Name: Polaryzacja i charakterystyka makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów M1 i M2 na powierzchniach implantów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj protokół polaryzacji makrofagów M1 i M2 pochodzących z ludzkich monocytów na powierzchniach tytanowych. Metoda wykorzystuje qRT-PCR, ELISA i CLSM do analizy markerów powierzchniowych i profili cytokinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dyski zostały uprzejmie dostarczone przez Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Niemcy. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Kliniki Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (Szpital Uniwersytecki w Tybindze).

Ludzka krew obwodowa została pobrana od zdrowych dawców krwi zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki wydziału medycznego Uniwersytetu w Tybindze (aprobata etyczna: 286/2021 BO). Ludzkie PBMC zostały wyizolowane za pomocą wirowania w gradimencie gęstości, jak opisano wcześniej16. Przedstawiono następujący protokół dla PBMC wyizolowanych z 24 ml krwi. Schematyczne przedstawienie protokołu jest pokazane w Rysunek 1.
UWAGA: Objętość krwi powinna być dostosowana w zależności od liczby użytych makrofagów M0.
Z 24 ml krwi uzyskano łącznie 35,46 ± 9,1 miliona PBMC, co dało 1,97 ± 0,46 miliona makrofagów M0 (n = 5). Wszystkie odczynniki, materiały eksploatacyjne i urządzenia są wymienione w Tabeli materiałów. są wymienione w tabeli 1.
1. Różnicowanie monocytów krwi ludzkiej do makrofagów
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wyizolowane PBMC w 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki przyłączowej monocytów i przenieść je do jednej kolby do hodowli komórkowych T75.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 90 minut, aby umożliwić adhezję.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i raz umyć komórki wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożem z delikatnym przechyleniem w celu usunięcia nieprzylegających lub luźno przylegających komórek. 
	UWAGA: Przyłączone komórki są monocytami, które stanowią około 10% wszystkich PBMC pierwotnie dodanych do kolby.</li>
	<li>Dodać 15 ml kompletnej pożywki zawierającej 10 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) do przylegających komórek i inkubować przez 6 dni w celu pobudzenia różnicowania.</li>
	<li>Pożywkę należy wymieniać na świeżą, kompletną pożywkę zawierającą 10 ng/mL M-CSF co 2 dni.</li>
</ol>
2. Uprawa i polaryzacja MDM na powierzchni implantu tytanowego
UWAGA: W 6 dniu różnicowania, makrofagi M0 zostały wysiane na powierzchni biomateriału za pomocą różnych bodźców przez 48 godzin, aby uzyskać w pełni spolaryzowane makrofagi M1 lub M2. Dla każdej badanej powierzchni użyto trzech dysków do wysiewu makrofagów M0, M1 i M2. Jako powierzchnie kontrolne użyto plastikowych szkiełek nakrywkowych poddanych hodowlom komórkowym.
<ol>
	<li>Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolb T75 i przemywać komórki 10 ml PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Odłączyć przylegające komórki, inkubując je z 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w komórki i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml. Odłącz pozostałe komórki, delikatnie zeskrobując je w 10 ml PBS.</li>
	<li>Przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować je w stężeniu 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru, aby określić liczbę komórek i żywotność.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek, dostosowując liczbę komórek do 160 000 komórek na 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Oczyść krążki biomateriału ultradźwiękowo w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie sterylizuj w 70% etanolu przez 30 minut.</li>
	<li>Suszyć tytanowe krążki przez 1-2 godziny, a następnie umieścić je w niepoddanych działaniu substancji 24-dołkowych płytkach i dodać 1 ml przygotowanej zawiesiny komórek do każdej studzienki.</li>
	<li>Aby uzyskać makrofagi spolaryzowane M1, dodaj IFN-γ i LPS w stężeniu odpowiednio 50 ng/ml i 10 ng/ml. W przypadku polaryzacji M2 dodaj IL-4 i IL-13 w stężeniu 20 ng/ml każdy. Upewnij się, że komórki M0 są hodowane bez żadnych środków polaryzacyjnych. Inkubować komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu wywołania polaryzacji.</li>
</ol>
3. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą testu ELISA
UWAGA: W drugim dniu polaryzacji próbki zostały przygotowane do analiz charakteryzacyjnych. Cytokina TNF-ɑ i chemokina CCL13 zostały zmierzone w celu scharakteryzowania odpowiednio makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Stężenie wydzielanych białek znormalizowano do całkowitego stężenia wydzielanych białek w odpowiednim supernatancie.
<ol>
	<li>Zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Przenieś krążki do nowej płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Celem jest wyeliminowanie martwych lub luźno przyczepionych komórek w niepoddanych działaniu substancji płytkach 24-dołkowych. 
	UWAGA: Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy należy sprawdzić żywotność komórek na powierzchniach. Żywotność komórek można określić za pomocą testów żywotności żywych/martwych komórek lub pośrednio za pomocą testów proliferacji komórek i cytotoksyczności.</li>
	<li>Zmierz cytokiny i chemokiny zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Zmierz cytokiny natychmiast lub przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do przyszłego pomiaru. 
	UWAGA: Dla każdego typu zestawu (biorąc pod uwagę czułość i granice wykrywalności zestawu ELISA) należy określić odpowiednie rozcieńczenie próbki. W teście kwasu bicinchoninowego (BCA) próbki rozcieńczono w stosunku 1:5. Próbki M1 dla TNF-ɑ rozcieńczono w stosunku 1:10, a próbki M2 dla CCL13 rozcieńczono w stosunku 1:12.</li>
	<li>Obliczyć stężenie wydzielanych cytokin/chemokin za pomocą krzywej wzorcowej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmierz całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.</li>
	<li>Normalizuj stężenie wydzielanych białek do mg białka całkowitego.</li>
</ol>
4. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą CLSM
UWAGA: Spolaryzowane makrofagi zostały dodatkowo scharakteryzowane poprzez barwienie ich przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórek CD209 i CCR7. Jądra zostały podbarwione przeciwstawnie za pomocą DRAQ5. CD68 lub inne markery mogą być używane jako markery panmakrofagów.
<ol>
	<li>Umyj komórki 2x w 800 μL PBS. Inkubować krążki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w 400 μl buforu utrwalającego.</li>
	<li>Po usunięciu buforu utrwalającego przemyć trzykrotnie w 400 μl PBS. Próbki należy natychmiast zabarwić lub przechowywać w temperaturze 4 °C w 1 ml buforu do przechowywania. 
	UWAGA: Dzięki temu protokołowi utrwalania i przechowywania próbki zostały pomyślnie wybarwione i zobrazowane w ciągu 1-6 tygodni od utrwalenia.</li>
	<li>Przed kolejnym krokiem po przechowywaniu umyj krążki dwukrotnie 800 μl PBS.</li>
	<li>Inkubować krążki z 400 μl buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.</li>
	<li>Odrzucić bufor blokujący i inkubować krążki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 400 μl buforu barwiącym.
	<ol>
		<li>Wykonaj procedurę immunofluorescencji przy użyciu podwójnego barwienia, aby zbadać ekspresję CCR7 i CD209 w jednej próbce. W tym celu należy połączyć przeciwciała pierwszorzędowe wyhodowane od różnych gatunków (myszy i królika) na tym samym etapie barwienia. 
		UWAGA: Aby uzyskać silny sygnał z minimalnym tłem, zoptymalizuj stężenie przeciwciał. Przeciwciało CCR7 zastosowano w końcowym stężeniu 10 μg/ml, a przeciwciało CD209 rozcieńczono w stosunku 1/400.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 3x 400 μl buforu do przemywania wodą.</li>
	<li>Dodać przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem rozcieńczone w buforze barwiącym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: Stężenie przeciwciał drugorzędowych powinno być zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnych specyficznych sygnałów przy minimalnym tle. W tym badaniu zastosowano przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 5 μg/ml do barwienia.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu próbki należy przemyć trzykrotnie w buforze do przemywania przez 3 minuty każda.</li>
	<li>Dodać 10 μM DRAQ5 do PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Usunąć supernatant i raz umyć krążki w PBS.</li>
	<li>Usuń pozostały PBS i dodaj 1 kroplę podłoża montażowego.</li>
	<li>Po 5 minutach nałożyć okulary nakrywkowe i pozostawić próbki do wyschnięcia na 1 godzinę.</li>
	<li>Po wysuszeniu próbek uszczelnić krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać je w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazowania.</li>
	<li>Aby uzyskać przegląd komórek, zobrazuj próbki w 25-krotnym powiększeniu. Aby dokładniej określić strukturę i lokalizację znaczników powierzchniowych, uzyskaj obrazy o 63-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji CCR7 i CD209 za pomocą oprogramowania ImageJ. 
	UWAGA: Akwizycja obrazu została wykonana za pomocą fotopowielacza (PMT) z wykorzystaniem systemu CLSM, który został wyposażony w laser argonowy (488 nm), laser DPSS (561 nm) oraz laser HeNe (633 nm).</li>
</ol>
5. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą qRT-PCR
UWAGA: Do izolacji RNA użyto dwóch krążków na próbkę, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do syntezy cDNA.
<ol>
	<li>Umyj krążki 2x 800 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu do lizy do pierwszego krążka i poddać komórki lizie, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieś lizat na drugi krążek i powtórz proces lizy.</li>
	<li>Dodać 350 μl 70% etanolu do lizatu i pipetować w górę iw dół, aż do uzyskania jednorodności.</li>
	<li>Przenieś lizat do kolumny wirowej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji RNA.</li>
	<li>Określ ilościowo ilość RNA za pomocą nanokropli lub innego urządzenia.</li>
	<li>Znormalizuj stężenia RNA dla różnych próbek i zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą systemu RT-PCR do syntezy pierwszej nici cDNA.</li>
	<li>Zsyntetyzować cDNA przy użyciu 350 ng RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy qRT-PCR. 
	UWAGA: W tym przypadku 350 ng oczyszczonego RNA użyto do syntezy cDNA przy użyciu 4 μL RT Mix (5x) w 20 μL.</li>
	<li>Wykonaj qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym na 96-dołkowych płytkach i indywidualnych reakcjach 15 μl (1x Syber green master mix, 0,2 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 4,5 μl rozcieńczonego cDNA w stosunku 1:10). 
	UWAGA: Program PCR rozpoczyna się od podgrzanej pokrywki (105 °C), po której następują trzy etapy: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 15 s w temperaturze 95 °C i 30 s w temperaturze 55 °C przez 40 cykli.</li>
	<li>Normalizuj poziomy ekspresji różnych genów do genu porządkowego GAPDH (lub innych genów porządkowych, takich jak β-aktyna).</li>
	<li>Obliczyć względną ekspresję genów przy użyciu metody 2−ΔΔCt, przyjmując jako odniesienie komórki M0 hodowane na szkiełkach nakrywkowych do hodowli tkankowych. W tabeli 2 wymieniono wszystkie startery użyte w tym badaniu.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± SEM. Powtórz wszystkie testy (w tym badaniu testy powtórzono pięć razy), aby zapewnić odtwarzalność. Oceń statystycznie istotne różnice między danymi o rozkładzie normalnym za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego Tukeya.</li>
	<li>Użyj testu Friedmana i testu wielokrotnego porównania Dunna, aby przeanalizować nieparametryczne zestawy danych. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby przeanalizować dane i zdefiniować istotność statystyczną jako wartość p mniejszą niż 0,05.</li>
</ol>

Assessing Immunomodulatory Effects of Implant Surfaces on Macrophages

<ol><li>Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+interactions+between+biomaterials+and+biological+systems+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics.</a> Biomaterials. 167, 191-204 (2018).</li>
<li>Ikada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Challenges in tissue engineering.</a> J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).</li>
<li>Aamodt, J. M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+biomaterial+scaffolds+and+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response.</a> Biomaterials. 86, 68-82 (2016).</li>
<li>Batool, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune-inflammatory+responses+through+surface+modifications+of+biomaterials+to+promote+bone+healing+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration.</a> J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).</li>
<li>Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization+in+tissue+repair+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling.</a> J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).</li>
<li>Shrivastava, R., Shukla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attributes+of+alternatively+activated+%28M2%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Attributes of alternatively activated (M2) macrophages.</a> Life Sci. 224, 222-231 (2019).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+responses+to+implants%3A+prospects+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).</li>
<li>Browne, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-mediated+modification+of+the+local+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).</li>
<li>Piatnitskaia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+macrophage+responses+to+biomaterials+in+vitro%3A+state-of-the-art+and+the+need+for+the+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement.</a> Front Immunol. 15, 1349461(2024).</li>
<li>Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+macrophages+in+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Activation of macrophages in response to biomaterials.</a> Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages%3A+heterogeneity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biol. 15 (1), 53(2017).</li>
<li>Salma Iqbal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+generated+human+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro generated human polarized macrophages.</a> J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).</li>
<li>Hotchkiss, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surface+characteristics%2C+including+topography+and+wettability%2C+alter+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation.</a> Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+behavior+and+interplay+with+gingival+fibroblasts+cultured+on+six+commercially+available+titanium%2C+zirconium%2C+and+titanium-zirconium+dental+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants.</a> Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).</li>
<li>Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+characteristics+on+commercial+dental+implants+differentially+activate+macrophages+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Implants+Res%22%5BJournal%5D)">Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo.</a> Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+osseointegration+of+strontium-modified+titanium+implants+by+regulating+angiogenesis+and+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization.</a> Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstacles+and+opportunities+for+understanding+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization.</a> J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).</li>
<li>Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+monocytic+cell+lines+U937+and+THP-1+as+macrophage+models+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).</li>
<li>Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+the+viability+and+growth+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells.</a> J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+type+modulates+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs.</a> Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).</li>
<li>Cerqueira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+inflammatory+responses+to+sol-gel+coatings+with+distinct+biocompatibility+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels.</a> J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surfaces+characteristics+modulate+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).</li>
<li>Nobs, S. P., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+guardians+of+organ+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis.</a> Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).</li>
<li>Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+diversity+of+macrophages+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origins and diversity of macrophages in health and disease.</a> Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).</li>
<li>Parisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+human+primary+macrophages+to+study+the+polarization+from+monocyte-derived+macrophages+to+pro-or+anti-inflammatory+macrophages+at+biomaterial+interface+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro.</a> J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).</li>
<li>Feuerer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+retrieval+from+3D+biomaterials%3A+A+detailed+comparison+of+common+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods.</a> J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+based+modulation+of+macrophage+polarization%3A+a+review+and+suggested+design+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles.</a> Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dokładne zrozumienie zachowania makrofagów jest niezbędne do zrozumienia właściwości immunomodulacyjnych materiałów do implantacji. W kilku badaniach opisano heterogeniczne markery, różnorodne modele komórkowe i protokoły charakteryzujące polaryzację makrofagów in vitro 17,18,19,20. Aby poprawić odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych, niezbędne są standaryzowane i zweryfikowane protokoły, wraz z odpowiednim modelem komórkowym i markerami charakterystyki konsensusu. W związku z tym dokładna symulacja właściwości immunomodulacyjnych materiałów implantologicznych wymaga najpierw odpowiedniego modelu komórkowego. W różnych badaniach wykorzystano szeroką gamę modeli komórkowych, takich jak izolowane makrofagi tkankowe, zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów krwi i unieśmiertelnione linie komórek monocytowych. Chociaż makrofagi izolowane tkankowo można uznać za bardziej reprezentatywne dla warunków in vivo, stanowią one wyzwanie techniczne i etyczne21,22. Makrofagi są również często pozyskiwane z uznanych unieśmiertelnionych linii komórek monocytowych, takich jak komórki THP1 23,24,25,26. Chociaż komórki te mogą oferować większą jednorodność odpowiedzi komórkowej jako nieograniczone źródło komórek niestarzejących się, zwykle uzyskuje się je od pacjentów z nowotworami hematologicznymi, a ich odpowiedzi mogą się znacznie różnić od normalnych komórek. Na przykład doniesiono, że monocytowe komórki THP1 są bardziej wrażliwe na symulatory M1 i częściej wykazują cechy M122. Wyniki tego badania są zgodne z wynikami naszego badania wstępnego (dane nie są tutaj przedstawione).
Ponadto, ponieważ monocyty pochodzące z krwi są uważane za prekursory makrofagów rezydujących w tkankach i można je łatwo uzyskać z większą wydajnością, mogą one stanowić realną alternatywę dla makrofagów 27,28,29. Na podstawie naszego badania z użyciem makrofagów pochodzących z monocytów krwi stwierdziliśmy, że komórki te w równym stopniu reagowały na stymulatory M1 i M2 zarówno na szkiełkach nakrywkowych podawanych tytanowi, jak i hodowlom komórkowym. Ponadto wykazywali wiele markerów konsensusu M1 i M2, z których niektóre są pokazane w reprezentatywnych wynikach. Wyniki pokazały, że MDM mogą być wykorzystywane jako wykonalny model in vitro do symulacji interakcji implant-makrofag.
Dla dalszych postępów w badaniach nad immunomodulacją niezbędne są stałe i swoiste markery charakteryzujące. Badania wprowadziły różnorodne markery do charakterystyki makrofagów, które różnią się nie tylko między makrofagami z różnych źródeł, ale także między makrofagami z tego samego źródła 17,18,19,24. Panel markerów M1 i M2 charakterystycznych dla MDM został określony i zweryfikowany poprzez ocenę różnych zgłoszonych markerów. W tym artykule przedstawiono niektóre z najważniejszych kluczowych markerów.
Określenie najodpowiedniejszych metod wykrywania jest również kluczową częścią procesu oceny. Techniki analityczne powszechnie stosowane do oceny markerów powierzchni komórek zazwyczaj wymagają usunięcia komórek z biomateriałów. Zaobserwowano jednak, że proces ten negatywnie wpływa na komórki, uszkadzając ich markery powierzchniowe i powodując małą liczbę oderwanych komórek30. W związku z tym cytometria przepływowa, która wymaga oderwania komórek, nie jest odpowiednia do oceny makrofagów, które są ściśle przymocowane do implantów. W tym badaniu wykrywanie markerów powierzchniowych komórek przeprowadzono za pomocą CLSM. Dzięki zastosowaniu odpowiednich markerów i optymalizacji procesu barwienia, udało nam się z powodzeniem scharakteryzować podtypy M1 i M2 w porównaniu do siebie i do komórek M0. Należy zauważyć, że barwienie fluorescencyjne jest półilościowe, co jest jednym z jego ograniczeń. Może to skomplikować ocenę komórek przy użyciu markerów wyrażonych we wszystkich podtypach bez znaczących różnic. CCR7 i CD209 zostały wybrane po przetestowaniu różnych markerów w celu scharakteryzowania MDM za pomocą CLSM. CCR7 i CD209 były konsekwentnie wyższe w podtypach M1 i M2, odpowiednio.
W ramach ograniczeń tego badania, wyniki podkreślają użyteczność i skuteczność wdrożonych protokołów w polaryzacji makrofagów na powierzchniach implantów i dokładnym ich charakteryzowaniu pod względem ekspresji genów, wydzielanych białek i markerów powierzchni komórek. Ponadto analiza opisanych markerów ujawniła spójne i specyficzne wzorce ekspresji, które można wykorzystać do rozróżnienia różnych podtypów MDM. Ten model in vitro nie odzwierciedla jednak w pełni różnorodności fenotypowej i plastyczności ludzkich makrofagów. Obecnie identyfikowanych jest kilka podtypów makrofagów (M2a, M2b, M2c, M2d), co wskazuje na potrzebę bardziej zróżnicowanych modeli in vitro w celu zbadania, w jaki sposób różne biomateriały i ich cechy (np. właściwości fizykochemiczne) wpływają na plastyczność i polaryzację makrofagów31,32. Chociaż nie jest możliwe odzwierciedlenie złożonej sytuacji in vivo za pomocą modeli in vitro, wiele wyników można uzyskać przy użyciu przedstawionego protokołu in vitro, aby skutecznie opisać potencjał immunomodulacyjny nowych biomateriałów do implantacji9. Wreszcie, co nie mniej ważne, konieczne jest dalsze ustalenie, aby scharakteryzować makrofagi w bardziej złożonych modelach in vitro lub in vivo, obejmujących rolę innych graczy w złożonych kontekstach fizjologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przyczyni się do rozwoju i projektowania biomateriałów immunomodulujących w celu poprawy i promowania korzystnych procesów regeneracji tkanek i skutecznej integracji implantów, a także zapobiegania przewlekłym stanom zapalnym związanym z implantami.

Wszczepialne biomateriały stały się konwencjonalnym rozwiązaniem dla różnych chorób ludzkich i odgrywają wielką rolę w badaniach biomedycznych, w tym inżynierii tkankowej, systemach dostarczania leków i implantach1,2. Istnieje szeroka gama implantów wykonanych z różnych materiałów o różnej budowie i funkcjonalnościach, takich jak protezy stawu biodrowego, stenty, siatki, zastawki serca czy implanty dentystyczne. Po implantacji kontakt tkanka-implant wywołuje odpowiedź immunologiczną, po której następuje ustąpienie, przebudowa tkanki i homeostaza. Na procesy te mają wpływ właściwości fizyczne, chemiczne i bioaktywne zastosowanych biomateriałów. Cechy te mogą wpływać na intensywność i spektrum reakcji pro- i przeciwzapalnych, tworzenie się torebki zwłóknieniowej, degradację tkanek i fazę gojenia3,4. W celu wsparcia i optymalizacji procesu gojenia i długoterminowej integracji implantów, jednym z pojawiających się aspektów obecnych badań jest badanie i pośredniczenie w interakcji między powierzchniami implantów a komórkami odpornościowymi.
Wśród innych komórek odpornościowych, makrofagi, które znajdują się w całym ciele, odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i obronie przeciwpatogennej, a także w procesach gojenia i utrzymaniu homeostazy tkanek5,6. Opierając się na swojej plastyczności i lokalnych bodźcach mikrośrodowiskowych tkanek, makrofagi są w stanie polaryzować się w odrębne funkcjonalne fenotypy, które wykazują duże różnice w metabolizmie komórkowym, funkcjach komórkowych i profilach wydzielania cytokin. Klasycznie aktywowany fenotyp M1 można odróżnić po wydzielaniu cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-6 i TNF-α, i bierze udział w początkowej i przewlekłej odpowiedzi zapalnej na uraz i obce biomateriały. W przeciwieństwie do tego, alternatywnie, aktywowane makrofagi M2, które są wyzwalane przez cytokiny, takie jak IL-4 i IL-13, mają charakterystyczne cechy, takie jak ustąpienie stanu zapalnego i promowanie gojenia się tkanek. Makrofagi spolaryzowane M2 można zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych komórek, takich jak CD206, oraz produkcji cytokin, takich jak IL-10 i IL-47. Podobnie makrofagi, które zostały już spolaryzowane, mogą przeprogramować się w nowym mikrośrodowisku.
Wiele badań nad interakcjami komórka-biomateriał wykazało znaczenie makrofagów w kaskadzie odpowiedzi immunologicznych na wszczepialne biomateriały oraz w organizowaniu procesów związanych z gojeniem się powikłań związanych z implantami8,9,10. Mimo że inżynieria biomedyczna poczyniła znaczne postępy w ostatnich latach, potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć, w jaki sposób implanty modulują zachowanie i polaryzację makrofagów11,12,13.
W hodowli komórkowej, monojądrzaste komórki krwi obwodowej pochodzące z monocytów (PBMCs) mogą być różnicowane na przylegające makrofagi M0, a następnie indukowana polaryzacja w kierunku fenotypów M1 lub M2 za pomocą odpowiednio LPS i IFN-γ lub IL-4. Po inkubacji in vitro z nowymi próbkami biomateriałów, możliwe jest wykorzystanie różnych receptorów powierzchniowych komórek i profili cytokin makrofagów M1 i M2 do wykrycia potencjału immunomodulacyjnego biomateriałów in vitro14,15. Badanie to miało na celu opracowanie protokołu in vitro, który można zastosować do zbadania polaryzacji MDM w odpowiedzi na różne powierzchnie implantów. Analizy ekspresji genów, techniki mikroskopowe i ELISA mogą być wykorzystywane do określania markerów fenotypowych i specyficznych profili cytokin makrofagów M1 i M2 modulowanych przez biomateriał. W związku z tym można wyjaśnić złożone interakcje między makrofagami a powierzchniami biomateriałów i uzyskać cenne informacje, aby lepiej zrozumieć interakcje makrofagów z biomateriałami. Wreszcie, ustandaryzowany protokół in vitro zapewnia odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych poprzez minimalizację zmienności w konfiguracji eksperymentalnej.

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa, niepoddawana obróbce</td><td>Corning Incorporated (Kennebunk, USA)&nbsp;</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik absorbancji Infinite F50&nbsp;</td><td>TECAN Austria GmbH (Gr&ouml; dig, Austria)</td><td>TCAT91000001</td><td></td></tr><tr><td>Accutase w DPBS, 0,5 mM EDTA</td><td>EMD Millipore Corp. (Burlington, USA)</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade Fluorescencyjny środek montażowy -wodny, Fluoroshield</td><td>abcam (Cambridge, Wielka Brytania)</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad / MJ Research</td><td>7212</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR International bvba (Leuven, Belgia)</td><td>Wirówka 422361V</td><td></td></tr><tr><td>5804 R</td><td>Eppendorf SE (Hamburg, Niemcy)</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13193</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 Roztwór barwiący</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)</td><td>130-117-344</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy &ge; 99,8% dla biologii molekularnej</td><td>Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>1HPH.1</td><td></td></tr><tr><td>Kozia IgG Anty-Mysia (H& L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej , Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723TR</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, cyjanina3</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Wersja GraphPad</td><td>&nbsp; 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało CCR7</td><td>R& D Systems</td><td>MAB197</td><td></td></tr><tr><td>Human IFN-gamma Recombinant</td><td>Invitrogen (Rockford, USA)</td><td>RIFNG100</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-13</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)</td><td>5230901032</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-4</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)</td><td>130-095-373</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Peprotech (Cranbury, USA)</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Niemcy)</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/</td><td></td></tr> <tr><td>Lipopolisacharydy firmy Escherichia</td><td>Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA)</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Luna Universal qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>NEB #M3003</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010L</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów 1077</td><td>PromoCell (Heidelberg, Niemcy)</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MCP-4/CCL13 Zestaw ELISA dla ludzi</td><td>Invitrogen</td><td>EHCCL13</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml</td><td>)Applied Biosystems (Waltham, USA)</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA)</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash Free 96-well Base</td><td>Applied Biosystems (Waltham, USA)</td><td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka mikrolitrowa CD-3124R</td><td>Phoenix Instrument (Niemcy)</td><td>9013111121</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu, 10 mm</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>4HX4.1</td><td></td></tr><tr><td>Monocyte Attachment Medium</td><td>PromoCell (Heidelberg, Niemcy)</td><td>C-28051</td><td></td></tr><tr><td>Multiply-Pro Gef&auml; &szlig; 0,5 ml, PP</td><td>Sarstedt AG & Eco (N&uuml; mbrecht, Niemcy)</td><td>7,27,35,100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific (USA)</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio&nbsp; 3 System</td><td>Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Niemcy)</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74007</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1x, z L-glutaminą</td><td>Mediatech, Inc. (Manassas, USA)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna ławka, LaminarAir HB 2472&nbsp;</td><td>Instrumenty Heraeus (Hanau, Niemcy)</td><td>51012197</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do hodowli tkankowych 13 mm (tworzywo sztuczne)</td><td>Sarstedt Inc. (Newton, USA)</td><td>83,18,40,002</td><td></td></tr><tr><td>Tarcze obrabiane tytanem 12 cm&nbsp;</td><td>Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Niemcy)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TNF alfa Human ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>KHC3011</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>1680.1</td><td></td></tr></tbody></table>

polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu m1 i m2 na powierzchniach implantów

Polarization and Characterization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Macrophages on Implant Surfaces

Reakcja ciała obcego (FBR), złożony proces gojenia za pośrednictwem układu immunologicznego, odgrywa kluczową rolę w integracji implantów z ciałem. Makrofagi, jako pierwsza linia interakcji układu odpornościowego z powierzchniami implantów, odgrywają dwukierunkową rolę w modulowaniu równowagi między stanem zapalnym a regeneracją. Dla dogłębnego zrozumienia i oceny reakcji między materiałami implantów a odpowiedzią immunologiczną kluczowe znaczenie mają wiarygodne metody i protokoły in vitro. Wśród różnych modeli in vitro, pierwotne makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) stanowią doskonały model do badania interakcji makrofag-implant. Wdrożyliśmy eksperymentalny protokół oceny polaryzacji MDM na makrofagi M1 (aktywowane klasycznie aktywowane) i M2 (aktywowane alternatywnie) na powierzchniach implantów. Wyizolowaliśmy monocyty krwi od zdrowych dawców i zróżnicowaliśmy je w makrofagi za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Zróżnicowane makrofagi wyhodowano na powierzchniach implantów i spolaryzowano na podtypy M1 i M2. Polaryzację M1 uzyskano w obecności interferonu (IFN)-γ i lipopolisacharydu (LPS), natomiast polaryzację M2 przeprowadzono w pożywce zawierającej interleukinę (IL)-4 i IL-13. Oceniliśmy fenotypy makrofagów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w oparciu o panele wydzielanych cytokin, markery powierzchni komórek i ekspresję genów. Wyekstrahowany RNA przekształcono w komplementarne DNA (cDNA), a qRT-PCR użyto do ilościowego określenia mRNA związanego z makrofagami M1 i M2. W związku z tym makrofagi M1 charakteryzowały się wyższą ekspresją cytokin prozapalnego czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) i markera powierzchniowego CCR7 w porównaniu z makrofagami M2, które wykazywały wyższe poziomy CD209 i CCL13. W związku z tym CCR7 i CD209 zostały zidentyfikowane jako specyficzne i wiarygodne markery podtypów makrofagów M1 i M2 poprzez barwienie immunologiczne i wizualizację za pomocą CLSM. Dalsze potwierdzenie uzyskano za pomocą testu ELISA, który wykrył podwyższony poziom TNF-ɑ w M1 i zwiększony CCL13 w komórkach M2. Proponowane markery i konfiguracja eksperymentalna mogą być skutecznie wykorzystane do oceny potencjału immunomodulacyjnego implantów.

Wyniki niniejszego badania wykazują pomyślną różnicowanie i polaryzację MDM na powierzchniach tytanowych, a następnie charakterystykę makrofagów spolaryzowanych do fenotypu M1 lub M2. W pierwszym kroku scharakteryzowano spolaryzowane MDM przy użyciu CLSM. W oparciu o nasze wstępne badania, jako specyficzne markery do odróżnienia spolaryzowanych MDM typu M1 od M2 wykorzystano CD209 oraz CCR7. Jak pokazano na Rysunku 2A,B, MDM uległy pomyślnej polaryzacji do makrofagów M1 i M2. Na powierzchni tytanowej CCR7 był wyrażany silniej w makrofagach spolaryzowanych do M1 niż CD209, który był wyrażany specyficznie w makrofagach spolaryzowanych do M2. Ponadto ilościowe oznaczenie względnej intensywności fluorescencji ułatwiło przypisanie markerów do podtypów M1 lub M2 (Rysunek 2C).
Rysunek 3 przedstawia reprezentatywną analizę qRT-PCR makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) na powierzchniach tytanowych i szkiełek podstawowych. Wyniki wykazały, że MDM na obu powierzchniach zostały pomyślnie spolaryzowane, o czym świadczy wysoka ekspresja markerów polaryzacji M1 (CCR7 i TNF-ɑ) oraz M2 (CD209 i CCL13). Zostało to dodatkowo potwierdzone na poziomie białek poprzez zaobserwowanie wysokich poziomów prozapalnych cytokin TNF-α (Rysunek 4A) oraz chemokin IL-13 (Rysunek 4B) odpowiednio w komórkach spolaryzowanych do fenotypu M1 i M2.
<img alt="Proces polaryzacji makrofagów z PBMC przedstawiony na schemacie; obejmuje ELISA, CLSM, qRT-PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Panel mikroskopii fluorescencyjnej markerów CCR7 i CD209; analiza słupkowa i wykresowa poziomów ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka spolaryzowanych MDM z użyciem CLSM. Wzbogacenie makrofagów spolaryzowanych do fenotypów M1 i M2 potwierdzono za pomocą barwienia swoistymi przeciwciałami oraz analizy CLSM z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko CCR7 i CD209 w 2. dniu po wysianiu. Na podstawie barwienia fluorescencyjnego i analizy CLSM przy powiększeniu (A) 25x oraz (B) 63x, komórki M1 wykazywały wyższą ekspresję CCR7 (na zielono) niż komórki M0 lub M2. Komórki M2 wykazują znaczący wzorzec ekspresji CD209 (na zielono). (C) Analiza ilościowa względnej intensywności fluorescencji CCR7 i CD209. Jądra komórkowe zabarwiono DRAQ5 (na fioletowo). Wyniki są reprezentatywne dla 5 podobnych eksperymentów przeprowadzonych niezależnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji genów M0, M1, M2 na powierzchniach szkiełka nakrywkowego i obrabianych tytanowo; TNF-α, CCR7, CD209, CCL13." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka spolaryzowanych MDM za pomocą profili ekspresji genów. Ilościwa reakcja polimerazy w odwrotnej transkrypcji została wykorzystana do zbadania poziomów mRNA różnych genów związanych z polaryzacją M1 (CCR7 i TNF-ɑ) oraz M2 (CD209 i CCL13). GAPDH został użyty jako gen referencyjny. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie sekrecji TNF-α i CCL13; wykres słupkowy przedstawiający poziomy cytokin na szkiełkach podstawkowych i tytanie obrabianym mechanicznie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Produkcja cytokin przez makrofagi M0, M1 i M2 hodowane na tytanie oraz plastikowych szkiełkach podstawkowych. (A) Poziom cytokiny TNF-ɑ oraz (B) poziom CCL13 w supernatantach hodowli komórkowych zmierzono metodą ELISA. Sekrecję cytokin znormalizowano do całkowitej sekrecji białek zmierzonej metodą BCA. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią ± SEM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bufor/roztwór</td>
			<td>Skład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do barwienia/blokowania</td>
			<td>PBS + 1% BSA + 0.1% Tween 20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do płukania</td>
			<td>PBS + 0.1% Tween 20 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do fiksacji</td>
			<td>3% Paraformaldehydu (PFA) w PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do przechowywania</td>
			<td>1% penicyliny i streptomycyny w PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista buforów.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa startera</td>
			<td>Sekwencje starterów forward</td>
			<td>Sekwencje starterów rewersyjnych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>5´-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3´</td>
			<td>5´-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3´</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCR7</td>
			<td>5'- TGGTGATCGGCTTTCTGGTC-3'</td>
			<td>5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209</td>
			<td>5'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3' </td>
			<td>5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCL13</td>
			<td>5´-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3´</td>
			<td>5´-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3´</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-ɑ</td>
			<td>5´- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3´</td>
			<td>5´- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3´</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Sekwencje starterów użytych w qRT-PCR.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Foreign body reaction (FBR), an immune-mediated complex healing process, plays a crucial role in integrating implants into the body. Macrophages, as the ...

Głównym celem tej procedury jest wdrożenie kompleksowego protokołu hodowli i charakterystyki mikrofagów na różnych powierzchniach implantów oraz charakterystyka podtypów mikrofagów. W ramach tej charakterystyki stosuje się kilka metod, w tym qRT-PCR, EISA i CLSM, w celu określenia profili ekspresji genów, białek wydzielniczych i markerów powierzchni komórki. Wyniki wskazują na użyteczność i skuteczność wdrożonego protokołu w polaryzacji mikrofagów i powierzchni implantów oraz dokładnej ich identyfikacji na podstawie ekspresji genów, wydzielanych białek i markerów powierzchni komórek.Co więcej, markery opisują spójne i specyficzne wzorce ekspresji, które można wykorzystać do rozróżnienia różnych podtypów MDM. Ogólnie rzecz biorąc, badanie przyczyni się do opracowania i zaprojektowania materiałów immunomodulujących w celu poprawy i promowania skutecznych procesów regeneracji tkanek, zapobiegania przewlekłym stanom zapalnym związanym z implantami oraz zwiększenia udanej integracji implantów. Na początek ponownie zawieś izolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej w 15 mililitrach wstępnie podgrzanej pożywki przyłączeniowej monocytów i przenieś je do kolby do hodowli komórek T-75.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 90 minut w celu uzyskania adhezji. Po inkubacji odrzucić supernatant i raz przemyć komórki wstępnie podgrzanym podłożem RPMI 1640, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny, delikatnie przechylając kolbę w celu usunięcia nieprzylegających lub luźno przylegających komórek. Dodaj 15 mililitrów kompletnej pożywki zawierającej 10 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów do przylegających komórek.I inkubuj przez sześć dni, aby promować różnicowanie. Po różnicowaniu wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby i przemywać komórki 10 mililitrami PBS przez pięć minut. Aby odłączyć przylegające komórki, dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek i inkubuj przez 30 minut.Następnie delikatnie postukaj w kolbę, aby uwolnić komórki i przenieś je do 50-mililitrowej probówki. Aby odłączyć pozostałe komórki, dodaj 10 mililitrów PBS do kolby i zezłomuj komórki. Przenieś odłączone komórki do 50-mililitrowej tuby.Odwirować zawiesinę oddzielonych komórek o masie 300 g przez 10 minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża. Używając barwienia błękitem trypanowym, policz komórki na hemocytometrze, aby określić liczbę komórek i żywotność. Przygotuj zawiesinę komórek, dostosowując liczbę komórek do 160 000 komórek na jeden mililitr kompletnego podłoża.Następnie wyczyść krążki biomateriału ultradźwiękowo w 70% etanolu przez pięć minut, a następnie sterylizuj w 70% etanolu przez 30 minut. Po wysuszeniu tytanowych krążków umieść je na niepoddanej obróbce 24-dołkowej płytce i dodaj jeden mililitr przygotowanej zawiesiny komórek do każdego dołka. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby uzyskać makrofagi M0.Aby uzyskać spolaryzowane makrofagi M1, dodaj interferon gamma i lipopolisacharyd do dołków 24-dołkowej płytki. W przypadku polaryzacji M2 dodaj interleukinę-4 i interleukinę-13. Inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby wywołać polaryzację.Po uzyskaniu spolaryzowanych makrofagów pochodzących z monocytów z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, zbierz supernatant komórkowy w 1,5-mililitrowej probówce. Przenieś tytanową tarczę do nowej płytki 24-dołkowej. Odwirować supernatant komórkowy o masie 300 g przez pięć minut i przenieść supernatant do nowej probówki.Zmierz cytokiny i chemokiny na głębokości 450 nanometrów zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Obliczyć stężenie wydzielanych cytokin lub chemokin za pomocą krzywej wzorcowej. Zmierz całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka kwasu bicinchoninowego.Normalizuj stężenie wydzielanych białek do miligramów białka całkowitego. Umyj spolaryzowane makrofagi dwukrotnie w 800 mikrolitrach PBS. Inkubować krążki w 400 mikrolitrach buforu utrwalającego przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po usunięciu buforu utrwalającego należy trzykrotnie umyć krążki w 400 mikrolitrach PBS. Teraz inkubuj dyski z 400 mikrolitrami bufora blokującego przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Odrzucić bufor blokujący i inkubować krążki przez jedną godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 400 mikrolitrach buforu barwiącego.Po godzinie usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i trzykrotnie przemyć krążki 400 mikrolitrami buforu do mycia. Dodać fluor do znakowanych przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w buforze barwiącym i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w buforze do przemywania przez trzy minuty każda.Dodaj 10 milimolowych DRAQ5 do PBS i inkubuj przez 15 minut w ciemności. Następnie usunąć supernatant i raz umyć krążki PBS. Dodać jedną kroplę podłoża montażowego, a po pięciu minutach nałożyć szkła nakrywkowe i pozostawić próbki do wyschnięcia na godzinę.Po wyschnięciu uszczelnij krawędzie bezbarwnym lakierem do paznokci. Aby uzyskać przegląd komórek, zobrazuj próbki pod konfokalnym mikroskopem skaningowym laserowym pod 25-krotnym powiększeniem. Zmień powiększenie na 63X, aby określić strukturę i lokalizację znaczników powierzchni.Pierwotne makrofagi pochodzące z monocytów zostały z powodzeniem spolaryzowane do makrofagów M1 i M2 na powierzchniach tytanu, przy czym CCR7 był silniej eksprymowany w makrofagach M1, a CD209 w makrofagach M2. Analiza qRT-PCR wykazała pomyślną polaryzację pierwotnych makrofagów pochodzących z monocytów zarówno na powierzchniach tytanu, jak i szkiełek nakrywkowych z wysoką ekspresją CCR7 i TNF-alfa dla M1 oraz CD209 i CCL13 dla M2. Wysoki poziom zapalnej cytokiny TNF-alfa i chemokiny CCL13 potwierdził polaryzację M1 i M2 na poziomie białka.

polarization-characterization-m1-m2-human-monocyte-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Polaryzacja i charakterystyka makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów M1 i M2 na powierzchniach implantów 

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów w komórki podobne do makrofagów

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Ten protokół dostarcza metodę badania zakażenia Mycobacterium tuberculosis w ludzkich makrofagach spolaryzowanych M1 lub M2 w oparciu o różnicowanie monocytów krwi obwodowej do komórek podobnych do makrofagów, które są zakażone znakowanym przez GFP wirulentnym szczepem H37Rv, i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 10-kolorowego panelu, w tym ekspresji wybranych markerów M1/M2.

Polaryzacja ludzkich komórek pochodzących z monocytów M1 i M2 oraz analiza za pomocą cytometrii przepływowej po zakażeniu Mycobacterium tuberculosis

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Poznaj protokół polaryzacji makrofagów M1 i M2 pochodzących z ludzkich monocytów na powierzchniach tytanowych. Metoda wykorzystuje qRT-PCR, ELISA i CLSM do analizy markerów powierzchniowych i profili cytokinowych.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Przeglądaj więcej filmów