Name: Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji rozwijania DNA w czasie rzeczywistym przez helikazę CMG z Drosophila melanogaster przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Gheorghe Chistol za dostarczenie plazmidu pGC261 oraz Instytutowi Chemicznego Instytutu Francisa Cricka do syntezy i znakowania peptydów. Prace te zostały sfinansowane przez The Francis Crick Institute, który otrzymuje podstawowe wsparcie od Cancer Research UK, UK Medical Research Council oraz The Wellcome Trust (CC2133).

CMG-Mediated DNA Unwinding Observed by ssDNA-RPA Tract Growth

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Ten test stanowi platformę do obserwacji i badania dynamiki poszczególnych CMG w czasie rzeczywistym, zarówno w izolacji, jak i w kontekście pożądanych dodatkowych czynników. Jednak, jak w przypadku wielu technik fluorescencji pojedyncząłych, istnieją pewne typowe wyzwania, które wymagają optymalizacji. Zazwyczaj dotyczą one fluoroforów obrazowania przez długi czas (fotobielenie, jasność), przygotowania substratu DNA (uszkodzenia DNA), jakości powierzchni komórek przepływowych (szum tła, interakcje niespecyficzne) lub jakości przygotowania oczyszczonego białka (zanieczyszczenie nukleazą, efektywność znakowania).
Każdy fluorofor różni się pod względem fotostabilności i jasności, dlatego ważne jest, aby wybrać odpowiednią cząsteczkę. Podczas obrazowania fluorescencyjnie oznakowanych białek oligomerowych, takich jak RPA, można użyć niższej mocy lasera, ponieważ wiele fluoroforów zostanie wzbudzonych w bliskim sąsiedztwie, generując widoczny sygnał. Do obrazowania pojedynczych fluoroforów, na przykład CMG oznaczonych na pojedynczej podjednostce, potrzebna jest wyższa moc lasera, aby wyraźnie obserwować fluorofor. Żywotność fluoroforu można wydłużyć poprzez minimalizację ekspozycji laserowej, na przykład poprzez zmniejszenie częstotliwości wykonywania zdjęć. Dodatkowo, pobudzenie fluoroforu generuje reaktywne ilości tlenu (ROS), które mogą przyczyniać się do fotobielenia. Włączenie systemu usuwania tlenu do bufora obrazowego może wydłużyć żywotność fluoroforów poprzez eliminację ROS. Jednak niektóre systemy usuwania tlenu mogą wpływać na pH12.
W przypadku przygotowania podłoża DNA kluczowe jest minimalizowanie uszkodzeń DNA, takich jak nacięcia czy szczeliny jednoniciowe. Nadmierne uszkodzenia zapobiegają rozległemu rozwijaniu DNA, ograniczając ilość danych, które można zebrać. Uszkodzenia mogą powstać w wyniku ścinania mechanicznego, nadmiernego nagrzewania, zanieczyszczenia nukleazą lub ROS powstającego podczas obrazowania. Strzyżenie można zminimalizować, obchodząc się z próbką DNA ostrożnie, stosując szerokie końcówki do pipetowania, pipetując powoli i unikając przesuwania próbki. Wpływ ROS można zminimalizować poprzez zmniejszenie ekspozycji na laser lub włączenie systemu usuwania tlenu do bufora obrazowania. Po przygotowaniu substratu DNA można użyć komercyjnych zestawów naprawczych DNA do naprawy uszkodzeń przed przeprowadzeniem reakcji odwijającej.
Skuteczność rozwijania DNA zależy również od czystości i aktywności CMG. Dobrą praktyką jest ocena czystości próbki po każdym kroku oczyszczania za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, aby określić, gdzie konieczna jest optymalizacja. Jeśli po ostatnim kroku zaobserwowane zostanie zbyt wiele zanieczyszczeń, może pomóc modyfikacja objętości gradientu soli używanej do elucii z kolumny CaptoHiRes Q (5/50). Bardzo ważne jest również usunięcie nadmiaru fluorescencyjnego peptydu używanego do znakowania białek, ponieważ może on tworzyć niepożądane tło na powierzchni pokrywy. Ważne jest również unikanie zanieczyszczenia nukleazą, ponieważ może to degradować podłoże DNA. Po eksperymencie zabarwienie pozostałego DNA SYTOX na pomarańcz może być dobrym sposobem na sprawdzenie, czy DNA uległo znacznej degradacji. Pewien poziom uszkodzenia DNA jest nieunikniony w trakcie eksperymentu, ale poważne uszkodzenia często wskazują na problematyczne zanieczyszczenie nukleazą.
Test jest również z natury ograniczony rozdzielczością plam ograniczonych dyfrakcją, wymagając, aby białka fluorescencyjne znajdowały się setki par zasad (jeśli nie więcej), aby odróżnić je jako oddzielne. Ogranicza to szczegółowość, z jaką można obserwować postęp i interakcje CMG.
Liczba obserwowanych zdarzeń rozwijania się w każdej analizie różni się. Aby eksperyment był udany, spodziewamy się co najmniej kilku odcinków RPA o wystarczającej długości na pole widzenia 512x512 pikseli (rozmiar piksela = 154,6 nm). W tym samym eksperymencie można obrazować wiele pól widzenia, co pozwala na większą ilość danych, gdy jest to konieczne. Drogi nie muszą mieć tej samej długości ani sięgać końca DNA, aby były użyteczne. Na przykład średnią odległość lążenia dla każdego eksperymentu można określić, mierząc długość DNA barwionego SYTOX przed dodaniem CMG. Można to wykorzystać do oszacowania, ile DNA zostało odwinięte w dowolnym traktie RPA (o ile jest wystarczająco dużo DNA, by widocznie poruszać widelec), przeliczając odległość z "μm przejęte" na "kb unwound".
CMG wykazuje aktywność rozwijania na różnych substratach DNA, jednak konieczne jest zapewnienie wolnego 3' końca DNA na poliT płatku o co najmniej 30 nt, aby pomieścić powierzchnię CMG10. Umieszczenie wielu części biotynowych na rozwidleniu zapewnia solidne ukojenie powierzchniowe. Reszta substratu DNA może być przeprojektowana na wiele sposobów, na przykład uwzględniając różne sekwencje, długości i modyfikacje chemiczne DNA. Konformacja DNA może być zmieniona przez zastosowanie różnych stężeń octana magnezu. W wyższych stężeniach (≥10 mM) octana magnezu filament ssDNA pokryty RPA ulega zagęszczeniu, co prowadzi do wyciągania DNA przez wiązanie RPA podczas rozwijania. Może to być przydatne, ponieważ zapobiega nadmiernemu przesuwaniu się DNA, pozwalając dokładniej zmierzyć położenie CMG i rozwijający się progresję. W niskich stężeniach (~3 mM) octana magnezu RPA-ssDNA pozostaje rozluźnione przez cały czas.
Opisany test pojedyncząłowy stanowi platformę, którą można rozwijać i modyfikować w celu dalszego badania aspektów replikacji DNA. Podczas replikacji DNA CMG działa jak rdzeń, wokół którego składa się odpowiedź i jej składniki. Dlatego do tego testu można dodać dodatkowe oczyszczone białka, w tym czynniki dodatkowe takie jak TIMELESS, TIPIN i CLASPIN, aby badać ich wpływ na dynamikę CMG. Wykazano, że te białka wpływają na szybkość replikacji widełek13, ale nie jest jasne, w jaki sposób wpływają na tempo rozwijania CMG. Dlatego warto zbadać, jak różne białka reresponsivesome wpływają na CMG za pomocą tego testu. Dodawanie polimeraz DNA może dać lepszy wgląd w replikację DNA wykraczającą poza samo rozwijanie DNA, jak opisano wcześniej w przypadku białek drożdżowych14. Ponadto oczyszczanie zmodyfikowanego CMG może lepiej zrozumieć, jak niektóre mutacje lub modyfikacje potranslacyjne wpływają na aktywność helikazy15,16. Dodatkowo, projektowanie różnych substratów DNA pozwala na badanie rozwijania DNA przez CMG w różnych warunkach naśladujących stres replikacyjny17. Modyfikacje te obejmują przeszkody DNA 9,18, połączenia międzynici 19,20,2 1 oraz nieciągłości w nici DNA22.

Replikacja DNA jest ściśle regulowana, ponieważ komórka musi dokładnie duplikować swój genom, aby zapobiec mutacjom, chorobom lub śmierci. Replikacja DNA eukariotycznego odbywa się przez kompleks rerespondsome, który rozwija DNA rodzicielskie i wykorzystuje jednoniciowe DNA (ssDNA) jako szablon do syntezy nowego DNA. W fazie G1 katalistycznie nieaktywne podwójne heksamery MCM2-7 są ładowane na DNA dwuniciowe (dsDNA) w miejscach początkowych replikacji1. W fazie S kompleksy MCM2-7 są aktywowane przez wiązanie CDC45 i GINS2 , tworząc 11-podjednostkowe kompleksy CMG (CDC45, MCM2-7, GINS). Każdy CMG inicjuje rozwijanie DNA w przeciwnych kierunkach, tworząc jądro, wokół którego odpowiadający układasię w 3.
Dwadzieścia lat temu helikaza CMG została po raz pierwszy zidentyfikowana jako kompleks składający się z 11 podjednostek, niezbędny do replikacji DNA4. Od tego czasu nasza wiedza na temat CMG znacznie się rozwinęła, od ładowania i aktywacji 5,6 do odwijania i zakończenia DNA7. Tradycyjne techniki biochemiczne i biologii strukturalnej odegrały kluczową rolę w wielu z tych odkryć; jednak metody te często były ograniczone w zakresie badania bardziej dynamicznych aspektów CMG. Metody pojedynczych cząsteczek wykorzystują fizyczną manipulację pojedynczych biomolekuł do pomiaru lub wizualizacji ich aktywności po cząsteczce na raz. Może to być wykorzystane do uzyskania wglądu w dynamikę białek w czasie rzeczywistym, które często są pomijane lub niewykrywalne przez inne techniki 8,9.
Tutaj opisujemy całkowity test fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF), który pozwala na wizualizację rozwijania DNA przez helikazę CMG w czasie rzeczywistym. Oczyszczony, fluorescencyjnie oznakowany CMG jest ładowany na wolny 3' koniec długiego DNA zawierający gotową strukturę widłową DNA. DNA liniowe jest rozciągane na pokrywie biotyny-PEG w komórce przepływu mikrofluidycznego, łącząc oba końce DNA sekwencyjnie z powierzchnią. Takie podejście pozwala na bardziej jednolite powiązanie DNA, co znacząco zmniejsza zmienność uwzględnioną podczas analizy danych. W obecności ATP-γ-s, CMG jest ładowane na jednoniciowe DNA na końcu 3' widelecza. ATP-γ-s to powoli hydrolizowalny analog ATP, który pozwala na wiązanie CMG z DNA, ale nie na rozwijanie się. Kolejne dodanie ATP, wraz z oczyszczonym, fluorescencyjnie oznakowanym RPA, aktywuje CMG i rozpoczyna rozległe rozwijanie DNA. Wizualnie CMG translokuje się wzdłuż DNA, pozostawiając za sobą rosnący fragment ssDNA związanego z RPA. Nieuwięziony koniec DNA przemieszcza się razem z CMG, tworząc "ciasną kulę" w wyniku zagęszczenia spowodowanego wiązaniem RPA. Projekt komórki przepływowej pozwala na wymianę bufora w dowolnym momencie podczas odwijania, co daje doskonałą kontrolę podczas i nad każdym eksperymentem.
Protokół ten dzieli się na cztery metody, które mogą być wykonywane niezależnie od siebie. Sekcja 1 opisuje przygotowanie 20-kb liniowego podłoża DNA o rozwidleniu do testów pojedynczych cząsteczek. Sekcja 2 opisuje oczyszczanie i fluorescencyjne znakowanie Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). Kluczowe informacje dotyczące ekspresji DMCMG znajdują się w sekcji notatek. Sekcja 3 obejmuje przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej, która może być stosowana w mikroskopie TIRF. Sekcja 4 opisuje, jak przeprowadzić test rozwijania DNA na pojedynczych cząsteczkach.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Akryloamid / roztwór Bis 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Używany do przygotowania Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Używany z kolektorem frakcji F9-C; System oczyszczania białek</td></tr><tr><td>ŻEL POWINOWACTWA ANTY-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywka biotynowo-PEG</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Przygotowane zgodnie z opisem: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Biotynolowe przeciwciało antydigoksygeniny&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>Nie ma</td><td>Maść klejowa</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Rozcieńczone z bulionu</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Połączony z systemem oczyszczania białek AKTA; Kolumnowa chromatografia jonowa o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Kazeina (5% w wodzie, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>System ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Klipy</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Deska do krojenia</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Rurka dializowa (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>digoksygenina-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>barwnik do ładowania DNA 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna (0,14 mm grubości)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>PEPTYD DYKDDDDK&nbsp;</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Syntetyzowane przez biologię chemiczną STP Instytutu Francisa Cricka</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp;</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Oczyszczone, jak opisano w ' Single Molecule Analysis', Series Methods in Molecular Biology, tom 783 (2011), Peterman, E. J. G. i Wuite G. J. L. redaktorzy, Humana Press. Informacje o białku: 2 mM, ludzkie, wyrażane w E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Epoksyd - 5 minut</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>Analizator obrazu fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>GelRed barwienie kwasem nukleinowym; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Przykład barwienia kwasów nukleinowych, które jest bezpieczniejszą alternatywą dla bromku etydu.</td></tr><tr><td>Szkło lub kwarc z otworami na rurki&nbsp;</td><td>Dremel Model 395</td><td></td><td>Suwak o grubości 1 mm, wycięty na 2,4 cm x 1 cm, dwa otwory wywiercone w odległości 1,4 mm. Otwory powinny być wiercone o różnych rozmiarach, aby pomieścić różne rury na każdym końcu.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glycine HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton, seria 1000 GASTIGHT, zamek luer PTFE 1010TLL, zamek luer PTFE (ze szczelinami), objętość 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-Ceul</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do dializ z rurką Maxi GeBa; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa szpatułka</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Metalowe pęsety</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (filtry strzykawkowe) 0,22 & mikro; m&nbsp;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ndash; Żele białkowe Bis-Tris 12%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz obiektywu</td><td>Okolab</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>Przygotowane z polimerazy DNA Phusion (20 & mikro; L), 10 mM dNTP (40 i mikro; L), 5x bufor HF Phusion (400 i mikro; L) oraz wody (540 & micro; L).</td></tr><tr><td>Peptyd NH2-CHHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, znakowany LD655-MAL&nbsp;</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>peptyd NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, oznaczony LD655-MAL (Lumidyne Technologies) na resztie cysteiny, został zsyntetyzowany i oczyszczony przez chemię peptydów STP Instytutu Francisa Cricka</td></tr><tr><td>Plazmid pGC261</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pęsety</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Rury polietylenowe PE20 (średnica wewnętrzna 0,015", średnica zewnętrzna 0,043")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Rury polietylenowe PE60 (średnica wewnętrzna 0,03", średnica zewnętrzna 0,048")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>kolumny chromatografii poliprep; 10 ml i 20 ml & nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu (kwas L-glutaminowy, sól potasowa monohydrata)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (cOmplete, wolny od EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Pompa 11 Elite Infuzja/Pobieranie Programowalna Pojedyncza Strzykawka</td><td>Aparat Harvarda</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortaza (pentamutant)</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td>Oczyszczony na podstawie: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>Filtry rurowe wirówkowe Spin-X; 0,22 & mikro; octan celulozy m & nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel sterylny</td><td>Nie ma</td><td>Nie ma</td><td></td></tr><tr><td>Steritop próżniowy system filtracji jednorazowej napędzanej; 0,22 um; PES; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna (1 mg/mL) w 1x buforze PBS</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & mikro; L alicytaty</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Wysoce czułe barwienie kwasu nukleinowego, którego użyliśmy do wizualizacji podłoża DNA fork.</td></tr><tr><td>SYTOX pomarańczowy; 5 & mikro; M w DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcji ligazy T4 DNA&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza TEV (1 mg/mL); EZCut&nbsp;</td><td>Biowizja</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Młynki do tkanek, typ Dounce (40 mL, Wheaton)</td><td>DWK Nauki o Życiu</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Używany do przygotowania Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja rozwijania dna w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę cmg

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Wierna duplikacja genomu jest niezbędna do zachowania stabilności genetycznej dzielących się komórek. Replikacja DNA odbywa się podczas fazy S za pomocą dynamicznego kompleksu białek zwanego replisomem. U centrum odpowiedzi znajduje się helikaza CDC45-MCM2-7-GINS (CMG), która rozdziela dwie nici podwójnej helisy DNA tak, aby polimerazy DNA mogły kopiować każdą z nich. Podczas duplikacji genomu odpowiedzi muszą pokonać wiele przeszkód i wyzwań. Każda z tych sytuacji zagraża stabilności genomu, ponieważ brak pełnej i dokładnej replikacji DNA może prowadzić do mutacji, chorób lub śmierci komórek. Dlatego bardzo interesujące jest zrozumienie, jak CMG funkcjonuje w odpowiedzi zarówno podczas normalnego naprężenia replikacyjnego, jak i replikacyjnego. Tutaj opisujemy test mikroskopii całkowitej odbicia wewnętrznego (TIRF) z użyciem rekombinowanych oczyszczonych białek, który umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym powierzchniowych rozciągniętych cząsteczek DNA przez poszczególne kompleksy CMG. Ten test stanowi potężną platformę do badania zachowania CMG na poziomie pojedynczej cząsteczki, umożliwiając bezpośrednią obserwację dynamiki helikaz w czasie rzeczywistym nad warunkami reakcji.

Gdy CMG rozwija DNA, charakterystyczny trakt RPA będzie się rozwijał z czasem (Rysunek 5). 5-stopowy koniec nieowiniętego DNA jest przywiązany do powierzchni; dlatego postrzega się go jako liniowy odcinek sygnału RPA między liną a widłem. Koniec 3' nie jest powiązany i dlatego porusza się razem z wideleciem i jest obserwowany jako zwarty sygnał EGFP-RPA. Pozycja skompresowanej nienawitej linii translokacyjnej odpowiada mniej więcej pozycji widelca replikacyjnego, który porusza się razem z LD655-CMG wizualizowanym za pomocą lasera 640 nm.
Ważne jest, aby minimalizować uszkodzenia substratu DNA, ponieważ uszkodzenia takie jak nacięcia pojedynczoniciowe zmniejszają liczbę obserwowalnych zdarzeń rozwijania, ograniczając ilość danych, które można zebrać (Rysunek 6).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67212/67212fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Test rozwijania DNA na pojedynczą. Podłoże DNA jest przymocowane do powierzchni pokrywkowej. Oczyszczony CMG oznaczony LD655 jest inkubowany z DNA przez 15 minut w ATP-g-s. Dodaje się ATP oraz oczyszczone RPA znakowane EGFP, co inicjuje rozległe rozwijanie DNA przez CMG. Pokazano schemat rysunkowy (po lewej) oraz kymograf reprezentatywnych danych (po prawej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67212/67212fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67212/67212fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Uszkodzenie DNA zmniejsza przepustowość testu. (A) CMG nie może rozwinąć DNA poza przerwaniem w szkieletu DNA (DNA cięcie). Nacięcie na szablonie wiodącej nici powoduje zsuwanie się CMG z DNA, a zarówno CMG, jak i szablon wiodącej nici zostają utracone. Uszkodzenie na zaciętej nici powoduje oddzielenie się od reszty DNA, a każdy fragment DNA cofa się do swojego odpowiedniego połączenia. Ilustrują to (i) rysunki kreskówkowe oraz (ii) kymografie tych wydarzeń (ii). Reprezentatywne dane z (B) minimalnie uszkodzonym substratem DNA w porównaniu do (C) bardziej uszkodzonego substratu DNA w (i) 5 min, (ii) 15 min i (iii) 60 min w jednym polu widzenia. Bardziej uszkodzone podłoże DNA nie generuje długich odcinków rozwijania, ponieważ CMG napotykają rany wcześniej, mimo podobnego poziomu aktywności rozwijania (podobna gęstość rosnących plam RPA po 5 minutach, co wskazuje na podobną efektywność ładowania/rozwijania CMG). Pole widzenia wynosi 512 x 512 pikseli (rozmiar piksela = 154,6 nm). 1% mocy lasera (488 nm) obrazowanie EGFP-RPA. Pasek skali pokazujący 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67212/67212fig06large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

W naszym laboratorium badamy molekularne mechanizmy replikacji eukariotycznego DNA. Chcemy zrozumieć dynamikę duplikacji genomu na poziomie pojedynczych cząsteczek. Wizualizujemy replikację DNA za pomocą wielu systemów, w tym oczyszczonych białek oraz ekstraktu pochodzącego z jaj Xenopus.Większość naszej wiedzy o replikacji DNA pochodzi z eksperymentów masowych, obrazowania komórek i biologii strukturalnej. Te metody są naprawdę potężne, ale często mają ograniczone możliwości przekazania nam dynamiki lub przejściowych zachowań poszczególnych białek. Dlatego techniki pojedynczych cząsteczek są naprawdę dobrze nadane do badania i dlatego ich zastosowanie rośnie w terenie.Nasz protokół wizualizacji na żywo rozwijania DNA przedstawia platformę, którą można budować i modyfikować, aby badać różne aspekty replikacji DNA. Może to lepiej zrozumieć molekularny mechanizm aktywności CMG w obecności wybranych składników rybosomu oraz stresu replikacyjnego. Aby zrozumieć złożone systemy działające podczas replikacji DNA, izolujemy kluczowe białka i wizualizujemy ich zachowanie w czasie rzeczywistym in vitro.Uzyskane przez nas wnioski przyczyniają się do pełniejszego obrazu replikacji DNA. Aby przygotować komórkę przepływową, przetnij pokrywę biotyny-PEG na pół. Przygotuj małe szklane kawałki, wytrawiając i trzaskując szklaną szkiełkę na kawałki o wymiarach około 2,4 centymetra na 1 centymetr.Używając wiertła diamentowego o średnicy 0,8 milimetra, wywierć dwa otwory w kawałkach szkła, odstępując od siebie o 1,4 milimetra. Sprawdź otwory, wkładając rurę wlotową lub wylotową. Wyciąłem taśmę dwustronną, o takim samym kształcie jak szklane elementy.Wyrównaj suwak na taśmie i przebij igłę przez każdy otwór, aby oznaczyć ich pozycję na tejpce. Używając żyletki, wytnij kanał obejmujący oba otwory. Wyczyść szklany kawałek acetonem.Wysusz szkło bibułką i połóż na czystej powierzchni. Następnie zdejmij jedną stronę taśmy klejącej i przyklej ją do szklanej części tak, aby oba otwory były całkowicie wewnątrz kanału. Używając końcówki pipety P1000, mocno naciskaj taśmę, aby uszczelnić ją na szklanym elementie.Zdejmij drugą stronę taśmy z obu szklanych elementów. Ułóż preparaty na czystej powierzchni tak, że lepka strona będzie skierowana do góry. Używając plastikowej pęsety, podnieś pół pokrywy biotynowo-PEG za krawędź i opuszcz funkcjonalną stronę PEG na klej.Naciśnij palcem okładkę, aby ją zabezpieczyć. Pocieraj powierzchnię pokrywy za pomocą końcówki pipety z umiarkowanym ciśnieniem, aby usunąć pęcherzyki powietrza. A potem przełącz komórkę przepływową.Dla każdej komórki przepływowej wytnij około 10 centymetrów rurek polietylenowych 20 i 60. Przetnij końcówkę rurki pod kątem mniejszym niż 45 stopni i włóż rurkę do otworów w zamku. Jeśli średnica otworu jest prawidłowa, rurka sama stoi w otworze.Dobrze wymieszaj składniki epoksydu. Użyj końcówki pipety P200, aby naniesać epoksyd wokół rurki w każdym szklanym kawałku. Pozostawić epoksyd do utwardzenia przez 30 do 60 minut.Na początek ułóż świeżo przygotowany filtrem sterylizowany bufor blokujący, 10x bufor reakcyjny jeden i dwa na platformie roboczej. Umieść otwarte rurki zawierające 2,5 mililitra buforu blokującego i 5 mililitrów ultraczystej wody w suszarce i odgazuj pod próżnią. Po 15 minutach zwolnij ciśnienie i usuń rurki.Umieść przygotowany zespół komórek przepływowych biotyny-PEG na stole mikroskopowym i zabezpiecz go masą klejącą na obu końcach. Podłącz rurkę wylotową ogniwa przepływowego z pompą strzykawkową za pomocą igły. Włącz podgrzewacz obiektywu na 30 stopni Celsjusza.Przymocuj jeden do dwóch mililitrów odgazowanej wody w rurce na osobnym kawałku kleju w pobliżu komory przepływowej. Włóż rurkę wlotową do rury aż do dna, a przez kanał przepuszczaj wodę. Zwiększ przepływ, aby usunąć wszelkie uwięzione bąbelki w pobliżu rury wlotowej.Dodaj 100 mikrolitrów odgazowanego buforu blokującego do aliquoty 20 mikrolitrów jednego miligramu na mililitr Streptavidin. Przymocuj otwartą rurkę do kleju masowego. Przełóż rurkę wlotową z wody do Streptavidyny i rozpocznij przepływ z prędkością 40 mikrolitrów na minutę przez dwie minuty.Po pięciu minutach spłukaj nadmiar Streptawidyny buforem blokującym. Przepływ w biotinylowanym DNA rozcieńczonym w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolów SYTOX Orange. Obraz za pomocą podglądu na żywo z laserem 532 nanometrów, aby obserwować DNA przyczepiającego się do powierzchni w czasie rzeczywistym.Po osiągnięciu pożądanej gęstości DNA na powierzchni, przepływ w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolowych SYTOX, aby wypłukać wolne DNA. Przepływ biotinylowanego przeciwciała antydigoksygeniny rozcieńczonego w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolowych SYTOX Orange. Usuń biotynowalne przeciwciało antydigoksygeniny oraz SYTOX Orange z buforem blokującym.Wpłynij 50 mikrolitrów mieszanki ATP-gamma-S do komórki przepływowej. Dodaj oczyszczoną helikazę CMG do około 100 nanomolowych końcowych stężeń w 30 mikrolitrach mieszanki ATP-gamma-S i przepływ z prędkością 20 mikrolitrów na minutę przez 20 mikrolitrów. Inkubuj przez 15 minut.Następnie przepływ w mieszance ATP RPA wynosi 40 mikrolitrów na minutę dla 80 mikrolitrów. Używając każdego lasera z ekspozycją od 50 do 100 milisekund, wizualizuj i rejestruj eGFP-RPA za pomocą lasera o średnicy 488 nanometrów. Następnie zdobyć CMG za pomocą lasera 640 nanometrów.Na koniec wizualizuj i pobierz DNA barwione pomarańczowo SYTOX za pomocą lasera o średnicy 532 nanometrów. Rozwijanie się helikazy CMG było widoczne przez liniowy wzrost żółtego traktu RPA w czasie, co wskazuje na rozwinięte nici DNA. Uszkodzenia DNA jednoniciowego zmniejszyły liczbę udanych przypadków rozwijania, co potwierdza mniejsza liczba pełnych śladów w danych.

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Tradycyjne eksperymenty z elektroforezą żelową (SGE) wymagają skomplikowanej aparatury i dużego zużycia chemikaliów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który opisuje tanią metodę separacji fragmentów DNA w krótkim czasie.

Śledzenie separacji fragmentów DNA w czasie rzeczywistym za pomocą smartfona

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Poznaj metodę wizualizacji rozwijania DNA w czasie rzeczywistym przez helikazę CMG z Drosophila melanogaster przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów replikacji DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Przeglądaj więcej filmów