Badanie przesiewowe fragmentów kowalencyjnych przy użyciu ilościowego testu nieodwracalnego wiązania

Współpracujemy między wydziałami chemii i nauk przyrodniczych, opracowując nowatorskie wspomagające reaktywne ligandy kowalencyjne dla szeregu celów leków przeciwnowotworowych. Jest nadzieja, że cząsteczki te zostaną wykorzystane w przyszłości, albo jako terapia, albo być może jako sondy chemiczne. Tak więc istnieje kilka technologii przesiewowych ligandów kowalencyjnych

Można je ogólnie podzielić na techniki proteomiczne, w których związki są inkubowane z hodowanymi komórkami i spektrometrię mas stosowaną do określenia, które białka znakują cząsteczki, oraz metody oparte na celach, w których biblioteki elektrofilów są inkubowane z pojedynczymi białkami. Istotnym wyzwaniem eksperymentalnym jest reaktywność ligandów kowalencyjnych. Nadmiernie reaktywne cząsteczki często pojawiają się jako trafienia podczas testów przesiewowych, ale są nieodpowiednie, ponieważ nieselektywnie znakują wiele różnych białek w komórce.

Związek aktywności ma zatem kluczowe znaczenie, które należy brać pod uwagę na każdym etapie odkrywania leków kowalencyjnych. Tak więc grupy Manna i Armstronga z Imperial opracowały nową metodę badań przesiewowych elektrofilów pod kątem celu białkowego, zwaną ilościowym nieodwracalnym wiązaniem lub testem qIT. Nasz protokół zapewnia bardzo potrzebną, nową metodę badań przesiewowych elektrofilów pod kątem docelowego białka, która jest skalowalna, nie wymaga spektrometrii mas i kontroli wewnętrznej reaktywności związku.

Na początek przygotuj wszystkie wymagane roztwory podstawowe i pozostaw je w temperaturze pokojowej na dwie godziny przed eksperymentem. Odgazowuje ilościowy, nieodwracalny bufor do wiązania lub test qIT z argonem przez około 30 minut. W celu przeprowadzenia wymiany buforowej należy rozcieńczyć roztwór białkowy w nadmiarze odgazowanego buforu do oznaczania qIT w jednostce filtra wirowego i wirować z prędkością 4 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu zagęszczenia białka.

Następnie rozcieńczyć docelowy roztwór białka do stężenia 15 mikromolowców w odgazowanym buforze testowym qIT, aby przygotować dziewięć mililitrów roztworu. Dozować roztwór TCEP-agraozy, bufor qIT i bulion glutationu do odpowiednich dołków na płytkach 384-dołkowych. Przenieś 1,8 mikrolitra z każdej odpowiedniej studzienki płytki biblioteki fragmentów, aby utworzyć płytkę rozcieńczającą związek, rozcieńczając każdy związek do 1,5 milimola w buforze testowym qIT plus 3% DMSO.

Za pomocą stacji pipetującej 384 przenieść 20 mikrolitrów roztworu złożonego z każdej studzienki płytki rozcieńczającej związek do obu płytek reakcyjnych. Aby rozpocząć, skonfiguruj ilościowy test nieodwracalnego wiązania lub test qIT z pożądanym białkiem i glutationem. Dozuj 500 mikromolowych zapasów CPM do 111,2 mikrolitrowych porcji w probówkach do mikrowirówek i przechowuj je w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu wywaru CPM dodaj go do 40 mililitrów buforu hartowniczego qIT, aby przygotować roztwór o stężeniu 1,4 mikromola Dozuj 27 mikrolitrów roztworu hartowniczego CPM do każdej studzienki z dwiema świeżymi płytkami 384-dołkowymi. Odwirować białkową płytkę reakcyjną o stężeniu 200 G przez trzy minuty w celu osadzenia TCEP-agarozy. W określonych punktach czasowych należy użyć stacji pipetującej 384, aby przenieść trzy mikrolitry próbki z każdej studzienki płytki reakcyjnej białka na płytkę gaszącą CPM.

Usunąć próbkę z górnej części studzienki, unikając zasysania TCEP-agarozy na dnie. Inkubować płytki hartownicze CPM w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę i mierzyć intensywność fluorescencji ze wzbudzeniem na 384 nanometrach i emisją na 470 nanometrach. Na początek należy przeprowadzić ilościowo-nieodwracalne wiązanie lub test qIT z żądanym białkiem i schłodzić próbki na płytce CPM.

Dla każdego hartowania należy obliczyć liczbę pierwszą Z jako miarę jakości testu. Następnie należy obliczyć średnie wartości fluorescencji dla studzienek kontroli ujemnej w kolumnach pierwszej i drugiej oraz dla studzienek kontroli dodatniej w kolumnach 23 i 24. Dobrze znormalizować każdą reakcję do średnich wartości fluorescencji kontroli dodatniej i ujemnej i oddzielnie wykreślić procent modyfikacji w funkcji czasu dla każdego związku reagującego z glutationem i białkiem docelowym.

Korzystając z GraphPad, dopasuj znormalizowane dane procentowe zmodyfikowane w funkcji czasu do jednofazowego modelu rozkładu wykładniczego dla obu reakcji za pomocą równania, AE do potęgi KT C. Użyj szybkości, z jaką fragmenty reagują z białkiem i glutationem, aby obliczyć współczynnik wzmocnienia szybkości lub wartość REF dla każdego fragmentu. Na koniec, aby wybrać Fragmenty trafienia, ustaw próg REF, dowolny współczynnik trafień lub wybierz fragmenty, których REF jest o trzy odchylenia standardowe większe niż średnia geometryczna. Związek pierwszy reagował z resztą cysteiny na białku docelowym sześciokrotnie szybciej niż z glutationem, spełniając kryterium Hit REF większe niż trzy.

Związek drugi nie wykazywał przyspieszonej szybkości reakcji z docelową resztą cysteiny w porównaniu z glutationem, co wskazuje na brak produktywnych oddziaływań niekowalencyjnych i dlatego nie został wybrany jako trafienie.