Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

W naszym laboratorium badamy molekularne mechanizmy replikacji eukariotycznego DNA. Chcemy zrozumieć dynamikę duplikacji genomu na poziomie pojedynczych cząsteczek. Wizualizujemy replikację DNA za pomocą wielu systemów, w tym oczyszczonych białek oraz ekstraktu pochodzącego z jaj Xenopus.

Większość naszej wiedzy o replikacji DNA pochodzi z eksperymentów masowych, obrazowania komórek i biologii strukturalnej. Te metody są naprawdę potężne, ale często mają ograniczone możliwości przekazania nam dynamiki lub przejściowych zachowań poszczególnych białek. Dlatego techniki pojedynczych cząsteczek są naprawdę dobrze nadane do badania i dlatego ich zastosowanie rośnie w terenie.

Nasz protokół wizualizacji na żywo rozwijania DNA przedstawia platformę, którą można budować i modyfikować, aby badać różne aspekty replikacji DNA. Może to lepiej zrozumieć molekularny mechanizm aktywności CMG w obecności wybranych składników rybosomu oraz stresu replikacyjnego. Aby zrozumieć złożone systemy działające podczas replikacji DNA, izolujemy kluczowe białka i wizualizujemy ich zachowanie w czasie rzeczywistym in vitro.

Uzyskane przez nas wnioski przyczyniają się do pełniejszego obrazu replikacji DNA. Aby przygotować komórkę przepływową, przetnij pokrywę biotyny-PEG na pół. Przygotuj małe szklane kawałki, wytrawiając i trzaskując szklaną szkiełkę na kawałki o wymiarach około 2,4 centymetra na 1 centymetr.

Używając wiertła diamentowego o średnicy 0,8 milimetra, wywierć dwa otwory w kawałkach szkła, odstępując od siebie o 1,4 milimetra. Sprawdź otwory, wkładając rurę wlotową lub wylotową. Wyciąłem taśmę dwustronną, o takim samym kształcie jak szklane elementy.

Wyrównaj suwak na taśmie i przebij igłę przez każdy otwór, aby oznaczyć ich pozycję na tejpce. Używając żyletki, wytnij kanał obejmujący oba otwory. Wyczyść szklany kawałek acetonem.

Wysusz szkło bibułką i połóż na czystej powierzchni. Następnie zdejmij jedną stronę taśmy klejącej i przyklej ją do szklanej części tak, aby oba otwory były całkowicie wewnątrz kanału. Używając końcówki pipety P1000, mocno naciskaj taśmę, aby uszczelnić ją na szklanym elementie.

Zdejmij drugą stronę taśmy z obu szklanych elementów. Ułóż preparaty na czystej powierzchni tak, że lepka strona będzie skierowana do góry. Używając plastikowej pęsety, podnieś pół pokrywy biotynowo-PEG za krawędź i opuszcz funkcjonalną stronę PEG na klej.

Naciśnij palcem okładkę, aby ją zabezpieczyć. Pocieraj powierzchnię pokrywy za pomocą końcówki pipety z umiarkowanym ciśnieniem, aby usunąć pęcherzyki powietrza. A potem przełącz komórkę przepływową.

Dla każdej komórki przepływowej wytnij około 10 centymetrów rurek polietylenowych 20 i 60. Przetnij końcówkę rurki pod kątem mniejszym niż 45 stopni i włóż rurkę do otworów w zamku. Jeśli średnica otworu jest prawidłowa, rurka sama stoi w otworze.

Dobrze wymieszaj składniki epoksydu. Użyj końcówki pipety P200, aby naniesać epoksyd wokół rurki w każdym szklanym kawałku. Pozostawić epoksyd do utwardzenia przez 30 do 60 minut.

Na początek ułóż świeżo przygotowany filtrem sterylizowany bufor blokujący, 10x bufor reakcyjny jeden i dwa na platformie roboczej. Umieść otwarte rurki zawierające 2,5 mililitra buforu blokującego i 5 mililitrów ultraczystej wody w suszarce i odgazuj pod próżnią. Po 15 minutach zwolnij ciśnienie i usuń rurki.

Umieść przygotowany zespół komórek przepływowych biotyny-PEG na stole mikroskopowym i zabezpiecz go masą klejącą na obu końcach. Podłącz rurkę wylotową ogniwa przepływowego z pompą strzykawkową za pomocą igły. Włącz podgrzewacz obiektywu na 30 stopni Celsjusza.

Przymocuj jeden do dwóch mililitrów odgazowanej wody w rurce na osobnym kawałku kleju w pobliżu komory przepływowej. Włóż rurkę wlotową do rury aż do dna, a przez kanał przepuszczaj wodę. Zwiększ przepływ, aby usunąć wszelkie uwięzione bąbelki w pobliżu rury wlotowej.

Dodaj 100 mikrolitrów odgazowanego buforu blokującego do aliquoty 20 mikrolitrów jednego miligramu na mililitr Streptavidin. Przymocuj otwartą rurkę do kleju masowego. Przełóż rurkę wlotową z wody do Streptavidyny i rozpocznij przepływ z prędkością 40 mikrolitrów na minutę przez dwie minuty.

Po pięciu minutach spłukaj nadmiar Streptawidyny buforem blokującym. Przepływ w biotinylowanym DNA rozcieńczonym w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolów SYTOX Orange. Obraz za pomocą podglądu na żywo z laserem 532 nanometrów, aby obserwować DNA przyczepiającego się do powierzchni w czasie rzeczywistym.

Po osiągnięciu pożądanej gęstości DNA na powierzchni, przepływ w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolowych SYTOX, aby wypłukać wolne DNA. Przepływ biotinylowanego przeciwciała antydigoksygeniny rozcieńczonego w buforze blokującym zawierającym 25 nanomolowych SYTOX Orange. Usuń biotynowalne przeciwciało antydigoksygeniny oraz SYTOX Orange z buforem blokującym.

Wpłynij 50 mikrolitrów mieszanki ATP-gamma-S do komórki przepływowej. Dodaj oczyszczoną helikazę CMG do około 100 nanomolowych końcowych stężeń w 30 mikrolitrach mieszanki ATP-gamma-S i przepływ z prędkością 20 mikrolitrów na minutę przez 20 mikrolitrów. Inkubuj przez 15 minut.

Następnie przepływ w mieszance ATP RPA wynosi 40 mikrolitrów na minutę dla 80 mikrolitrów. Używając każdego lasera z ekspozycją od 50 do 100 milisekund, wizualizuj i rejestruj eGFP-RPA za pomocą lasera o średnicy 488 nanometrów. Następnie zdobyć CMG za pomocą lasera 640 nanometrów.

Na koniec wizualizuj i pobierz DNA barwione pomarańczowo SYTOX za pomocą lasera o średnicy 532 nanometrów. Rozwijanie się helikazy CMG było widoczne przez liniowy wzrost żółtego traktu RPA w czasie, co wskazuje na rozwinięte nici DNA. Uszkodzenia DNA jednoniciowego zmniejszyły liczbę udanych przypadków rozwijania, co potwierdza mniejsza liczba pełnych śladów w danych.