Polaryzacja i charakterystyka makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów M1 i M2 na powierzchniach implantów

Głównym celem tej procedury jest wdrożenie kompleksowego protokołu hodowli i charakterystyki mikrofagów na różnych powierzchniach implantów oraz charakterystyka podtypów mikrofagów. W ramach tej charakterystyki stosuje się kilka metod, w tym qRT-PCR, EISA i CLSM, w celu określenia profili ekspresji genów, białek wydzielniczych i markerów powierzchni komórki. Wyniki wskazują na użyteczność i skuteczność wdrożonego protokołu w polaryzacji mikrofagów i powierzchni implantów oraz dokładnej ich identyfikacji na podstawie ekspresji genów, wydzielanych białek i markerów powierzchni komórek.

Co więcej, markery opisują spójne i specyficzne wzorce ekspresji, które można wykorzystać do rozróżnienia różnych podtypów MDM. Ogólnie rzecz biorąc, badanie przyczyni się do opracowania i zaprojektowania materiałów immunomodulujących w celu poprawy i promowania skutecznych procesów regeneracji tkanek, zapobiegania przewlekłym stanom zapalnym związanym z implantami oraz zwiększenia udanej integracji implantów. Na początek ponownie zawieś izolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej w 15 mililitrach wstępnie podgrzanej pożywki przyłączeniowej monocytów i przenieś je do kolby do hodowli komórek T-75.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 90 minut w celu uzyskania adhezji. Po inkubacji odrzucić supernatant i raz przemyć komórki wstępnie podgrzanym podłożem RPMI 1640, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny, delikatnie przechylając kolbę w celu usunięcia nieprzylegających lub luźno przylegających komórek. Dodaj 15 mililitrów kompletnej pożywki zawierającej 10 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów do przylegających komórek.

I inkubuj przez sześć dni, aby promować różnicowanie. Po różnicowaniu wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby i przemywać komórki 10 mililitrami PBS przez pięć minut. Aby odłączyć przylegające komórki, dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek i inkubuj przez 30 minut.

Następnie delikatnie postukaj w kolbę, aby uwolnić komórki i przenieś je do 50-mililitrowej probówki. Aby odłączyć pozostałe komórki, dodaj 10 mililitrów PBS do kolby i zezłomuj komórki. Przenieś odłączone komórki do 50-mililitrowej tuby.

Odwirować zawiesinę oddzielonych komórek o masie 300 g przez 10 minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Używając barwienia błękitem trypanowym, policz komórki na hemocytometrze, aby określić liczbę komórek i żywotność. Przygotuj zawiesinę komórek, dostosowując liczbę komórek do 160 000 komórek na jeden mililitr kompletnego podłoża.

Następnie wyczyść krążki biomateriału ultradźwiękowo w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie sterylizuj w 70% etanolu przez 30 minut. Po wysuszeniu tytanowych krążków umieść je na niepoddanej obróbce 24-dołkowej płytce i dodaj jeden mililitr przygotowanej zawiesiny komórek do każdego dołka. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby uzyskać makrofagi M0.

Aby uzyskać spolaryzowane makrofagi M1, dodaj interferon gamma i lipopolisacharyd do dołków 24-dołkowej płytki. W przypadku polaryzacji M2 dodaj interleukinę-4 i interleukinę-13. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby wywołać polaryzację.

Po uzyskaniu spolaryzowanych makrofagów pochodzących z monocytów z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, zbierz supernatant komórkowy w 1,5-mililitrowej probówce. Przenieś tytanową tarczę do nowej płytki 24-dołkowej. Odwirować supernatant komórkowy o masie 300 g przez pięć minut i przenieść supernatant do nowej probówki.

Zmierz cytokiny i chemokiny na głębokości 450 nanometrów zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Obliczyć stężenie wydzielanych cytokin lub chemokin za pomocą krzywej wzorcowej. Zmierz całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka kwasu bicinchoninowego.

Normalizuj stężenie wydzielanych białek do miligramów białka całkowitego. Umyj spolaryzowane makrofagi dwukrotnie w 800 mikrolitrach PBS. Inkubować krążki w 400 mikrolitrach buforu utrwalającego przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu buforu utrwalającego należy trzykrotnie umyć krążki w 400 mikrolitrach PBS. Teraz inkubuj dyski z 400 mikrolitrami bufora blokującego przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Odrzucić bufor blokujący i inkubować krążki przez jedną godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 400 mikrolitrach buforu barwiącego.

Po godzinie usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i trzykrotnie przemyć krążki 400 mikrolitrami buforu do mycia. Dodać fluor do znakowanych przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w buforze barwiącym i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w buforze do przemywania przez trzy minuty każda.

Dodaj 10 milimolowych DRAQ5 do PBS i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Następnie usunąć supernatant i raz umyć krążki PBS. Dodać jedną kroplę podłoża montażowego, a po pięciu minutach nałożyć szkła nakrywkowe i pozostawić próbki do wyschnięcia na godzinę.

Po wyschnięciu uszczelnij krawędzie bezbarwnym lakierem do paznokci. Aby uzyskać przegląd komórek, zobrazuj próbki pod konfokalnym mikroskopem skaningowym laserowym pod 25-krotnym powiększeniem. Zmień powiększenie na 63X, aby określić strukturę i lokalizację znaczników powierzchni.

Pierwotne makrofagi pochodzące z monocytów zostały z powodzeniem spolaryzowane do makrofagów M1 i M2 na powierzchniach tytanu, przy czym CCR7 był silniej eksprymowany w makrofagach M1, a CD209 w makrofagach M2. Analiza qRT-PCR wykazała pomyślną polaryzację pierwotnych makrofagów pochodzących z monocytów zarówno na powierzchniach tytanu, jak i szkiełek nakrywkowych z wysoką ekspresją CCR7 i TNF-alfa dla M1 oraz CD209 i CCL13 dla M2. Wysoki poziom zapalnej cytokiny TNF-alfa i chemokiny CCL13 potwierdził polaryzację M1 i M2 na poziomie białka.