Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Oddychanie mitochondrialne jest głównym generatorem energii komórkowej w większości przypadków oraz ważnym wskaźnikiem metabolizmu komórkowego i sprawności. W ten sposób funkcje mitochondrialne wyznaczają bioenergetyczny stan komórkowy. Protokół ten opisuje technikę ilościowego określania oddychania mitochondrialnego w żywych komórkach G jako parametru bioenergetycznego.

Technika opisana w tym protokole pomaga nam zdefiniować mechanizm bioenergetyczny niektórych polifenoli, takich jak resweratrol i koircyten. Służy również jako narzędzie do pomiaru metabolizmu pentozy, również PTSPT i wyjaśnia zmiany bioenergetyczne za drzewem kabinowym i efekty pracy u ziemi. Jesteśmy zainteresowani rozszyfrowaniem, w jaki sposób komórki nabywają niektóre fenotypy, takie jak drzewo cab i efekty pracy naziemnej, ze znaczącymi zmianami w bioenergetyce komórkowej.

Oddychanie mitochondrialne jest niezbędnym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych stojących za tym zjawiskiem metabolicznym. Na początek zaszczep 10-mililitrową, szklaną probówkę zawierającą trzy mililitry pożywki YPD 250 mikrolitrami komórek drożdży zakonserwowanych glicerolem. Inkubować probówkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem przy 200 obrotach na minutę.

Następnie, za pomocą sterylnej pętli, przetrzyj płytkę ślimakową YPD komórkami drożdży wyhodowanymi w 10-mililitrowej szklanej probówce. Inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się izolowane kolonie. Aby przygotować pre-inokulum, zaszczepić trzy mililitry pożywki YPD o stężeniu 2% glukozy dwoma lub trzema izolowanymi koloniami drożdży i inkubować.

Następnie uzyskać 100 mililitrów sterylnej syntetycznej kompletnej pożywki w 500-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Zaszczepić pożywkę nocną kulturą drożdży pre-inokulum o początkowej gęstości optycznej 0,1 przy 600 nanometrach. Dodaj wyzwanie chemiczne, takie jak 100 mikromolowy resweratrol, aby przetestować oddychanie mitochondrialne.

Następnie wlej komórki środkowej fazy logarytmicznej do pustej, wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj komórki w temperaturze 4 000 G przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad trzykrotnie 25 mililitrami wody dejonizowanej. Zważyć stożkową probówkę zawierającą przemyty osad, aby uzyskać mokrą masę, odejmując wagę pustej probówki.

Następnie ponownie zawiesić umyty granulat w dwóch mililitrach wody dejonizowanej. Na początek pobierz komórki drożdży leczone odpowiednimi lekami, takimi jak resweratrol. Umieść pięć mililitrów 10-milimolowego buforu MES-TEA i 50 miligramów mokrych komórek w komorze polarnej przeszczepu.

Delikatnie ustaw elektrodę tlenową typu Clark, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Włącz monitor YSI 5300A i komputer do akwizycji danych. Wybierz pokrętło ustawień kanału pierwszego na powietrze i dostosuj kanał pierwszy do 100% za pomocą pokrętła kalibracji kanału pierwszego.

Rozpocznij rejestrowanie danych i rozpocznij pomiar czasu za pomocą chronometru. Za pomocą strzykawki chromatograficznej dodać utleniający się substrat do końcowego stężenia 10 milimoli i utrzymywać komorę zamkniętą przy ciągłym mieszaniu. Następnie, za pomocą strzykawki chromatograficznej, dodać oligo mycynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 milimola w komorze pulsoksymetru i zarejestrować procentowe zużycie powietrza.

Podobnie, dodać CCCP do końcowego stężenia 0,015 milimola w komorze pulsoksymetru, aby określić maksymalną zdolność oddychania. Następnie dodaj inhibitory łańcucha transportu elektronów, triflurozyton zębów i oleju lub TTFA w jednym milimolu, a następnie antymycynę A w jednym miligramie na mililitr. Umyj komorę trzy razy 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną, zanim przejdziesz do następnego źródła węgla.

Na początek wykonaj test zużycia tlenu na komórkach drożdży, używając różnych źródeł węgla i kontroli. Utwórz nowy plik projektu w oprogramowaniu statystycznym i wybierz XY w sekcji tworzenia. Następnie wybierz Enter lub zaimportuj dane do nowej tabeli w sekcji tabeli danych.

W sekcji opcji wybierz liczby w podsekcji X i w podsekcji Y. Kliknij pozycję Wprowadź trzy wartości replikacji w kolumnach podrzędnych obok siebie. Wprowadź dane dotyczące czasu w kolumnach X i wprowadź dane procentowe powietrza w kolumnach Y.

Aby przeprowadzić analizę regresji liniowej, kliknij przycisk Analizuj na pasku menu, a następnie w obszarze Analiza wybierz opcję Prosta regresja liniowa w analizie XY, a następnie kliknij przycisk OK. Uzyskaj wartość nachylenia z sekcji wyników w tabelach danych. Skopiuj obliczone wartości nachylenia do arkusza danych.

Odejmij wartość nachylenia uzyskaną z mieszanki inhibitorów układu oddechowego Mix od wartości utlenionego substratu, oligomycyny i CCCP, aby odrzucić inne źródła zużycia tlenu. Teraz pomnóż wartości nachylenia przez 237 mikromoli tlenu, co oznacza rozpuszczalność tlenu w tym stanie, i buforuj. Przelicz wartości na mikromole tlenu na minutę, dostosowując je zgodnie z czasem na wykresie.

Podziel wyniki przez 50, reprezentując miligramy komórek użytych w eksperymencie. Wreszcie zużycie tlenu jest wyrażone w mikromolach tlenu na miligram komórek na minutę. Komórki wyhodowane w 0,5% glukozy wykazywały znacznie wyższe zużycie tlenu w oddychaniu podstawowym, oddychaniu związanym z ATP i maksymalnej pojemności oddechowej w porównaniu z komórkami hodowanymi w 5% glukozy.

Kwercetyna znacznie zmniejszała oddychanie mitochondrialne w komórkach hodowanych z 0,5% glukozy, wpływając na oddychanie podstawowe, związane z ATP i maksymalne. Z drugiej strony, kwercetyna nie wpłynęła znacząco na oddychanie mitochondrialne w komórkach hodowanych w 5% glukozy.