Charakterystyka pośredniczonego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trójelektrodowego, dwukomorowego układu bioelektrochemicznego

W naszym laboratorium badamy zewnątrzkomórkowy transfer elektronów (EET) u bakterii takich jak lactiplantibacillus plantarum, która jest bakterią fermentacyjną o krytycznym znaczeniu w przemyśle spożywczym. W EET komórka przenosi elektrony do zewnątrzkomórkowego berła elektronicznego, podobnie jak elektroda w bioelektrycznym układzie chemicznym. Chcemy zrozumieć i zaprojektować EET do zastosowań w biodetekcji, biokatalizie i fermentacji żywności.

Odkryliśmy, że tunel alpejski może kupować prąd przez EET w obecności chinonu, takiego jak DHNA. Proces ten regeneruje NAD plus, przyspiesza ogólną utratę pierwotnych szlaków fermentacji i przyspiesza wzrost komórek. Co więcej, odkryliśmy, że różne pochodne chinonu, inne niż DHNA, mogą również pośredniczyć w EET w L plantarum.

Badanie EET za pośrednictwem EET wymaga specjalistycznych, biochemicznych konfiguracji. W szczególności używamy trzyelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego, aby zapobiec przesłuchom między reakcjami anodowymi i katodowymi. Używamy również pola węglowego, elektrody roboczej o dużej powierzchni, aby usprawnić transfer elektronów z mediatorów elektronów.

Nasza praca nad badaniem szlaków EET w L. plantarum i tego, w jaki sposób te szlaki oddziałują na metabolizm fermentacyjny, może mieć użyteczne zastosowania w przemyśle spożywczym. Wiemy, że EET i L plantarum zmieniają przepływ metaboliczny poprzez fermentację i można nimi manipulować w celu uzyskania użytecznych zastosowań i zmiany smaków żywności oraz wytwarzania cennych substancji chemicznych w elektrofermentacji. W przyszłości będziemy nadal poszerzać naszą podstawową wiedzę na temat EET i poszukiwać nowych zastosowań EET w organizmach takich jak L. plantarum.

Planujemy inżynierię białek w szlaku EET, co pozwoli nam na dalszą kontrolę EET pod kątem zastosowań w elektrofermentacji i biodetekcji. Na początek przeszlifuj wstępnie przycięte druty tytanowe o średnicy jednego milimetra do pracy w przeciwelektrodach papierem ściernym z tlenku glinu, aż będą równomiernie błyszczące. Za pomocą szczypiec zegnij jeden koniec każdego roboczego drutu elektrody w mały haczyk.

Wsuń okrągły filc węglowy o powierzchni 16 centymetrów kwadratowych na każdy drut elektrody roboczej, wplatając drut i wysuwając go z filcu węglowego raz i ciągnąc okrąg w dół drutu, aż zostanie przymocowany do haka. Zabezpiecz działające elektrody stykowe w nasadkach GL 45, przekłuwając gumową przegrodę drutem i przeciągając ją przez kilka centymetrów. Aby zbudować sparowane reaktory, zmontuj O-ring i umieść wstępnie przyciętą membranę kationitową, wstępnie nasączoną wodą w zmontowanym O-ringu.

Umieść O-ring z membraną między dużymi dolnymi otworami dwóch sparowanych butelek reaktora. Zabezpiecz parę butli reaktora i pierścień z membraną za pomocą zacisku przegubowego. Wrzuć magnetyczny pręt mieszający do każdej komory anodowej przed zamknięciem wszystkich małych otworów w górnej części każdej butelki nakrętkami GL14, wyposażonymi w gumowe przegrody.

Napełnij każdą butelkę reaktora 110 mililitrami wody dejonizowanej. Włóż nasadki wyposażone w okrągłą elektrodę roboczą z filcu węglowego i delikatnie dociśnij górną część filcowego krążka, aby utrzymać go na haczyku. Zamknąć butelki odpowiednią, mocowaną elektrodą nakrętką GL45.

Reaktory wypełnione wodą w autoklawie i nasadki elektrod GL14. W sterylnych warunkach zeskrob kulturę laktoplantacyjną abasilisk plantarum z wierzchu bulionu glicerolowego i zaszczep w trzech mililitrach komercyjnego podłoża rugosa sharp lub MRS. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, bez wstrząsania.

Na początek w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wylej autoklawowaną wodę z reaktorów systemu bioelektrochemicznego. Napełnij komory katodowe 110 mililitrami autoklawowanego medium M9, a komory anodowe 110 mililitrami świeżo przygotowanego MCDM. Wymień jedną nasadkę GL14 z komory anodowej na nasadkę GL14 do autoklawu z silikonowym pierścieniem sufitowym.

Spryskaj przygotowane elektrody referencyjne 70% etanolem przed umieszczeniem go przez nasadkę elektrody w każdej komorze anodowej. Dokręć wszystkie zaślepki i zaciski, aby uniknąć wycieku. Aby przymocować reaktory do systemu pompy wodnej, najpierw umieść każdy reaktor na odpowiedniej platformie mieszadła.

Następnie połącz króćce płaszcza wodnego każdego reaktora z drugim za pomocą gumowych rurek, łącząc reaktory końcowe z rurami doprowadzającymi i odpływowymi pompy wodnej. Napełnij pompę wodą i dodaj cztery do sześciu kropli uzdatniacza wody. Włącz układ pompy i ustaw temperaturę na 30 stopni Celsjusza.

Uruchom pompę i obserwuj przepływ wody przez wszystkie płaszcze wodne reaktora, upewniając się, że nie ma wycieków. Włącz platformy mieszające i ustaw je na ciągłe mieszanie z prędkością 220 obr./min. Aby przymocować reaktory do przewodów gazowych oszczędzających azot, najpierw podłącz filtr powietrza do igły o rozmiarze 22 i włóż igłę przez górną przegrodę komory anodowej reaktora do media.

Włóż igłę o rozmiarze 18 w górną przegrodę komory anodowej reaktora, a następnie podłącz przewód gazowy ze źródła azotu do filtra powietrza i otwórz zawór, aby gaz mógł delikatnie przepływać przez reaktor. Aby podłączyć bioreaktory do przewodów potencjostatu, podłącz przewody zaciskowe licznika roboczego i elektrody aligatora elektrody odniesienia z potencjostatu do odpowiednich elektrod. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów naciśnij zielony trójkąt startowy, aby rozpocząć bieg.

Obserwuj ślady napięcia w obwodzie otwartym przez kilka minut, aby upewnić się, że wszystkie dławiki odczytują pozytywnie. i zamykają się ze sobą stałym sygnałem. W sterylnych warunkach subkulturuj wcześniej wyhodowaną kulturę L plantarum od jednego do 200 w 50 mililitrach MMRS.

Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, bez potrząsania. Aby rozpocząć, usuń z inkubatora kulturę L plantarum wyhodowaną w MMRS. Przenieś kulturę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów w sterylnych warunkach i umieść probówkę na lodzie.

Odwirować kulturę w temperaturze 4 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 50 mililitrach PBS. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w zimnym PBS do gęstości optycznej 600 nanometrów 11.

Załaduj dwa mililitry zawieszonych komórek do trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę. Na stacji reaktora odkręć strzykawkę z komórkami i włóż igłę do górnej części komory anodowej reaktora. Gdy wszystkie strzykawki znajdą się na swoim miejscu, należy nacisnąć tłoki, aby wstrzyknąć komórki.

Zanotować czas wstrzyknięcia na podstawie śladu chronoamperometrycznego. Pozwól, aby prąd ustabilizował się na ścieżce przez dwie do czterech godzin. W systemie bioelektrochemicznym oznaczyć reaktory eksperymentalne jako plus DHNA, a reaktory kontrolne z rozpuszczalnikiem jako minus DHNA.

Odkręć strzykawkę załadowaną 110 mikrolitrami 20 miligramów na mililitr DHNA i włóż ją do górnej części komory anodowej, oznaczonej jako plus DHNA. Włożyć strzykawkę wypełnioną 110 mikrolitrami DMSO do komory anodowej, oznaczonej jako minus DHNA. Za pomocą trzymililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 21 usuń dwa mililitry pożywki z każdej komory anodowej przez nieużywaną przegrodę małej czapeczki.

Przenieś próbki na płytkę z 24 dołkami, aby zmierzyć pH dla punktu czasowego godziny zero. Wcisnąć tłoki strzykawek DHNA i DMSO, aby wstrzyknąć je do reaktorów. Zanotować czas wstrzyknięcia na podstawie śladu chronoamperometrycznego.

Wyrzucić wszystkie strzykawki i igły. Po 24 godzinach usuń dwa mililitry pożywki z każdej komory anodowej, jak opisano wcześniej, i przenieś ją na płytkę z 24 dołkami w celu 24-godzinnych pomiarów pH. Uruchom woltamperometrię cykliczną dla 24-godzinnego punktu czasowego.

Zmierzyć i zapisać pH dla 24-godzinnych próbek z każdego reaktora. Gęstość prądu spowodowana zewnątrzkomórkowym przenoszeniem elektronów osiągnęła szczyt około 132 mikroamperów na centymetr kwadratowy, osiem godzin po wstrzyknięciu DHNA. Natomiast wtrysk DMSO spowodował znikomą gęstość prądu.

Dane z cyklicznej woltamperometrii wykazały wyraźny wzrost prądu oksydacyjnego przy 50 miliwoltach w obecności L plantarum z DHNA, w porównaniu z L plantarum z DMSO oraz 256% wzrost gęstości prądu przy 300 miliwoltach w porównaniu z abiotycznym śladem DHNA. Zewnątrzkomórkowy transfer elektronów spowodował znaczny spadek pH do średnio 3,33 w ciągu 24 godzin w próbkach z L plantarum i DHNA, podczas gdy próbki z L plantarum i DMSO miały średnie pH 6,50.