Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Nadrzędną misją naukową naszej grupy jest opracowanie metod leczenia urazowych urazów układu mięśniowo-szkieletowego z wykorzystaniem strategii bioinżynieryjnych. W szczególności projektujemy materiały o regulowanych cechach biofizycznych, aby modulować środowiska zewnątrzkomórkowe i napędzać regeneracyjne fenotypy komórkowe. Naszym celem jest wykorzystanie tych materiałów, aby ostatecznie poprawić gojenie i poprawić jakość życia.

Stosując ścinanie do kolagenu podczas fibrogenezy, organizację lub anizotropię poszczególnych włókien kolagenowych można kontrolować w celu wytworzenia rusztowań z wysoce wyrównanymi lub losowo ugrupowanymi włókienkami o cechach nanoskali. Cechy te mogą kierować interakcjami komórkowymi i organizacją cytoszkieletu wzdłuż kierunku włókienek. Protokół ten umożliwia wytwarzanie biomateriałów z nanoskalowym wzorem fibrylarnym bez drogiego specjalistycznego sprzętu lub odczynników.

To sprawia, że jest bardziej dostępny niż inne techniki wytwarzania fibro i wysoce skuteczny w zastosowaniach inotropowej inżynierii tkankowej. Nasze wyniki przygotowują grunt pod adaptację tego protokołu do innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Badamy biolink wykonany ze zdecelularyzowanych mięśni, aby zobaczyć, w jaki sposób naśladowanie zarówno wzoru tkankowego, jak i składu białek może poprawić regenerację.

Prace te przygotowują również grunt pod wykorzystanie naszego biomateriału w wielu różnych tkankach. Obecnie wykorzystujemy tę technologię do generowania zmodyfikowanych tkanek, które mogą ułatwić złożone gojenie wielu typów tkanek. Równolegle zastanawiamy się, jak połączyć nasze materiały inżynieryjne z bodźcami mechanicznymi.

Mamy nadzieję, że uda nam się lepiej zrozumieć, w jaki sposób cechy nanoskali kierują fenotypami komórkowymi i w przyszłości opracować bardziej niezawodne terapie inżynieryjne. Na początek przytnij rurkę do dializy do około trzech cali i nawodnij ją w ultraczystej wodzie. Następnie przytnij jeden koniec rurki za pomocą klipsa do rurki do dializy za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, przenieś od pięciu do sześciu mililitrów kolagenu typu pierwszego ze szczurzego ogona do rurki.

Następnie przypnij drugi koniec rurki, aby ją zamknąć. Następnie umieść warstwę glikolu polietylenowego lub płatków kołków o grubości od 0,5 do jednego centymetra na dnie szklanego naczynia. Następnie umieść rurkę dializacyjną wypełnioną kolagenem na warstwie kołków.

Dodaj więcej płatków kołków, aby całkowicie przykryć rurkę i umieść naczynie w lodówce o czterech stopniach Celsjusza. Co 10 do 15 minut usuwać mokre płatki kołków z powierzchni rurki do dializy. Odzyskaj rurkę ze świeżą warstwą suchego kołka i włóż naczynie do lodówki o czterech stopniach Celsjusza.

Po 30 do 35 minutach usuń mokre płatki kołków z powierzchni rurki do dializy. Spłucz mokre płatki kołków wodą z kranu i osusz rurkę chusteczką. Następnie odpiąć jeden koniec rurki i przenieść dializowany kolagen do probówek do mikrowirówek.

Krótko odwiruj wszelkie pęcherzyki powietrza w kolagenie za pomocą mini wirówki o wadze 2 000 G przez maksymalnie 30 sekund w temperaturze pokojowej. Przechowuj kolagen w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Dzień przed użyciem należy pobrać około jednego mililitra dializowanego kolagenu do jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 16.

Następnie wyjąć igłę i owinąć głowicę strzykawki parafilmem. Przechowywać strzykawkę w pozycji pionowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić usunięcie małych pęcherzyków powietrza. Na początek wyjmij strzykawkę z przygotowanym dializowanym kolagenem z lodówki i przymocuj igłę o rozmiarze 22.

Umieść szklane szkiełko w pokrywie płytki czterodołkowej i przykryj szkiełko wystarczającą ilością ciepłego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby je zanurzyć. Trzymając strzykawkę pod kątem około 30 do 45 stopni, ręcznie wyciśnij cienkie paski kolagenu na szklane szkiełko. Poczekaj od jednej do dwóch minut, aż kolagen zakończy fibrogenezę lub zmieni kolor na nieprzezroczysty biały.

Następnie za pomocą kleszczy przyciąć paski kolagenu na żądaną długość. Pojedynczo delikatnie ułóż paski kolagenu wzdłuż równolegle do naciętego obszaru na przygotowanym chipsie szklanym. Wsuń krawędzie pasków pod chip.

Kontynuuj układanie pasków kolagenowych, aż do uzyskania pożądanych wymiarów. Teraz umieść nowo utworzony hydrożel kolagenowy w dwóch dołkach płytki studzienki. Pozostaw hydrożele na blacie do wyschnięcia na jedną do trzech godzin lub do momentu, gdy kryształki soli PBS pokryją od 50% do 90% powierzchni hydrożelu.

Następnie zanurz każdy hydrożel w PBS na około 30 do 60 sekund lub do momentu, gdy kryształki soli się rozpuszczą. Delikatnie zetrzyj nadmiar PBS z hydrożeli chusteczką. Na koniec umieść hydrożele z powrotem na płytce studzienki i pozostaw je do wyschnięcia na noc w dygestorium.

Aby rozpocząć, wyjmij strzykawkę z kolagenem z lodówki i przymocuj igłę o rozmiarze 22. Wytłaczaj kolagen w ilości około 3,2 mililitra na minutę na suchy szklany wiór. Upewnij się, że wytłaczana jest wystarczająca ilość kolagenu, aby uzyskać wymiary takie jak wyrównane hyderogele kolagenowe.

Teraz użyj kleszczy, aby zanurzyć wytłaczany kolagen w 50-mililitrowej tubce z podgrzanymi 10XPBS. Odczekaj od 45 do 60 sekund, aż kolagen zakończy fibrogenezę lub zmieni kolor na nieprzezroczysty biały. Następnie delikatnie zetrzyj nadmiar PBS z kolagenu za pomocą chusteczki.

Po wypłukaniu i wysuszeniu hydrożeli sterylizuj je i otaczającą je płytkę studzienkową w 70% etanolu przez 15 minut. Krótko podnieś hydrożele w połowie sterylizacji za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że zarówno spód szklanego wióra, jak i hydrożel mają kontakt z etanolem. Następnie usuń etanol i pozostaw hydrożele do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.

Umyj hydrożele trzy razy w sterylnym PBS przez 10 minut każdy, aby usunąć resztki etanolu i ponownie nawodnić hydrożele. Obrazy jasnego pola pierwotnych mioblastów mięśni szkieletowych myszy wykazały, że anizotropowe nanotopograficzne prowadzenie fibro kolagenu sprzyja wyrównaniu komórek.