Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

W dziedzinie inżynierii tkanki chrzęstnej i medycyny regeneracyjnej nadal istnieje potrzeba poprawy wyników biologicznych i funkcjonalnych w zakresie poprawy trwającego leczenia i opracowywania nowych strategii terapeutycznych. Obecne badania przedkliniczne wskazują na potencjalne zastosowanie chondroprogenitorów pochodzących z chrząstki jako realnej opcji leczenia chrząstki. Obecne badania obejmują strategie dalszego zwiększania potencjału chondrogennego przy jednoczesnym utrzymaniu niższej potencji przerostowej poprzez zastosowanie dodatkowych czynników wzrostu i technik rekombinacji genów.

Chondroprogenitorzy stoją przed wyzwaniami eksperymentalnymi, takimi jak brak konsensusu co do nomenklatury, zróżnicowane techniki izolacji, trudności z charakterystyką, zmienność warunków hodowli i ograniczone zrozumienie mechanizmów leżących u ich podstaw. Kliniczne wykazanie, że chondroprogenitorzy dają pozytywne wyniki w porównaniu z powszechnie stosowanymi komórkami, może znacznie zmniejszyć globalne obciążenie związane z patologiami związanymi z chrząstką. Opracowanie ulepszonych metod terapeutycznych wykorzystujących alternatywy bezkomórkowe, takie jak pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące od komórek progenitorowych, oraz wykorzystanie strategii rekombinacji do regeneracji prawdziwej chrząstki szklistej.

Na początek należy pobrać stawy piszczelowo-udowe lub kolanowe od ludzkich dawców w 1X PBS w sterylnych warunkach, a następnie przenieść pobrane stawy na sterylny podkład w kapturze. Aby ustabilizować stawy, trzymaj kość podchrzęstną z chrząstką skierowaną do góry. Używając ostrza skalpela numer 22, zbierz prostokątne wióry chrząstki z obszarów nieobciążających.

Pokrój chrząstkę na odcinki o wymiarach osiem milimetrów na 10 milimetrów od warstwy powierzchownej do głębszej warstwy. Po umyciu plastrów PBS, umieść je na szalce Petriego zawierającej od jednego do dwóch mililitrów zwykłego zmodyfikowanego Dulbecco podłoża Eagle's lub DMEM. Następnie, używając ostrza skalpela numer 22, zmiel plastry chrząstki do rozmiaru mniejszego niż jeden milimetr sześcienny.

Na początek pobierz mieloną chrząstkę z pobranych ludzkich stawów kolanowych. Umieść zmieloną chrząstkę w pionowej kolbie T25 zawierającej 10 mililitrów DMEM/F-12 bez surowicy z 0,15% kolagenazą typu II do trawienia enzymatycznego. Pozostawić kolbę w spokoju w inkubatorze z dwutlenkiem węgla na 12 do 14 godzin.

Po nocnym trawieniu przenieś pożywkę zawierającą uwolnione chondrocyty do świeżej sterylnej probówki wirówkowej. Użyj sitka do komórek, aby oddzielić komórki od zanieczyszczeń. Dodać równą objętość DMEM/F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS.

Odwirować przefiltrowane komórki w stężeniu 1,200 G przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu rozpuścić osad w jednym mililitrze podłoża. Policz żywe komórki za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.

Następnie załaduj chondrocyty do kolby T25 o stężeniu 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. Rozwiń komórki do wymaganego numeru przejścia za pomocą DMEM/F-12 zawierającego 10% FBS. Odświeżaj pożywkę co trzy dni przed pobraniem komórek w momencie zbiegu, używając 0,125% trypsyny zawierającej EDTA.

Chondrocyty przylegały natychmiast po załadowaniu i w miarę rozszerzania się przechodziły z zaokrąglonego kształtu kostki brukowej do wyglądu fibroblastycznego. Na początek pobierz wióry chrzęstne z pobranych ludzkich stawów piszczelowo-udowych lub kolanowych. Poddaj wióry chrzęstne sekwencyjnemu trawieniu enzymatycznemu przez noc, najpierw używając 0,2% pronazy przez trzy godziny, a następnie 0,04% kolagenazy typu II przez 12 godzin w wstrząsającej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie pokryj wymaganą liczbę dołków sześciodołkowej płytki 1,5 mililitra roztworu fibronektyny PBS. Szczelnie zamknij płytkę i wstaw do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia wyjmij z lodówki płytkę sześciodołkową pokrytą fibronektyną.

Po usunięciu nadmiaru fibronektyny dodaj dwa do trzech mililitrów zwykłego podłoża DMEM/F-12 do powlekanych studzienek. Uwolnione chondrocyty należy umieścić w powlekanych dołkach o gęstości 4 000 komórek na dołek i pozostawić płytkę w spokoju na 20 minut. Po inkubacji odessać nadmiar pożywki i nieprzylegające komórki.

Dodaj dwa do trzech mililitrów DMEM / F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą do studzienek. Utrzymuj przylegające komórki w standardowych warunkach hodowli przez 10 do 12 dni, aby uzyskać klony chondrogennych komórek progenitorowych lub CPC, a następnie izoluj klony CPC za pomocą 0,125% trypsyny EDTA przez 180 sekund, a następnie odtwórz w stosunku jeden klon na pięć centymetrów kwadratowych. Rozwiń wzbogacone poliklonalne CPC do wymaganej konfluencji.

Chondrocyty poddane testowi adhezji fibronektyny wykazują wzrost klonalny, osiągając podwojenie populacji do 10 dnia. Na początek należy uzyskać ogolone eksplantaty chrząstki z pobranego stawu w uzupełnionym podłożu DMEM/F-12. Umieść płytkę z eksplantatami w inkubatorze dwutlenku węgla ustawionym na 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Po dwóch dniach przenieś eksplantaty do probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów 0,1% roztworu kolagenazy do trawienia enzymatycznego. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po mineralizacji przepłukać eksplantaty 1X PBS i wrzucić je z powrotem do tych samych dołków w płytce zawierającej świeżo uzupełnioną pożywkę DMEM/F-12.

Przechowywać płytkę w inkubatorze w standardowych warunkach hodowli i monitorować migrację chondroprogenitorów w ciągu kolejnych dni. Gdy eksplantaty osiągną subkonfluencję, zbierz mezenchymalne komórki chondroprogenitorów lub MCP, używając 0,125% roztworu trypsyny EDTA. Rozwiń MCP za pomocą uzupełnionego podłoża DMEM/F-12.

Chondroprogenitorzy zaczynają migrować z krawędzi eksplantatu do 10 dnia hodowli, wykazując wrzecionowaty wzór wzrostu z dalszą ekspansją.