Zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby

Protokoły produkcji i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS) mogą się drastycznie różnić. Główną wadą PCLS jest ich krótki okres półtrwania, ale tutaj pokazujemy, że wytwarzanie i hodowla PCLS może być osiągnięta w standardowych warunkach laboratoryjnych z dostępem do Vibratome, zapewniając jednocześnie okres półtrwania wynoszący co najmniej cztery dni. PCLS, atrakcyjny model, który wypełnia luki między modelami in vitro i in vivo, ale często są one zaniedbywane ze względu na ich stosunkowo krótki okres półtrwania. Zawierają one jednak wszystkie typy komórek i zachowaną architekturę, niezbędną do sumowania metabolicznego, a zatem przypominają mini model całego narządu, umożliwiając badanie i leczenie żywych tkanek przy jednoczesnej replikacji ich złożonych fenotypów. Ciągłe plastry to bardzo prosty proces, ale wymagający technicznie. Aby to ułatwić, nasz protokół koncentruje się na kluczowych krokach, takich jak orientacja cięcia i osadzanie tkanki, ale także na znaczeniu mini objętości modelu dla hodowli i dynamicznego systemu wydłużającego ich okres półtrwania.

[Narrator] Przed zbiorami przygotuj jeden litr buforu Krebs-Henseleit, zdezynfekowaną i schłodzoną tackę Vibratome, autoklawowane ostrza Vibratome i 4% niskotopliwej agarozy. W dniu zbiorów stopioną agarozę przechowuj w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza do czasu użycia. Następnie przygotuj płytki hodowlane, dodając 2,6, 1,5 i 0,7 mililitra kompletnej pożywki na studzienkę odpowiednio do płytek sześcio-, 12- i 24-dołkowych. Włóż porowate wkładki o średnicy ośmiu mikrometrów do każdej studzienki. Umieść płytki w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 21% tlenem. Wysterylizuj wszystkie narzędzia potrzebne do zbioru przy użyciu odpowiednich metod sterylizacji. Spryskaj brzuch uśpionej myszy 70% etanolem, aby zdezynfekować ten obszar. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przetnij skórę i otrzewną od środka brzucha, aby otworzyć jamę brzuszną. Delikatnie wypreparuj wątrobę z otaczających narządów lub naczyń, unikając uszkodzenia płatów. Następnie natychmiast przechowuj całą wątrobę w lodowatym buforze Krebsa. Używając kleszczy i ostrego, sterylnego noża lub nożyczek, oddziel każdy płat z osobna, aby uniknąć uszkodzenia płatów podczas separacji. Za pomocą ostrego, sterylnego noża przytnij wszystkie krawędzie wybranego płata, aby uzyskać proste, łatwe do opanowania krawędzie do osadzenia. Następnie wlej 4% niskotopliwej agarozy do trzycentymetrowej szalki Petriego umieszczonej na mokrym lodzie, aby równomiernie ostygła i zapobiegła zapadaniu się płatka. Pozostaw agarozę do ostygnięcia na kolejne 30 sekund i umieść przycięty płat na środku agarozy, pozwalając mu osiąść na środku bloku. Następnie odetnij zewnętrzne krawędzie bloku agarozy i usuń blok agarozy z naczynia. Upewnij się, że górna strona i strona przyklejona do platformy Vibratome są równoległe do górnej krawędzi płata. Zacznij od ustawienia wibratomu tak, aby cięł na grubość 250 mikrometrów z prędkością pięciu i częstotliwością siedmiu herców. Po wysterylizowaniu Vibratome i umieszczeniu tacki na Vibratome, otocz ją lodem, aby utrzymać niskie temperaturę. Ustaw ostrza pod kątem 10 stopni w dół od płaszczyzny poziomej. Następnie napełnij zbiornik Vibratome lodowatym buforem Krebsa. Nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na platformę, aby przygotować ją do montażu bloku agarozowego. Następnie osusz krawędź bloku agarozy, który zostanie przyklejony do platformy, za pomocą sterylnej tkanki chłonnej. Teraz umieść blok agarozy na zdejmowanej platformie Vibratome. Ustaw płat wątroby pionowo, aby umożliwić cięcia poprzeczne, co zmniejsza nacisk na płat i ułatwia płynniejsze cięcie. Poczekaj minutę, aż klej stwardnieje i zanurz platformę w zbiorniku Vibratome, upewniając się, że blok agarozy jest całkowicie pokryty buforem Krebsa. Aby zaprogramować Vibratome do cięcia, ustaw pozycje start i stop. Następnie zacznij kroić plastry, aż dojdziesz do płata wątroby. Użyj szpatułki, aby zebrać plastry wątroby, ponieważ pozwala to uniknąć uszkodzeń, w przeciwieństwie do kleszczy lub szczotek. Zbierz plastry w lodowatym buforze Krebsa, aż będą gotowe do hodowli. Za pomocą szpatułki przenieś plastry wątroby do przygotowanych studzienek zawierających pożywkę i wkładki. Następnie umieść płytki na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 130 obr./min i inkubuj je w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 21% tlenem.