td><td>TAKARA BIO</td><td>6110A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39411</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>M8787</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony O</td><td>SIGMA</td><td>1320065</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>termocykler PCR&nbsp;</td><td>Termocykler APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>Quantstudio 12K Flex&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (100 j.m./ml)</td><td>GIBCO</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red</td><td>ALFA AESAR</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe (mysi kolagen typu II)</td><td>DSHB</td><td>DSHB II II6B3</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>ROCHE</td><td>10165913103</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Odczynnik do badania DSNA</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>ELANPRO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniKit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>QUALIGENS</td><td>Q39962</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne (Goat Anti-Mouse IgG Antibody, koniugat HRP)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna&nbsp;</td>Zestawy wyróżniające <td>REMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StemPro&nbsp;</td><td>Kolba GIBCO</td><td>1007201, A1007001 i A1007101</td><td></td></tr><tr><td>T-25&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Niebieski&nbsp;</td><td>EUROGENTEC</td><td>UF-LSMT-B0701</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>ABCAM</td><td>ab277760</td><td></td></tr><tr><td>Kultura tkankowa Petridish</td><td>TARSONS</td><td>960010</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy</td><td>QUALIGENS</td><td>2040</td><td></td></tr><tr><td>Błękit tryfanowy&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Isolation of Chondrocytes and Chondroprogenitors Using Fibronectin Adhesion and Migratory Assay

Komórki chondroprogenitorowe (CPC), ostatnio zidentyfikowane jako odrębna subpopulacja, wykazują obiecujące cechy ze względu na swoje właściwości mezenchymalne, zwiększoną chondrogenezę i ograniczone cechy przerostowe. Wzbogacenie komórek progenitorowych uzyskuje się poprzez różnicową adhezję fibronektyny i testy eksplantatywne oparte na migracji, przy czym chondroprogenitory pochodzące z testu adhezji fibronektyny (FAA-CP) i chondroprogenitory migracyjne (MCP) wykazują większy potencjał w porównaniu z chondrocytami. W tym artykule zagłębiamy się w szczegóły izolowania komórek pochodzących z chrząstki rezydentnej, a mianowicie chondrocytów i chondroprogenitorów. Podczas gdy cenne spostrzeżenia z badań nad chondrocytami przyczyniają się do naszego zrozumienia naprawy chrząstki, ciągłe wysiłki są ukierunkowane na wykorzystanie chondroprogenitorów i zbadanie ich potencjału jako alternatywnego podejścia terapeutycznego. Ponadto ten artykuł metodologiczny zawiera szczegółowy protokół krok po kroku izolowania trzech określonych typów komórek z chrząstki: chondrocytów, FAA-CP i MCP. Postępując zgodnie ze znormalizowanymi procedurami, protokół ten ułatwia pomyślną ekstrakcję tych podtypów komórek. Opierając się na szeroko zakrojonych badaniach, artykuł koncentruje się na skomplikowanych technikach stosowanych do izolowania różnych podzbiorów i zoptymalizowanych warunków hodowli wymaganych do ekspansji i utrzymania ich kultur. Metodologia obejmuje enzymatyczną izolację chondrocytów pochodzących z ludzkiej chrząstki stawowej, różnicową adhezję fibronektyny po sekwencyjnym trawieniu enzymatycznym oraz testy eksplantatywne oparte na migracji w celu uzyskania komórek rezydujących w chrząstce.

Z 86,9 mg plasterków chrząstki uzyskano 1,72 x 105 komórek chondrocytów. Po wysianiu chondrocyty szybko przylegają, wykazując początkowo zaokrąglony wygląd przypominający bruk, a następnie przechodzą w stan fibroblastyczny w miarę dalszej ekspansji (Rysunek 1 A,B). Wysianie tych chondrocytów na płytki z fibronektyną zazwyczaj skutkuje 2% adhezją, przy czym każda komórka ulega wzrostowi klonalnemu (Rysunek 2 C,D), osiągając pięciokrotne podwojenie populacji między 10. a 12. dniem (32 komórki/klon). Klony z obszaru 10 cm² są łączone i namnażane do odpowiedniego pasażu w celu wytworzenia FAA-CPs. Eksplanty chrząstki utrzymywane w kulturze po inkubacji z kolagenazą wykazują rozluźnienie macierzy zewnątrzkomórkowej, a migracja jest zazwyczaj obserwowana już w 7tym dniu (Rysunek 2E). Zarówno FAA-CPs, jak i MCPs wykazują wrzecionowatą strukturę, charakterystyczną dla BM-MSCs, przyjmując strukturę przypominającą plaster miodu przed osiągnięciem konfluencji (Rysunek 1E,F).
Trzy rodzaje wyizolowanych komórek, mianowicie chondrocyty, FAA-CPs oraz MCPs, są ściśle monitorowane przy użyciu obrazowania w fazowym kontraście. Przeniesienie FAA-CPs następuje dopiero po potwierdzeniu pięciu podwojeń populacji.
Charakterystyka fenotypowa wyizolowanych i namnożonych komórek zazwyczaj obejmuje analizę cytometryczną dla domniemanych markerów chondrogenezy, mianowicie CD146 i CD166, a także analizę ekspresji genów dla markerów chondrogenezy (SOX-9, ACAN, COL2A1), markera chrząstki włóknistej COL1A1 oraz markerów hipertrofii (RUNX2 i COL10A1). Wszystkie trzy grupy komórek wykazują wysoką ekspresję (&gt;95%) CD105, CD73 i CD90; niską lub ujemną ekspresję CD34 i CD45; oraz wysoką ekspresję (&gt;98%) CD166, przy umiarkowanej, zależnej od dawcy ekspresji CD146 (40%-75%)(Rysunek 2A).
Wyniki qRT-PCR wykazują porównywalną i wysoką ekspresję SOX-9, ACAN, a także COL1A1, markeru włóknistej chrząstki, w komórkach hodowanych przed ewaluacją(Rysunek 2B). W celu potwierdzenia chondrogenezy, we wszystkich grupach komórek zaobserwowano pozytywne pobieranie kompleksów pomarańczowo-czerwonych w obszarach zawierających GAG po barwieniu Safraniną O oraz kompleksów niebieskawych do purpurowych po barwieniu Błękitem Alcyjanowym i Błękitem Toluidyny, z wyższą proporcją w grupach FAA-CP i MCP. Analiza immunohistochemiczna peletów zróżnicowanych w kierunku chondrogennym pod kątem kolagenu typu II wykazuje brunatne pobieranie włókieniste w trzech grupach(Rysunek 3). Ponadto analiza GAG/DNA potwierdziła zróżnicowanie chondrogenne, przy czym grupy FAA-CP wykazały wyższą ekspresję(Rysunek 2C).
<img alt="Schemat izolacji chondrocytów; trawienie enzymatyczne, mikroskopia, wyniki testu adhezji do fibronektyny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja i charakterystyka chondrocytów oraz progenitorów chondrocytów.Algorytm badania przedstawia izolację trzech grup komórek oraz ich cechy morfologiczne pod mikroskopem w kontraście fazowym bezpośrednio po izolacji i po kilku dniach ekspansji. (A) Świeżo izolowane chondrocyty przylegają do kultur adhezyjnych w pierwszych dniach hodowli, przyjmując wygląd fibroblastyczny w miarę dalszej ekspansji (B). (C) Chondrocyty poddane testowi adhezji do fibronektyny wykazują wzrost klonalny, osiągając 5 podwojeń populacji do 10 dnia (D). (E) Progenitory chondrocytów migrują z krawędzi eksplantu do 10 dnia hodowli i wykazują wrzecionowaty wzorzec wzrostu w miarę dalszej ekspansji (F). Powiększenie obrazu w kontraście fazowym: 10x; Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza markerów FACS i ekspresja genów RT-PCR w chondrogenezie; wykresy słupkowe GAG, DNA i GAG/DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Dane charakterystyki molekularnej. (A) Analiza cytometryczna dla pozytywnych i negatywnych markerów MSC oraz potencjalnych markerów chondrogenezy. (B) Dane ekspresji RT-PCR dla trzech grup komórek w analizie ekspresji genów markerów chondrogennych i hipertroficznych. (C) Analiza całkowitego GAG/DNA w pelletach zróżnicowanych w kierunku chondrogennym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikrografie różnicowania chondrogennego, Safranin O, IHC kolagenu II, chondrocyty, FAA CP, MCP, 10x, 40x." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67160/67160fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Barwienie potwierdzające po różnicowaniu chondrogennym. Analiza z użyciem Safraniny O oraz analiza immunohistochemiczna w kierunku kolagenu typu II dla trzech grup komórek. Paski skali: dla powiększenia 10x, 50 µm; dla powiększenia 40x, 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67160/67160fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Chondroprogenitor cells (CPCs), recently identified as a distinct subpopulation, exhibit promise due to their mesenchymal properties, heightened ...

W dziedzinie inżynierii tkanki chrzęstnej i medycyny regeneracyjnej nadal istnieje potrzeba poprawy wyników biologicznych i funkcjonalnych w zakresie poprawy trwającego leczenia i opracowywania nowych strategii terapeutycznych. Obecne badania przedkliniczne wskazują na potencjalne zastosowanie chondroprogenitorów pochodzących z chrząstki jako realnej opcji leczenia chrząstki. Obecne badania obejmują strategie dalszego zwiększania potencjału chondrogennego przy jednoczesnym utrzymaniu niższej potencji przerostowej poprzez zastosowanie dodatkowych czynników wzrostu i technik rekombinacji genów.Chondroprogenitorzy stoją przed wyzwaniami eksperymentalnymi, takimi jak brak konsensusu co do nomenklatury, zróżnicowane techniki izolacji, trudności z charakterystyką, zmienność warunków hodowli i ograniczone zrozumienie mechanizmów leżących u ich podstaw. Kliniczne wykazanie, że chondroprogenitorzy dają pozytywne wyniki w porównaniu z powszechnie stosowanymi komórkami, może znacznie zmniejszyć globalne obciążenie związane z patologiami związanymi z chrząstką. Opracowanie ulepszonych metod terapeutycznych wykorzystujących alternatywy bezkomórkowe, takie jak pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące od komórek progenitorowych, oraz wykorzystanie strategii rekombinacji do regeneracji prawdziwej chrząstki szklistej.Na początek należy pobrać stawy piszczelowo-udowe lub kolanowe od ludzkich dawców w 1X PBS w sterylnych warunkach, a następnie przenieść pobrane stawy na sterylny podkład w kapturze. Aby ustabilizować stawy, trzymaj kość podchrzęstną z chrząstką skierowaną do góry. Używając ostrza skalpela numer 22, zbierz prostokątne wióry chrząstki z obszarów nieobciążających.Pokrój chrząstkę na odcinki o wymiarach osiem milimetrów na 10 milimetrów od warstwy powierzchownej do głębszej warstwy. Po umyciu plastrów PBS, umieść je na szalce Petriego zawierającej od jednego do dwóch mililitrów zwykłego zmodyfikowanego Dulbecco podłoża Eagle's lub DMEM. Następnie, używając ostrza skalpela numer 22, zmiel plastry chrząstki do rozmiaru mniejszego niż jeden milimetr sześcienny.Na początek pobierz mieloną chrząstkę z pobranych ludzkich stawów kolanowych. Umieść zmieloną chrząstkę w pionowej kolbie T25 zawierającej 10 mililitrów DMEM/F-12 bez surowicy z 0,15% kolagenazą typu II do trawienia enzymatycznego. Pozostawić kolbę w spokoju w inkubatorze z dwutlenkiem węgla na 12 do 14 godzin.Po nocnym trawieniu przenieś pożywkę zawierającą uwolnione chondrocyty do świeżej sterylnej probówki wirówkowej. Użyj sitka do komórek, aby oddzielić komórki od zanieczyszczeń. Dodać równą objętość DMEM/F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS.Odwirować przefiltrowane komórki w stężeniu 1,200 G przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu rozpuścić osad w jednym mililitrze podłoża. Policz żywe komórki za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.Następnie załaduj chondrocyty do kolby T25 o stężeniu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. Rozwiń komórki do wymaganego numeru przejścia za pomocą DMEM/F-12 zawierającego 10% FBS. Odświeżaj pożywkę co trzy dni przed pobraniem komórek w momencie zbiegu, używając 0,125% trypsyny zawierającej EDTA.Chondrocyty przylegały natychmiast po załadowaniu i w miarę rozszerzania się przechodziły z zaokrąglonego kształtu kostki brukowej do wyglądu fibroblastycznego. Na początek pobierz wióry chrzęstne z pobranych ludzkich stawów piszczelowo-udowych lub kolanowych. Poddaj wióry chrzęstne sekwencyjnemu trawieniu enzymatycznemu przez noc, najpierw używając 0,2% pronazy przez trzy godziny, a następnie 0,04% kolagenazy typu II przez 12 godzin w wstrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie pokryj wymaganą liczbę dołków sześciodołkowej płytki 1,5 mililitra roztworu fibronektyny PBS. Szczelnie zamknij płytkę i wstaw do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjmij z lodówki płytkę sześciodołkową pokrytą fibronektyną.Po usunięciu nadmiaru fibronektyny dodaj dwa do trzech mililitrów zwykłego podłoża DMEM/F-12 do powlekanych studzienek. Uwolnione chondrocyty należy umieścić w powlekanych dołkach o gęstości 4 000 komórek na dołek i pozostawić płytkę w spokoju na 20 minut. Po inkubacji odessać nadmiar pożywki i nieprzylegające komórki.Dodaj dwa do trzech mililitrów DMEM / F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą do studzienek. Utrzymuj przylegające komórki w standardowych warunkach hodowli przez 10 do 12 dni, aby uzyskać klony chondrogennych komórek progenitorowych lub CPC, a następnie izoluj klony CPC za pomocą 0,125% trypsyny EDTA przez 180 sekund, a następnie odtwórz w stosunku jeden klon na pięć centymetrów kwadratowych. Rozwiń wzbogacone poliklonalne CPC do wymaganej konfluencji.Chondrocyty poddane testowi adhezji fibronektyny wykazują wzrost klonalny, osiągając podwojenie populacji do 10 dnia. Na początek należy uzyskać ogolone eksplantaty chrząstki z pobranego stawu w uzupełnionym podłożu DMEM/F-12. Umieść płytkę z eksplantatami w inkubatorze dwutlenku węgla ustawionym na 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.Po dwóch dniach przenieś eksplantaty do probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów 0,1% roztworu kolagenazy do trawienia enzymatycznego. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po mineralizacji przepłukać eksplantaty 1X PBS i wrzucić je z powrotem do tych samych dołków w płytce zawierającej świeżo uzupełnioną pożywkę DMEM/F-12.Przechowywać płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli i monitorować migrację chondroprogenitorów w ciągu kolejnych dni. Gdy eksplantaty osiągną subkonfluencję, zbierz mezenchymalne komórki chondroprogenitorów lub MCP, używając 0,125% roztworu trypsyny EDTA. Rozwiń MCP za pomocą uzupełnionego podłoża DMEM/F-12.Chondroprogenitorzy zaczynają migrować z krawędzi eksplantatu do 10 dnia hodowli, wykazując wrzecionowaty wzór wzrostu z dalszą ekspansją.

isolation-chondrocytes-chondroprogenitors-using-fibronectin-adhesion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Opisano metodę uzyskiwania nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów, które pozwalają na nanoskalową kontrolę lokalnej gęstości powierzchni kwasu arginina-glicyna-asparaginowa (RGD) i zastosowano ją do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego.

Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Mezenchymalne komórki macierzyste poduszeczki tłuszczowej (IFP-MSC) można łatwo wyizolować z podrzepkowej poduszki tłuszczowej stawu kolanowego. Dobrze rozmnażają się in vitro, tworzą kolonie CFU-F i różnicują się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię izolacji, rozszerzania i różnicowania IFP-MSC od stawu kolanowego kóz.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.

Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Niniejszy film prezentuje technikę przygotowania eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis, w tym zastosowanie noża z brwi – specjalistycznego narzędzia do sekcji wykonanego z włosa brwiowego. Przedstawiono również protokół przygotowania testu adhezji, który służy do wykrywania kluczowych cząsteczek adhezyjnych obecnych na powierzchni komórek organizatora lub bieguna zwierzęcego, niezbędnych dla prawidłowego rozwoju.

Disekcja eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis i przygotowanie testu adhezji komórkowej

Poznaj izolację chondrocytów i chondroprogenitorów z ludzkiej chrząstki stawowej przy użyciu trawienia enzymatycznego oraz testów adhezji do fibronektyny i migracyjnych. Ta metoda wspiera badania nad inżynierią tkanek chrzęstnych i regeneracyjną medycyną.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

Przeglądaj więcej filmów