Name: Zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji precyzyjnie krojonych plastrów wątroby (PCLS) z mysich wątrób przy użyciu vibratomu. Technika zapewnia przetrwanie tkanek przez minimum cztery dni, zachowując architekturę i funkcje metaboliczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Mirabeli Bandol, Samancie Richards, Louise Fisher, Rebecce Towns i personelowi UCL Biological Services za pomoc w hodowli i utrzymaniu kolonii zwierząt. Prace te były finansowane przez United Kingdom Medical Research Council Clinician Scientist Fellowship MR/T008024/1 (JB) oraz NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (JB). Wyrażone poglądy są poglądami autora (autorów), a niekoniecznie poglądami NHS lub NIHR.

Myszy CD57Bl/6J typu dzikiego zostały zakupione w Charles River Laboratories. Myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody, trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach z kontrolowanymi warunkami temperatury i wilgotności oraz z 12-godzinnym cyklem świetlnym. Zwierzęta w wieku 3 tygodni były uśmiercane, a wątroby były natychmiast zbierane bez perfuzji. Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone po lokalnej ocenie etycznej przeprowadzonej przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Uniwersytetu College London i wykonane na podstawie licencji projektowej Ministerstwa Spraw Wewnętrznych PP9223137 oraz zgodnie z ustawą o procedurach naukowych Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Zwierzęta) (1986) i wytycznymi ARRIVE. Dołożono wszelkich starań, aby ograniczyć krzywdę wyrządzaną zwierzętom zgodnie ze standardową praktyką w Zakładzie Usług Biologicznych na University College London.
1. Przygotuj się do eksperymentu
<ol>
	<li>Dzień przed zbiorami wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l buforu Krebs-Henseleit (KREBS), rozpuszczając jedną fiolkę z proszkiem Krebs w 1 litrze jałowej wody. Schłodzić do 4 °C i przechowywać na mokrym lodzie.</li>
		<li>Zdezynfekuj tackę 70% etanolem i spłucz sterylnym PBS. Przechowuj tacę zawiniętą w folię aluminiową w lodówce przez noc, aby utrzymać zimne środowisko podczas krojenia.</li>
		<li>Spryskaj wszystkie inne zdejmowane części etanolem, spłucz sterylnym PBS, pozostaw do wyschnięcia i utrzymuj je w sterylności. Autoklaw ostrzy i utrzymuj je w sterylności do momentu użycia.</li>
		<li>Przygotuj 4% w/v niskotopliwej agarozy w sterylnej wodzie. Po ponownym zawieszeniu i stopieniu agarozę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu zbioru i przed zbiorem wątroby wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Rozpuść 4% niskotopliwą agarozę i przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do czasu użycia. Przed użyciem upewnij się, że agaroza ostygła do 37 °C i że wszystkie pęcherzyki rozproszyły się.</li>
		<li>Przygotuj płytki hodowlane, dodając odpowiednio 2,6 ml, 1,5 ml i 0,7 ml na studzienkę do płytek 6-, 12- i 24-dołkowych. Dodaj 8 μm porowatych wkładek do każdego dołka. Umieść płytki w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 °C, 5% poziom CO2 i 21% O2 . Pomoże to dostosować pH podczas podgrzewania podłoża, aby było gotowe do hodowli.</li>
		<li>Hoduj plastry za pomocą porowatych wkładek o grubości 8 μm, aby umożliwić dostęp do obu stron plasterka. Przygotuj pożywkę w następujący sposób: Dodaj do William's Medium E (WME), 2 mM suplementu L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 10 μg/ml genttamycyny, 25 mM roztworu D-glukozy i 15 mM roztworu HEPES.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobranie wątroby i przygotowanie (15 min)
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zbiorem.</li>
	<li>Znieczulić mysz zgodnie z lokalnymi procedurami opieki nad zwierzętami do celów naukowych za pomocą maski izofluranowej. Przed otwarciem jamy brzusznej ściśnij między palcami, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Jeśli wątroba może zostać szybko usunięta, mysz może zostać uśpiona przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy. Ponieważ zabieg jest zabiegiem terminalnym, nie należy stosować maści do oczu, ponieważ nie wpłynie to na zwierzę.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem. Opcjonalnie: Ogol mysz, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną sterylnymi kleszczami i nożyczkami, przecinając skórę i otrzewną od środka brzucha. Delikatnie odetnij wątrobę od innych narządów lub naczyń i unikaj uszkodzenia płatów.</li>
	<li>Całą wątrobę należy natychmiast przechowywać w lodowatym buforze Krebsa. Wykonać wszystkie dalsze czynności na lodzie w temperaturze 4 °C i przystąpić do przygotowania wątroby tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec dalszej śmierci komórek.</li>
</ol>
3. Osadzanie płatów wątroby (25 minut dla każdego płata wątroby)
<ol>
	<li>Przenieś wątrobę na szalkę Petriego na lodzie zawierającą lodowaty bufor Krebsa, upewniając się, że cała wątroba jest całkowicie zanurzona.</li>
	<li>Oddziel każdy płat osobno za pomocą kleszczy i ostrego, sterylnego noża, aby uniknąć uszkodzenia płatów.</li>
	<li>Wybierz pierwszy płat do przekrojenia i trzymaj pozostałe płaty w lodowatym buforze Krebsa, aż będą gotowe do osadzenia i pokrojenia.</li>
	<li>Wytnij wszystkie krawędzie, aby uzyskać łatwiejszy w obsłudze płat z prostymi krawędziami gotowymi do osadzenia. Pomoże to również usunąć część włóknistej torebki Glissona, aby jeszcze bardziej ułatwić cięcie. Zrób to, utrzymując mokre powierzchnie wątroby w lodowatym buforze Krebsa.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego o średnicy 3 cm (lub podobną) na mokrym lodzie i wlać do niej 4% niskotopliwej agarozy (znajdującej się już w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C). Trzymaj dobrze na lodzie, aby agaroza ostygła w kierunku do góry, jednocześnie zapobiegając opadaniu płata na dno i równomiernemu osadzaniu go.</li>
	<li>Pozostaw agarozę do dalszego ostygnięcia na 30 s i umieść w niej przycięty płat. Płat osiądzie pośrodku bloku agarozy. Proces osadzania wymaga praktyki i optymalizacji, aby dopasować się do każdych warunków laboratoryjnych i osobistego doświadczenia.</li>
	<li>Osadzony płatek, jeszcze na lodzie, wstawiamy do lodówki na 5 minut. Agaroza powinna być wtedy wyraźnie zastygła.</li>
	<li>Odetnij zewnętrzną stronę bloku agarozy. Usuń blok agarozy z naczynia.</li>
	<li>Pokrój agarozę do łatwiejszego do opanowania rozmiaru, upewniając się, że górna strona i strona przyklejona do platformy wibratomu są równoległe do górnej krawędzi płata.</li>
	<li>Rozpocznij proces krojenia tak szybko, jak to możliwe, ale upewnij się, że blok agarozy jest przechowywany w lodowatym buforze Krebsa i na lodzie.</li>
</ol>
4. Produkcja plastrów wątroby (40 min na płat)
<ol>
	<li>Ustaw wibratom do cięcia na grubość 250 μm, z prędkością 5 i częstotliwością 7 Hz. Są to parametry przewodnie; W zależności od rodzaju użytego wibratomu może to wymagać optymalizacji.</li>
	<li>Przed cięciem spryskaj wibratom i obszary stołu 70% etanolem, aby środowisko było jak najbardziej sterylne.</li>
	<li>Umieść tackę na wibratomie i wlej wokół niej lód. Umieść ostrza na wibratomie pod kątem 10° w dół i poniżej poziomu.</li>
	<li>Napełnij zbiornik wibratomu lodowatym buforem Krebsa. Umieść cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na platformie.</li>
	<li>Osusz krawędź bloku agarozy, który zostanie przyklejony do platformy, za pomocą sterylnej chusteczki chłonnej.</li>
	<li>Umieść blok agarozy na zdejmowanej platformie. Ustaw płat pionowo, aby umożliwić jego poprzeczne przecięcie. Chociaż rozmiar plastrów jest zmniejszony, drastycznie ułatwia to proces cięcia, ograniczając nacisk na płat podczas cięcia.</li>
	<li>Odczekaj 1 minutę, aż klej stwardnieje i zanurz zdejmowaną platformę w zbiorniku i upewnij się, że blok agarozy jest całkowicie pokryty buforem Krebsa.</li>
	<li>Zaprogramuj wibratom do cięcia, ustawiając pozycje start i stop. Zacznij początkowo kroić grubsze plastry, aż dojdziesz do płata wątroby.</li>
	<li>Wyrzuć pierwszy plasterek, ponieważ może nie zostać przycięty do odpowiedniej grubości. Aby uniknąć uszkodzenia plastrów, użyj szpatułki do zebrania plastrów wątroby zamiast kleszczy lub szczotek. 
	UWAGA: Mała szczoteczka zdezynfekowana 70% etanolem i spłukana sterylnym PBS może być również używana do delikatnego prowadzenia tkanki podczas procesu cięcia.</li>
	<li>Powtarzaj proces, aż zostanie osiągnięta wymagana liczba plasterków. Płat może od czasu do czasu odsunąć się od agarozy, uniemożliwiając dalsze użycie. Zbierz plastry do lodowatego bufora Krebsa, aż do uzyskania kultury.</li>
</ol>
5. Inkubacja plastrów wątroby
<ol>
	<li>Przenieś plastry za pomocą szpatułki do przygotowanych dołków zawierających podłoże i wkładki.</li>
	<li>Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej, ustawić prędkość na 130 obr./min i inkubować w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C. Ostateczna objętość kultury wynosi 2,6 ml, 1,5 ml i 0,7 ml na dołek odpowiednio na płytkach 6-, 12- i 24-dołkowych.</li>
	<li>Umieścić jedną pustą płytkę poniżej płytki hodowlanej zawierającej plastry w kulturze, aby umożliwić rozproszenie nadmiaru ciepła pochodzącego z platformy wytrząsarki. Zmieniaj podłoże co 48 godzin.</li>
</ol>
6. Test przeżycia komórek
<ol>
	<li>Przenieść plastry do 48-dołkowej płytki zawierającej 400 μl wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki Williamsa Medium E i dodać 80 μl odczynnika MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium) odczynnika tetrazolowego.</li>
	<li>Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na wytrząsarce, przenieść 200 μl pożywki na płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika płytek wielodołkowych. Plastry pozostawione na stole w PBS i w temperaturze pokojowej przez 24 godziny należy wykorzystać jako kontrole ujemne.</li>
</ol>
7. Barwienie histologiczne
<ol>
	<li>Odparafinować i ponownie uwodnić skrawki za pomocą ksylenu i etanolu, a następnie wody dejonizowanej. Skrawki barwić roztworem Hematoxyliny przez 3 min.</li>
	<li>Płukać wodą dejonizowaną przez 5 min. Szybko zanurzyć 10x w kwaśnym etanolu (1 ml stężonego HCL i 400 ml 70% etanolu).</li>
	<li>Spłucz 2x do wody dejonizowanej i osusz nadmiar wody. Zanurz sekcje w Eozynie na 30 sekund.</li>
	<li>Odwodnić do 95% etanolu, a następnie 100% etanolu przez 5 minut, po 3 razy. Zanurz sekcje w ksylenie 3x na 15 minut każda. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.</li>
</ol>

Standardized Protocol for Culturing Liver Slices in Basic Laboratory Settings

Nie ma żadnego konkurencyjnego interesu, który mógłby zostać ujawniony.

Wykazaliśmy, że wytwarzanie i hodowla PCLS może być łatwo osiągnięta przy jednoczesnym zapewnieniu okresu półtrwania wynoszącego co najmniej 4 dni. Protokół ten podsumowuje pięć krytycznych kroków: metodę osadzania, jeśli używany jest ten rodzaj wibratomu, orientację cięcia, dynamiczny system hodowli, minimalną objętość kultury i użycie wkładek.
Protokoły dotyczące produkcji i hodowli PCLS są powszechnie dostępne. Brakuje im jednak standaryzacji; Mogą koncentrować się na podobnych i konkretnych punktach protokołu, ale mogą być trudne do odtworzenia w prosty sposób lub w większości laboratoriów, które mają dostęp do podstawowego wibratomu. Rodzaje wibratomii lub krajalnic do tkanek są szerokie. Będą się różnić kosztem i specyfiką techniczną, taką jak zintegrowany system chłodzenia lub nie, ale ich wspólną cechą jest system cięcia za pomocą oscylującej żyletki. Główną różnicą w odniesieniu do krojenia tkanek jest wymóg zatapiania. Z oczywistych względów i wpływu osadzania na rentowność, najlepiej byłoby tego unikać. Jednym z przykładów fragmentatora referencyjnego, który nie wymaga osadzania, jest fragmentator Krumdieck35. Ten typ krajalnicy umożliwia cięcie tkanki w schłodzonym buforze przy użyciu rdzenia, tworząc równomierne plastry bez zatapiania. Jednak takie urządzenie jest zwykle droższe niż bardziej podstawowe wibratory i rzadziej używane lub dostępne w większości laboratoriów. Wibratomy, takie jak ten stosowany w tym protokole, są zwykle dostępne do cięcia chemicznie utrwalonych tkanek, ale będą wymagały osadzenia płatów wątroby. Niektórzy wykazali, że krojenie plastrów wątroby można osiągnąć bez osadzania i używania podobnego wibratomu1; Jednak z naszego doświadczenia wynika, że jest to trudne do odtworzenia. Ponadto, podczas stosowania tego rodzaju wibratomu, krojenie wątroby bez podtrzymującego 3D żelu agarozowego powoduje uszkodzenie plastrów i nierówną grubość, a tym samym zwiększa śmierć komórek. Protokół ten polega na przecięciu płata wątroby poprzecznie, a nie strzałkowo. Etap cięcia jest trudną techniką do opanowania, a według naszej wiedzy orientacja cięcia jest ważnym szczegółem, na którym nigdy się nie skupiamy. Orientacja płata podczas cięcia może drastycznie ułatwić proces cięcia, jednocześnie zmniejszając nacisk na wątrobę. Stosowanie hydrożelu można również uznać za poprawę korzyści36.
Kolejnym ważnym kryterium jest potrzeba większych ilości upraw w celu zwiększenia żywotności. Już zasugerowano, że większe ilości dostarczają więcej składników odżywczych i rozcieńczają bardziej toksyczne produkty zawierające kwasy żółciowe37. Dodanie dynamicznego systemu z wytrząsaniem i w połączeniu z użyciem Transwells poprawia dostęp do składników odżywczych i potencjalnie tlenu do obu powierzchni sekcji, tworząc stały przepływ 18,38,39. Zastosowanie transwella i zaleta systemu dynamicznego zostały już udowodnione w różnych kontekstach, takich jak reakcje na wycinki wątroby u człowieka28 oraz w modelowaniu zwłóknienia26,27. Protokół ten potwierdza ich przewagę w szerszym aspekcie fizjologicznym.
Pożywka E Williamsa jest powszechnie wybierana jako standardowa pożywka do hodowli komórkowych dla PCLS40,41. Opisano pożywki z glukozą i surowicą, które mogą przynieść korzyści w zachowaniu żywotności i funkcjonalności plastrów42. Stężenie glukozy w pożywkach zwykle waha się od 4 nM do 36 nM 43,44, ale nie znaleziono konsensusu co do wpływu wyższego stężenia glukozy na żywotność lub odpowiedź oksydacyjną. Twierdzi się, że dodanie insuliny lub deksametazonu35 poprawia długoterminową żywotność, ale nie osiągnięto konsensusu, ponieważ dodanie takich suplementów może potencjalnie wywołać wtórną insulinooporność, co miałoby dalszy wpływ na żywotność45 .
Poprzednie dane pokazują, że skrawki cieńsze niż 200 μm stają się trudne do jednorodnego cięcia i mogą wykazywać stres oksydacyjny, podczas gdy plastry grubsze niż 400 μm wykazują niski współczynnik penetracji składników odżywczych 18,19,46. Ponadto, w oparciu o wygląd PCLS, wpływ na teksturę i łatwość cięcia, preferowana jest grubość 250 μm. Przenikanie składników odżywczych lub środka terapeutycznego do wewnętrznych warstw komórkowych PCLS jest również znacznie ulepszone dzięki transwellom jako części systemu dynamicznego 18,32. W przeciwieństwie do korzystania z krajalnicy Krumdieck, która ma tę zaletę, że dzięki integracji systemu cięcia rdzeniowego wytwarza się plastry o równych rozmiarach, protokół można dostosować poprzez zmianę rozmiaru plastrów w równych wymiarach po pokrojeniu. Jednak w doświadczeniu należy wziąć pod uwagę zmienność wielkości, masy lub zawartości białka i jej wpływ na środowisko hodowli, a tym samym na żywotność i biomarkery. Z tego powodu odczyty testu MTA, podczas korzystania z tego protokołu, są znormalizowane do świeżej masy każdego plasterka. Można również zaobserwować niejednorodność grubości, ale niestety prawdopodobnie będzie ona obserwowana przy użyciu wszystkich typów krajalnic. Użytkownik może rozważyć odrzucenie najmniej jednorodnych plastrów, oceniając ich aspekt, ale nadal jest to uważane za niewiarygodną opcję i pozostaje wadą PCTS. Głównym ograniczeniem związanym z tym modelem pozostaje względna krótkoterminowa rentowność, ale mieści się ona w opublikowanych jużramach czasowych 24,31. Dostępność tlenu można zwiększyć, aby zwiększyć taką żywotność. Niektóre wcześniej opublikowane protokoły wymagały złożonych pożywek hodowlanych i stężenia tlenu wyższego niż 80%, zwiększając metabolizm i zapewniając dłuższą żywotność 1,24,35,38. Trudno jest również bezpośrednio porównać poziomy tlenu używane do natleniania PCLS i poziomy tlenu używane do hodowli linii komórkowych. Dane dotyczące wpływu tlenu na fizjologię PCLS są bardzo ograniczone 18,47, a wyższe stężenie tlenu prawdopodobnie znacznie zmieni patofizjologię i fenotyp poprzez generowanie toksycznych reaktywnych form tlenu48.
Podsumowując, krótkotrwałe PCLS mogą być wytwarzane przy użyciu ograniczonego sprzętu i wykorzystywane jako niezawodny model ex vivo . Architektura tkankowa ma kluczowe znaczenie w fizjologii wątroby, a PCLS pozwalający na jej zachowanie jest kolejnym przykładem na to, dlaczego model ten powinien być rozważany w bardziej dominujący sposób. Precyzyjnie pokrojone plastry powinny zatem stać się bardziej rozpoznawalnym narzędziem w badaniach naukowych.

Precyzyjnie wycięte plastry tkanek (PCTS) to cienkie fragmenty narządów. Pozwalają one na zachowanie architektury narządu, replikując mini-narząd, przy jednoczesnym zachowaniu trójwymiarowego aspektu sąsiednich komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej. Jest to atrakcyjny model ze względu na łatwy dostęp, oszczędność kosztów i mniej pracochłonne cechy przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej.
PCTS wypełnia lukę między badaniami na komórkach in vitro a badaniami na zwierzętach in vivo, pokonując większość wad obu modeli. PCTS został wygenerowany z różnych narządów, takich jak wątroba1, intestines2,3, colon2, brain4,5, lung6,7,8, kidney9,10, spleen11,12, heart13,14 ale także tumors15,16. Mogą również pochodzić od różnych zwierząt, takich jak mouse1, rat17,18, ale także pig19 i ludzkie odpady chirurgiczne15,20,21. Chociaż PCTS wymaga wykorzystania zwierząt, co sugeruje kwestie etyczne, narząd od jednego zwierzęcia może generować wiele PCTS, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt zgodnie z wytycznymi NC3Rs (Reduction, Replacement, Refinement)22 przy jednoczesnym ograniczeniu różnic międzyosobniczych.
Rozwój ulepszonych krajalnic do tkanek, np. vibratomes23, umożliwił przejście od ręcznie ciętych plastrów charakteryzujących się niejednorodną grubością i słabym wskaźnikiem przeżycia do powtarzalnych, cieńszych plastrów z lepiej zachowaną integralnością strukturalną.
Jednak protokoły przygotowania i hodowli PCTS, a dokładniej precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS), różnią się znacznie w literaturze i nie mają standaryzacji, zwłaszcza dla podstawowych parametrów, takich jak sprzęt do krojenia, zawartość podłoża i warunki hodowli. Protokoły mogą się również zauważalnie różnić w zależności od tkanki, z której pochodzą. Niektóre z protokołów będą wymagały natlenienia buforu lub kultury za pomocą skomplikowanych systemów bioreaktorów24. Zazwyczaj koncentrują się one indywidualnie na różnych aspektach technicznych lub są przeznaczone dla różnych tkanek i często mogą być kosztowne i trudniejsze do odtworzenia w przeciętnym laboratorium w opłacalny sposób.
Tutaj ten protokół łączy kilka kluczowych punktów, takich jak metoda osadzania, kierunek cięcia, użycie transwells25, dynamiczny system hodowli26 oraz znaczenie minimalnej ilości kultury. Niektóre z tych kroków zostały wcześniej zoptymalizowane niezależnie lub w innym kontekście, np. zwłóknienie27 lub tumor response28. Protokół ten podkreśla również znaczenie osadzania przy użyciu niektórych typów krajalnic i orientacji cięcia, które są parametrami trudnymi do opanowania i często zaniedbywanymi w literaturze. Ta prosta metoda generuje PCLS utrzymywane w hodowli przez co najmniej 4 dni przy łatwej konfiguracji i użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego z dostępem do podstawowego krajalnika do tkanek.

<table><tbody><tr><td>Szalka Petriego 3 cm</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Odpowiednia do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 6, 12, 24 dołkowa</td><td>Dowolna</td><td></td><td>dowolna odpowiednia do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Super klej cyjanoakrylowy</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>wkładki 8um, do płytek 12-dołkowych</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>wkładki 8um, do płytek 24-dołkowych</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>wkładki 8um, do płytek 6-dołkowych</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr>Okap <td></td><td></td><td>z przepływem laminarnym</td><td>Filtracja powietrza Hepa</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik tetrazolowy MTS&nbsp;</td>Czytnik płytek <td>wielodołkowych Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tabletki PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne</td><td>Dowolna</td><td></td><td>z płaską kwadratową końcówką&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s Medium E z GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Ten protokół przedstawia prosty system do tworzenia i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS). PCLS zawiera wszystkie komórki w nienaruszonym środowisku i dlatego przypomina mini model całego narządu. Umożliwiają one badanie żywych tkanek przy jednoczesnej replikacji ich złożonych fenotypów. Protokół ten umożliwia przygotowanie plastrów z wątroby myszy przy użyciu wibratomu i standardowego sprzętu laboratoryjnego. Protokoły produkcji i hodowli PCLS nie są ustandaryzowane i mogą się dość drastycznie różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, rodzaju użytego wibratomu i zapotrzebowania na tlen. Mogą one być trudne do odtworzenia w niektórych laboratoriach, które mają dostęp tylko do podstawowego wibratomu i powszechnych urządzeń do hodowli tkankowych. Opracowaliśmy protokół, w którym skupiliśmy się na znaczeniu niektórych kluczowych kroków w ramach różnych już dostępnych protokołów. Protokół ten podkreśla zatem znaczenie metody osadzania, orientacji cięcia, systemu dynamicznego i statycznego oraz znaczenia minimalnej objętości hodowli. Protokół ten można ustalić i odtworzyć w prosty sposób w większości laboratoriów, które mają dostęp do podstawowego krajalnika do tkanek. Podsumowując i zgodnie z tym protokołem, PCLS mogą pozostać przy życiu przez co najmniej 4 dni. PCLS jest prostym, ekonomicznym i powtarzalnym modelem do badania patofizjologicznych i terapeutycznych badań przesiewowych narządów, takich jak wątroba.

Podczas pobierania narządu celowo pomija się perfuzję zwierzęcia, aby zapewnić szybkie przetworzenie organu i zapobiec jego uszkodzeniu. Wątrobę wypreparowuje się szybko po nacięciu i niezwłocznie umieszcza w lodowatym buforze ochronnym dla narządów, np. buforze Krebsa24,29. Choć w literaturze opisano wcześniej krojenie świeżej tkanki wątroby bez zatapiania1, zatopienie wątroby w agarozie niskotopliwej30 (Rysunek 1) w połączeniu z buforem ochronnym dla narządów zapewni optymalne warunki cięcia na wibratomie, ograniczając uszkodzenia tkanki i zwiększając powtarzalność grubości przekrojów. Grubość tkanki jest krytyczna, ponieważ cienkie przekroje pozwalają większej liczbie warstw komórek na dostęp do składników odżywczych i tlenu31 oraz ograniczają śmierć komórek. Jednak przekroje zbyt cienkie stają się trudne do jednorodnego wycięcia. Z kolei plastry o grubości przekraczającej 400 µm wykazują niższą stopę penetracji składników odżywczych. Przekroje inkubowano na granicy ciecz-powietrze przy użyciu wkładki (Rysunek 1) w atmosferze 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. Przekroje należy inkubować w pożywce hodowlanej w ciągu 3 h od pobrania, po czym następuje szybka śmierć komórek32.
Aby określić żywotność PCLS, oceniono żywotność komórek za pomocą testu 4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), który wymaga obecności dehydrogenaz zależnych od NAD(P)H, czyli komórek metabolicznie aktywnych, w celu redukcji MTS. Wartości MTS znormalizowano do odpowiedniej masy skrawka. W celu optymalizacji żywotności PCLS niezbędna była minimalna objętość pożywki hodowlanej w celu podtrzymania żywotności po 24 h inkubacji. Objętość 0,7 mL w płytkach 24-dołkowych wykazała znaczną redukcję żywotności w teście MTS (p = 0,02) w porównaniu do 1,5 mL w płytkach 12-dołkowych oraz 2,6 mL w płytkach 6-dołkowych (Rysunek 2A). Objętości te wybrano tak, aby skrawki były lekko przykryte, jednak mogą one wymagać dostosowania w zależności od rodzaju użytych wkładów i płytek. Podobnie jak w innych pracach33, płytki 12-dołkowe zostały zastosowane jako najlepszy kompromis dla optymalnego przeżycia przy mniejszej objętości pożywki hodowlanej.
Wstrząsanie jest niezbędne i zwiększa żywotność PCLS o 50% w 24 h po inkubacji w porównaniu z kulturą statyczną (Rysunek 2B). Wstrząsanie tworzy krytyczny interfejs powietrze-ciecz, zoptymalizowany dzięki zastosowaniu transwelli, co umożliwia dostęp składników odżywczych i tlenu do obu stron przekroju. Pobór tlenu i składników odżywczych jest również zwiększony przez stały przepływ generowany przez ruch wstrząsający, który przenika również przez membranę transwell.
Test MTS przeprowadzono od 1 h inkubacji aż do 6. dnia inkubacji. Żywotność komórek pozostawała stała od dnia 0 do 4. dnia po inkubacji, przed zaobserwowaniem istotnego spadku (p = 0,05) w 6. dniu (Rycyna 2C). Morfologia PCLS oceniana za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) nie wykazała zmian w przewodach żółciowych i architekturze do 5 dni po inkubacji (Rycina 3A-D). W porównaniu z dniem 0 (Rycina 3A), PCLS nie wykazywały różnic histologicznych w 1. dniu (Rycina 3B) i 2. dniu (Rycina 3C) po inkubacji, natomiast w 5. dniu po inkubacji stwierdzono hiperchromazję jąder, łagodny naciek zapalny oraz wakuolizację, co wskazuje na umiarkowany proces obumierania komórek (Rycina 3D). Podsumowując, ten protokół hodowli PCLS zapewnia żywotność przez co najmniej 4 dni, co jest zgodne z badaniami prowadzonymi na skrawkach w podobnych warunkach31.
<img alt="Schemat procesu hodowli organów myszy; przebieg badania; przygotowanie tkanki wątroby; sprzęt laboratoryjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat podsumowujący protokół generowania PCLS. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie źródła34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie OD490; wykresy słupkowe A-C; analiza statystyczna studzienek, wstrząsania i dni; słupki błędu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zoptymalizowany protokół hodowli PCLS wykazuje satysfakcjonującą żywotność przez 5 dni. (A) Wpływ wielkości studzienki na proliferację komórek (n=3). (B) Wpływ wstrząsania na proliferację komórek (n=6 na warunek). (C) Test proliferacji komórek MTS z przekrojów wątroby od 0 do 6 dni inkubacji (n=5 na punkt czasowy). OD w jednostkach arbitralnych, znormalizowanych do masy świeżej przekroju. Wykres przedstawia średnią ± SD. Nieparzysty dwustronny test t Studenta, ns=brak istotności, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie źródła34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna: porównanie przekrojów tkanki wątroby w czasie z adnotacjami dotyczącymi zmian komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki histologii. (A-D) Reprezentatywne obrazy histologiczne PCLS wątroby po barwieniu H&amp;E. Pasek skali = 100 µM. Rysunek zmodyfikowano na podstawie źródła34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Protokół produkcji i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS) do badania wątroby myszy. W artykule skupiono się na kluczowych aspektach protokołu, który wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego z dostępem do wibratomu i pozwala na przeżycie PCLS przez minimum 4 dni.

Zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

Protokoły produkcji i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS) mogą się drastycznie różnić. Główną wadą PCLS jest ich krótki okres półtrwania, ale tutaj pokazujemy, że wytwarzanie i hodowla PCLS może być osiągnięta w standardowych warunkach laboratoryjnych z dostępem do Vibratome, zapewniając jednocześnie okres półtrwania wynoszący co najmniej cztery dni. PCLS, atrakcyjny model, który wypełnia luki między modelami in vitro i in vivo, ale często są one zaniedbywane ze względu na ich stosunkowo krótki okres półtrwania. Zawierają one jednak wszystkie typy komórek i zachowaną architekturę, niezbędną do sumowania metabolicznego, a zatem przypominają mini model całego narządu, umożliwiając badanie i leczenie żywych tkanek przy jednoczesnej replikacji ich złożonych fenotypów. Ciągłe plastry to bardzo prosty proces, ale wymagający technicznie. Aby to ułatwić, nasz protokół koncentruje się na kluczowych krokach, takich jak orientacja cięcia i osadzanie tkanki, ale także na znaczeniu mini objętości modelu dla hodowli i dynamicznego systemu wydłużającego ich okres półtrwania.[Narrator] Przed zbiorami przygotuj jeden litr buforu Krebs-Henseleit, zdezynfekowaną i schłodzoną tackę Vibratome, autoklawowane ostrza Vibratome i 4% niskotopliwej agarozy. W dniu zbiorów stopioną agarozę przechowuj w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Następnie przygotuj płytki hodowlane, dodając 2,6, 1,5 i 0,7 mililitra kompletnej pożywki na studzienkę odpowiednio do płytek sześcio-, 12- i 24-dołkowych. Włóż porowate wkładki o średnicy ośmiu mikrometrów do każdej studzienki. Umieść płytki w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 21% tlenem. Wysterylizuj wszystkie narzędzia potrzebne do zbioru przy użyciu odpowiednich metod sterylizacji. Spryskaj brzuch uśpionej myszy 70% etanolem, aby zdezynfekować ten obszar. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przetnij skórę i otrzewną od środka brzucha, aby otworzyć jamę brzuszną. Delikatnie wypreparuj wątrobę z otaczających narządów lub naczyń, unikając uszkodzenia płatów. Następnie natychmiast przechowuj całą wątrobę w lodowatym buforze Krebsa. Używając kleszczy i ostrego, sterylnego noża lub nożyczek, oddziel każdy płat z osobna, aby uniknąć uszkodzenia płatów podczas separacji. Za pomocą ostrego, sterylnego noża przytnij wszystkie krawędzie wybranego płata, aby uzyskać proste, łatwe do opanowania krawędzie do osadzenia. Następnie wlej 4% niskotopliwej agarozy do trzycentymetrowej szalki Petriego umieszczonej na mokrym lodzie, aby równomiernie ostygła i zapobiegła zapadaniu się płatka. Pozostaw agarozę do ostygnięcia na kolejne 30 sekund i umieść przycięty płat na środku agarozy, pozwalając mu osiąść na środku bloku. Następnie odetnij zewnętrzne krawędzie bloku agarozy i usuń blok agarozy z naczynia. Upewnij się, że górna strona i strona przyklejona do platformy Vibratome są równoległe do górnej krawędzi płata. Zacznij od ustawienia wibratomu tak, aby cięł na grubość 250 mikrometrów z prędkością pięciu i częstotliwością siedmiu herców. Po wysterylizowaniu Vibratome i umieszczeniu tacki na Vibratome, otocz ją lodem, aby utrzymać niskie temperaturę. Ustaw ostrza pod kątem 10 stopni w dół od płaszczyzny poziomej. Następnie napełnij zbiornik Vibratome lodowatym buforem Krebsa. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na platformę, aby przygotować ją do montażu bloku agarozowego. Następnie osusz krawędź bloku agarozy, który zostanie przyklejony do platformy, za pomocą sterylnej tkanki chłonnej. Teraz umieść blok agarozy na zdejmowanej platformie Vibratome. Ustaw płat wątroby pionowo, aby umożliwić cięcia poprzeczne, co zmniejsza nacisk na płat i ułatwia płynniejsze cięcie. Poczekaj minutę, aż klej stwardnieje i zanurz platformę w zbiorniku Vibratome, upewniając się, że blok agarozy jest całkowicie pokryty buforem Krebsa. Aby zaprogramować Vibratome do cięcia, ustaw pozycje start i stop. Następnie zacznij kroić plastry, aż dojdziesz do płata wątroby. Użyj szpatułki, aby zebrać plastry wątroby, ponieważ pozwala to uniknąć uszkodzeń, w przeciwieństwie do kleszczy lub szczotek. Zbierz plastry w lodowatym buforze Krebsa, aż będą gotowe do hodowli. Za pomocą szpatułki przenieś plastry wątroby do przygotowanych studzienek zawierających pożywkę i wkładki. Następnie umieść płytki na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 130 obr./min i inkubuj je w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 21% tlenem.

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Ten film opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia okresową ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Protokół opisuje metodologię generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych wycinków guza...

Hodowla eksplantatów tkanki guza płuc: procedura generowania i hodowli precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

W tym filmie opisujemy procedurę napełniania wyizolowanych ludzkich płuc agarozą i przygotowywania precyzyjnie wyciętych ludzkich plastrów płuc. Przygotowane ex vivo wycinki płuc można wykorzystać do dalszych eksperymentów immunologicznych.

Preparat na bazie agarozy z precyzyjnie pokrojonymi ludzkimi plastrami płuc

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Niniejszy protokół opisuje produkcję tetrameru KLRG1, który jest potężnym narzędziem do analizy ligandów KLRG1.

Protokół produkcji tetrameru KLRG1

Technika hodowli całego zarodka pozwala na hodowlę zarodków myszy i szczura w warunkach ex vivo przez ograniczony czas, odpowiadający etapom środkowej okresu ciężywności. W niniejszym protokole wideo prezentujemy standardowe procedury hodowli całego zarodka szczura po E12.5 przy użyciu systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego.

Metoda hodowli całych embrionów gryzoni z wykorzystaniem systemu hodowli w butelkach typu rotacyjnego

Poznaj zoptymalizowaną metodę produkcji precyzyjnie krojonych plastrów wątroby (PCLS) z mysich wątrób przy użyciu vibratomu. Technika zapewnia przetrwanie tkanek przez minimum cztery dni, zachowując architekturę i funkcje metaboliczne.

Zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby

Przeglądaj więcej filmów