Name: Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę tworzenia wielogatunkowego modelu biofilmu dla patogenów mukowiscydozy z użyciem Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Technika umożliwia szybkie testowanie leków przeciwbakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Biofilms Innovation Centre (NBIC), które jest Centrum Innowacji i Wiedzy finansowane przez Radę Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych, Innovate UK i Hartree Centre [Nagrody BB/R012415/1 i BB/X002950/1] oraz przez UK CF Trust i USA CF Foundation Strategic Research Centre: 'Oparte na dowodach ramy przedkliniczne dla rozwoju terapii przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie' (PIPE-CF) [Nagroda SRC022].

1. Przygotowanie syntetycznego środka do mukowiscydozy media-2 (SCFM2) i płytek
<ol>
	<li>Przygotuj SCFM2 zgodnie z recepturą opisaną w Palmer et al.16 w butelce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 500 ml w stężeniu 2x z kilkoma modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Zważyć i przygotować zapasy zgodnie z tabelą 1. Przygotować zapasy aminokwasów zgodnie z tabelą 2.</li>
		<li>Odważyć 5 g mucyny (z żołądka świni (typ II)) i 600 mg eDNA (z nasienia łososia) w 100 ml dH2O w butelce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 200 ml. Mieszać w temperaturze 4 °C przez noc przed sterylizacją w autoklawie.</li>
		<li>Do wysterylizowanej butelki o pojemności 500 ml dodaj 0,54 g glukozy, 6,06 g NaCl i 2,228 g KCl. Dodaj po 10 ml każdego z bulionów przygotowanych w kroku 1.1.1. Doprowadzić pH do 6,9 za pomocą 1 M NaOH lub HCl.</li>
		<li>Dodać 10 ml dH2O, a następnie 10 ml 0,175 M CaCl2 i 0,0606 M MgCl2. Przygotuj i dodaj 10 ml 0,93 M kwasu L-mlekowego. Bezpośrednio przed użyciem dodać 10 ml 0,36 mM Fe(III)SO47H2O</li>
		<li>Filtruj wysterylizuj SCFM2 za pomocą jednostki filtrującej i pompy próżniowej, a następnie dodaj autoklawowaną mucynę i eDNA. 
		UWAGA: Przygotowany SCFM2 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płytki agarowe SCFM2 zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Podgrzej 25 ml 2x SCFM2 w probówce o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C przed zmieszaniem z 25 ml wstępnie stopionego 3% (w/v) agaru technicznego, co daje mieszaninę 1x SCFM2 i 1,5% (w/v) agaru technicznego.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej przenieść 5 ml mieszaniny do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
		<li>Przygotuj taką samą liczbę krążków poliwęglanu o średnicy 13 mm i wielkości porów 0,2 μm, umieszczając je na dnie szalki Petriego i stosując UV-C przez 600 s przy długości fali 254 nm i częstotliwości 60 Hz. Odwróć krążki i powtórz procedurę UV-C.</li>
		<li>Po związaniu 1x SCFM2-1,5% (w/v) agaru technicznego, użyj sterylnych kleszczyków, aby dodać pojedynczy krążek poliwęglanowy do powierzchni każdej studzienki płytki 6-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii do infekcji
<ol>
	<li>Przed ustawieniem modelu należy przygotować płytkę agarową na wymagane szczepy bakterii i grzybów zgodnie ze standardowym agarem używanym w laboratorium dla P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 i C. albicans SC5314 (np. bulion lizogeniczny z agarem 1,2% (w/v) dla bakterii i agarem z dekstrozą Sabouraud dla C. albicans). 
UWAGA: Aby ustalić model, użyto specyficznych laboratoryjnych szczepów referencyjnych. Jednak model ten był również stosowany w przypadku innych szczepów, w tym izolatów klinicznych, z pewnymi modyfikacjami, takimi jak wydłużenie czasu tworzenia się biofilmu przed leczeniem wolniej rosnących szczepów.</li>
	<li>Użyj pętli inokulacyjnej o pojemności 1 μl, aby wybrać pojedynczą kolonię każdego mikroorganizmu, aby zaszczepić 5 ml standardowych laboratoryjnych płynnych pożywek (np. bulion lizogeniczny dla P. aeruginosa, S. aureus i dekstroza peptonu drożdżowego (YPD) dla C. albicans). Inkubuj te kultury, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego przy 200 obr./min, 37 °C dla bakterii i 200 obr./min, 30 °C dla C. albicans. 
	UWAGA: Napowietrzanie będzie się różnić w zależności od inkubatora z wytrząsaniem i promienia obrotu</li>
</ol>
3. Konfiguracja modelu interfejsu stałego powietrza
UWAGA: Ogólny schemat modelu można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym 1.
<ol>
	<li>Przenieś 1 ml każdej płynnej kultury do oddzielnej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj przez 2 minuty przy 8 000 x g w celu osadzenia bakterii/grzybów. Wykonaj ten i wszystkie poniższe etapy wirowania w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić granulki w 1 ml PBS przed ponownym odwirowaniem przez 2 minuty przy 8 000 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant jak poprzednio i ponownie zawiesić granulki w 1 ml PBS. Rozcieńczyć zawieszone komórki P. aeruginosa i S. aureus w stosunku 1:10 w PBS i zmierzyć gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm.</li>
	<li>Dostosować umyte próbki do 1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w oparciu o uprzednią walidację, że OD600 0,05 dla P. aeruginosa i 0,1 dla S. aureus jest równoważne 1 x 108 CFU/ml.</li>
	<li>W przypadku C. albicans rozcieńczyć umyte próbki w stosunku 1:100 w PBS, dodać po 10 μl każdej z nich do dwóch oddzielnych komór hemocytometru i użyć ustalonych wymiarów komory i rozcieńczenia użytego do obliczenia CFU/ml. Korzystając z ulepszonego hemocytometru Neubauera, obliczenia będą następujące: 
	Liczba komórek = średnia liczba komórek × 10 000 / (współczynnik rozcieńczenia)</li>
	<li>Obliczone jtk reprezentują C. albicans CFU/ml we wstępnie rozcieńczonej próbce. Dostosować próbkę C. albicans do 1 x 108 jtk/ml w PBS, tak jak w przypadku kultur bakteryjnych.</li>
	<li>Aby przygotować inokulum do dodania do biofilmu, należy dostosować inokulum P. aeruginosa do 1 x 104 CFU/ml (2x 100-krotne rozcieńczenia), C. albicans do 1 x 105 CFU/ml (100-krotne rozcieńczenie, a następnie 10-krotne rozcieńczenie) i na koniec S. aureus do 1 x 106 CFU/ml (100-krotne rozcieńczenie) za pomocą PBS.</li>
	<li>W przypadku biofilmów jednogatunkowych dodać 10 μl rozcieńczonego pożądanego drobnoustroju do środka krążka poliwęglanowego uprzednio umieszczonego na sześciodołkowych płytkach 1x SCFM2-1,5 % z agarem technicznym i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przed poddaniem działaniu lub przerwaniem.</li>
	<li>W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych dodać 10 μl każdego S. aureus i C. albicans jeden na drugi na tym samym krążku. Inkubować zaszczepiony krążek statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Kolejność, w jakiej dodawane są inokulum S. aureus i C. albicans, nie wpływa na rozwój modelu i daje takie same wyniki.</li>
	<li>Następnie przenieś krążki poliwęglanowe na świeże 1x SCFM2-1,5% płytki z agarem technicznym za pomocą sterylnych kleszczyków i dodaj 10 μl rozcieńczenia 1 x 104 CFU/ml P. aeruginosa na wierzch wcześniej ustalonego biofilmu S. aureus - C. albicans. Inkubować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: P. aeruginosa dodaje się 24 godziny po S. aureus i C. albicans, aby odzwierciedlić kolejność, w jakiej organizmy te często kolonizują płuca mukowiscydozy u osób z mukowiscydozą. Zapobiega to również wyrastaniu P. aeruginosa z pozostałych dwóch mikroorganizmów. Po dodaniu P. aeruginosa biofilm może być hodowany dłużej niż 24 godziny; Jednak krążek poliwęglanu z biofilmem musi być przenoszony na świeże podłoże co 24 godziny. Przed rozerwaniem biofilmy można wykorzystać do mikroskopii przy użyciu szczepów, które wyrażają białka fluorescencyjne, barwniki fluorescencyjne lub przeciwciała specyficzne dla szczepu/drobnoustroju. Warto jednak zauważyć, że niektóre barwniki plamią krążek poliwęglanowy.</li>
</ol>
4. Przerwanie biofilmu
<ol>
	<li>Dodaj kulki ceramiczne o średnicy 2,8 mm do płytek i usieciuj płytki promieniami UV, jak opisano w kroku 1.3. Dodaj 5 kulek ceramicznych do sterylnej probówki homogenizatora o pojemności 2 ml za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy. Następnie odpipetować 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki homogenizacyjnej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Rurki wirować przez co najmniej 10 s lub do momentu, gdy biofilm zostanie usunięty z krążka poliwęglanowego, zgodnie z oględzinami, w którym to momencie należy usunąć krążek z poliwęglanu.</li>
	<li>Umieść probówki z kulkami w homogenizatorze i ubijaj 2x przez 10 s z prędkością 6 m/s z 10-sekundowym odstępem między uderzeniami. 
	UWAGA: Ta kombinacja kulek, czasu ubijania i użycia homogenizatora powoduje wystarczające rozerwanie biofilmu przy minimalnej lizie, jak określono za pomocą mikroskopii i jednostek tworzących kolonie. Może się to różnić w zależności od konkretnego użytego ubijaka do koralików.</li>
	<li>Wlać uszkodzony biofilm z probówki homogenizatora do 7 ml biżu zawierającego 4 ml PBS, uzyskując końcową objętość 5 ml.</li>
	<li>Upewnij się, że cały płyn z probówek homogenizatora został przeniesiony do biżu, odwirowując probówki o sile 8 000 x g przez 2 minuty i przenosząc pozostałą ciecz do 7 ml bijou. 
	UWAGA: Z tych 5 ml uszkodzonego biofilmu można przeprowadzić szereg testów, ale kluczowe jest, aby pamiętać o rozcieńczeniu PBS biofilmu o pojemności 1 ml do końcowej objętości 5 ml.</li>
</ol>
5. Badanie aktywności metabolicznej
<ol>
	<li>Dodać 200 μl uszkodzonego biofilmu z kroku 4 powyżej do czarnej 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem. Następnie dodać 10 μl 0,02% (w/v) roztworu rezazuryny.</li>
	<li>Inkubować biofilm potraktowany resazuryną za pomocą czytnika płytek i odczytać aktywność metaboliczną. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, stosując wytrząsanie orbitalne co 30 minut przez 10 s przy prędkości 200 obr./min przed wykonaniem jakichkolwiek odczytów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję, stosując wzbudzenie 540 nm i emisję 590 nm. Powtarzaj ten 30-minutowy cykl przez 4 godziny za pomocą czytnika płytek. 
	UWAGA: Stosuje się 4-godzinny punkt czasowy, ponieważ zapewnia on wyraźniejsze różnice między próbkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu substancji oraz między próbkami o różnych stężeniach antybiotyków.</li>
</ol>
6. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe
<ol>
	<li>Aby przetestować tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe standardowych antybiotyków, należy rozpuścić wybrane antybiotyki w odpowiednim rozpuszczalniku i dodać go do 1x SCFM2-1,5% (w/v) technicznego podłoża agarowego, gdy jest jeszcze płynny, przed przeniesieniem 5 ml do każdej studzienki płytki sześciodołkowej. Po związaniu przenieś biofilm wyhodowany na krążku poliwęglanowym na wierzch pożywki zawierającej antybiotyk za pomocą sterylnych kleszczyków i dodaj 10 μl kropli o odpowiednim stężeniu antybiotyku na wierzch biofilmu. 
	UWAGA: W tym badaniu zastosowano 2-logarytmiczne seryjne rozcieńczenie między 64 μg/ml a 0,125 μg/ml meropenemu i tobramycyny, aby odzwierciedlić klinicznie istotne stężenia. Podawanie antybiotyków lub innych środków przeciwbakteryjnych/przeciwzjadliwych wyłącznie na wierzch biofilmu jest wystarczające, ponieważ zaobserwowano podobne reakcje po dodaniu zarówno do pożywki, jak i do biofilmu.</li>
	<li>Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C z poddaniem działaniu substancji, należy zobrazować biofilmy i rozbić, jak opisano w kroku 4.</li>
	<li>Z 5 ml zakłóconej hodowli pobrać podwielokrotność i przeprowadzić 10-krotne seryjne rozcieńczenie za pomocą PBS. Umieść 10 μl plamek w trzech egzemplarzach na agarze w celu określenia jednostek tworzących kolonie za pomocą metody Milesa i Misry30. 
	UWAGA: Objętość dodana do płytek agarowych wpłynie na granicę wykrywalności, większe objętości zmniejszą granicę wykrywalności, ale wymagają większej ilości próbek i płytek agarowych.</li>
	<li>W przypadku biofilmów jednogatunkowych P. aeruginosa i S. aureus należy umieścić smugi na płytkach agarowych LB, a C. albicans na agarze SDA.</li>
	<li>W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych należy umieścić podwielokrotności na trzech różnych selektywnych pożywkach zawierających antybiotyki, aby wyizolować każdy z trzech gatunków i umożliwić oznaczenie CFU. Obejmuje to agar do izolacji Pseudomonas i agar z solą mannitolu zawierający nystatynę w stężeniu 10 μg/ml w celu wyizolowania odpowiednio P. aeruginosa i S. aureus oraz agar dekstrozowy Sabouraud z tetracykliną w stężeniu 125 μg/ml w celu wyizolowania C. albicans. Inkubować płytki S. aureus w temperaturze 37 °C przez noc, a płytki P. aeruginosa i C. albicans w temperaturze 30 °C. 
	UWAGA: Inkubować płytki P. aeruginosa w temperaturze 30 °C, aby zminimalizować przerost kolonii i zmniejszyć rój.</li>
</ol>

Adaptable CF Model for Antimicrobial Testing and Microbial Dynamics Analysis

<ol><li>2021 Cf foundation patient registry highlights report. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cysticfibrosis.msu.edu/index.php/welcome/news-and-events/39-2021-cf-foundation-patient-registry-highlights-report">https://cysticfibrosis.msu.edu/index.php/welcome/news-and-events/39-2021-cf-foundation-patient-registry-highlights-report</a> (2022).</li>
<li>Guo, J., Garratt, A., Hill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worldwide+rates+of+diagnosis+and+effective+treatment+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Worldwide rates of diagnosis and effective treatment for cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 21 (3), 456-462 (2022).</li>
<li>Mandal, V., Ghosh, N. N., Mitra, P. K., Mandal, S., Mandal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+a+broad-spectrum+antimicrobial+5-butyl-2-pyridine+carboxylic+acid+from+Aspergillus+fumigatus+nhf-01%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of a broad-spectrum antimicrobial 5-butyl-2-pyridine carboxylic acid from Aspergillus fumigatus nhf-01.</a> Sci Rep. 12 (1), 6006(2022).</li>
<li>Françoise, A., Héry-Arnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+in+cystic+fibrosis+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The microbiome in cystic fibrosis pulmonary disease.</a> Genes. 11 (5), 536(2020).</li>
<li>Grasemann, H., Ratjen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1693-1707 (2023).</li>
<li>Camus, L., Vandenesch, F., Moreau, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+genotype+to+phenotype%3A+Adaptations+of+pseudomonas+aeruginosa+to+the+cystic+fibrosis+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">From genotype to phenotype: Adaptations of pseudomonas aeruginosa to the cystic fibrosis environment.</a> Microb Genom. 7 (3), mgen000513(2021).</li>
<li>Rossi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+adaptation+and+evolution+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa adaptation and evolution in patients with cystic fibrosis.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (5), 331-342 (2021).</li>
<li>Flemming, H. -C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Grainha, T., Jorge, P., Alves, D., Lopes, S. P., Pereira, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+pseudomonas+aeruginosa+and+candida+albicans+communication+in+coinfection+scenarios%3A+Insights+through+network+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Unraveling pseudomonas aeruginosa and candida albicans communication in coinfection scenarios: Insights through network analysis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 550505(2020).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> Int J Antimicrob Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Lorusso, A. B., Carrara, J. A., Barroso, C. D. N., Tuon, F. F., Faoro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pumps+on+antimicrobial+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pumps on antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15779(2022).</li>
<li>Michaelis, C., Grohmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transfer+of+antibiotic+resistance+genes+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+.%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transfer of antibiotic resistance genes in biofilms.</a> Antibiotics .(Basel). 12 (2), 328(2023).</li>
<li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J Clin Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li>
<li>König, J., Schreiber, R., Voelcker, T., Mall, M., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+inhibits+ENaC+through+an+increase+in+the+intracellular+Cl-+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reps%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) inhibits ENaC through an increase in the intracellular Cl- concentration.</a> EMBO Reps. 2 (11), 1047-1051 (2001).</li>
<li>Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+sputum+supports+growth+and+cues+key+aspects+of+Pseudomonas+aeruginosa+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis sputum supports growth and cues key aspects of Pseudomonas aeruginosa physiology.</a> J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).</li>
<li>Valenza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+antimicrobial+susceptibility+of+microorganisms+isolated+from+sputa+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Prevalence and antimicrobial susceptibility of microorganisms isolated from sputa of patients with cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 7 (2), 123-127 (2008).</li>
<li>Alam, F., Catlow, D., Di Maio, A., Blair, J. M. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+enhances+meropenem+tolerance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+dual-species+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Candida albicans enhances meropenem tolerance of Pseudomonas aeruginosa in a dual-species biofilm.</a> J Antimicrob Chemother. 75 (4), 925-935 (2020).</li>
<li>Burmølle, M., Ren, D., Bjarnsholt, T., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+in+multispecies+biofilms%3A+Do+they+actually+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions in multispecies biofilms: Do they actually matter.</a> Trends Microbiol. 22 (2), 84-91 (2014).</li>
<li>Lories, B., Belpaire, T. E. R., Smeets, B., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+quenching+strategies+reduce+antibiotic+tolerance+in+polymicrobial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Competition quenching strategies reduce antibiotic tolerance in polymicrobial biofilms.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 23(2024).</li>
<li>Nabb, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymicrobial+interactions+induce+multidrug+tolerance+in+Staphylococcus+aureus+through+energy+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymicrobial interactions induce multidrug tolerance in Staphylococcus aureus through energy depletion.</a> Front Microbiol. 10, 2803(2019).</li>
<li>Cornforth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+transcriptome+during+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (22), E5125-E5134 (2018).</li>
<li>Wolter, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small-colony+variants+are+independently+associated+with+worse+lung+disease+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis.</a> Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).</li>
<li>Takagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+o-glycans+are+natural+inhibitors+of+Candida+albicans+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mucin o-glycans are natural inhibitors of Candida albicans pathogenicity.</a> Nat Chem Biol. 18 (7), 762-773 (2022).</li>
<li>Cinical and Laboratory Standard Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+dilution+susceptibility+tests+for+bacteria+that+grow+aerobically%22">Methods for dilution susceptibility tests for bacteria that grow aerobically</a>. 35 Tenth Edition, (2), (2015).</li>
<li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> J Mol Biol. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li>
<li>Macia, M. D., Rojo-Molinero, E., Oliver, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+susceptibility+testing+in+biofilm-growing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial susceptibility testing in biofilm-growing bacteria.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), 981-990 (2014).</li>
<li>Coenye, T., Goeres, D., Van Bambeke, F., Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+standardized+susceptibility+testing+for+microbial+biofilms+be+introduced+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Should standardized susceptibility testing for microbial biofilms be introduced in clinical practice.</a> Clin Microbiol Infect. 24 (6), 570-572 (2018).</li>
<li>Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+genome+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> J Hyg. 38 (6), 732-749 (1938).</li>
<li>Robertson, S. N., Romero, M., Fenn, S., Kohler Riedi, P. L., Cámara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+characterization%2C+and+evaluation+of+a+simple+polymicrobial+colony+biofilm+model+for+testing+of+antimicrobial+wound+dressings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development, characterization, and evaluation of a simple polymicrobial colony biofilm model for testing of antimicrobial wound dressings.</a> J Appl Microbiol. 135 (3), lxae042(2024).</li>
<li>Rumpf, C., Lange, J., Schwartbeck, B., Kahl, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+and+cystic+fibrosis-a+close+relationship.+What+can+we+learn+from+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus and cystic fibrosis-a close relationship. What can we learn from sequencing studies.</a> Pathogens. 10 (9), 1177(2021).</li>
<li>Tay, W. H., Chong, K. K. L., Kline, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymicrobial-host+interactions+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Polymicrobial-host interactions during infection.</a> J Mol Biol. 428 (17), 3355-3371 (2016).</li>
<li>Orazi, G., O'toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BIt+takes+a+village%26%2334%3B%3A+Mechanisms+underlying+antimicrobial+recalcitrance+of+polymicrobial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">&#34;It takes a village&#34;: Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms.</a> J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00519 (2019).</li>
<li>Arjes, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biofilm+colony+growth+supports+a+mutualism+involving+matrix+and+nutrient+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biofilm colony growth supports a mutualism involving matrix and nutrient sharing.</a> eLife. 10, e64145(2021).</li>
<li>Kasza, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciprofloxacin+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+conjugates+enhance+antibiofilm+activity+and+slow+the+development+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interf%22%5BJournal%5D)">Ciprofloxacin poly(β-amino ester) conjugates enhance antibiofilm activity and slow the development of resistance.</a> ACS Appl Mater Interf. 16 (5), 5412-5425 (2024).</li>
<li>Martin, I., Waters, V., Grasemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+targeting+bacterial+biofilms+in+cystic+fibrosis+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Approaches to targeting bacterial biofilms in cystic fibrosis airways.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2155(2021).</li>
</ol>

W odniesieniu do tej pracy nie stwierdza się konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj model biofilmu pozwala nam naśladować niektóre aspekty środowiska zakażenia płuc mukowiscydozą poprzez włączenie szeregu powszechnych interakcji wielodrobnoustrojowych w sposób bardziej przystępny niż obecnie stosowane metody testowania przeciwdrobnoustrojowego in vitro , takie jak reaktor CDC i model biofilmuLubbock 31. Jest to ważne, gdy szereg czynników, w tym właściwości fizyczne biofilmu, dostępność składników odżywczych i interakcje molekularne między gatunkami w biofilmie, może wpływać zarówno na aktywność środka przeciwdrobnoustrojowego, jak i na odpowiedź drobnoustrojów na środek przeciwdrobnoustrojowy21. Uwzględniając te czynniki, byliśmy w stanie opracować wysoce wszechstronny model, który może dokładniej umożliwić przewidywanie wyników leczenia przeciwdrobnoustrojowego niż obecne modele, które nie uwzględniają wyżej wymienionych czynników.
P. aeruginosa, S. aureus i C. albicans zostały wybrane jako reprezentatywne Gram-dodatnie, Gram-ujemne i grzyby powszechnie izolowane w CF32. Udało nam się jednak również wykazać, że model ten może być stosowany w przypadku szeregu innych drobnoustrojów istotnych dla mukowiscydozy, w tym Burkholderia cenocepacia, Burkholderia multivorans, Aspergillus fumigatus, a obecnie jest dostosowywany do stosowania z bakteriami beztlenowymi, takimi jak Prevotella melaninogenica. Świadczy to o wszechstronności modelu, ponieważ można w nim uwzględnić szeroką gamę drobnoustrojów, co podkreśla zdolność adaptacyjną tego modelu do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko szerokiej gamie patogenów mikrobiologicznych. Model można również łatwo dostosować do szeregu warunków środowiskowych w celu bardziej spersonalizowanych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, w tym zastąpienia SCFM2 plwociną od pacjenta.
Zasadnicze znaczenie ma również uwzględnienie modeli biofilmu wielodrobnoustrojowego do testowania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ mogą one wypełnić istniejącą lukę w procesie opracowywania środków przeciwdrobnoustrojowych przed ich zastosowaniem w badaniach na zwierzętach lub ludziach33,34. Jednocześnie model utrzymuje stosunkowo wysoką przepustowość i pozwala na uzyskanie szeregu wyników istotnych zarówno dla przemysłu, jak i badań.
Chociaż w tym artykule dotyczącym metod przedstawiliśmy tylko przykłady CFU i aktywności metabolicznej, wykazaliśmy również użyteczność modelu w analizie egzometabolomu biofilmu przy użyciu spektrometrii mas do ekstrakcji cieczą (LESA). Pozwala to na zbadanie niektórych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tolerancji na środki przeciwdrobnoustrojowe35. Oprócz tych innych wyników zademonstrowaliśmy również wykorzystanie tego modelu do testowania nowych systemów dostarczania środków przeciwdrobnoustrojowych. Należą do nich koniugaty polimer-cyprofloksacyna w celu zwiększenia penetracji tego antybiotyku w biofilmie, jednocześnie zwiększając jego aktywność i zmniejszając rozwój oporności36.
Kluczowe kroki i zagadnienia Ważne jest, aby zachować sterylność, zwłaszcza podczas produkcji SCFM2 i pożywki, ponieważ zanieczyszczenie może spowodować wprowadzenie gatunków niewystępujących naturalnie, co może zakłócić wyniki. Różne szczepy tego samego drobnoustroju i różne drobnoustroje mogą wymagać różnych warunków środowiskowych do wzrostu lub mogą mieć różną charakterystykę wzrostu. Dlatego model musi zostać zoptymalizowany przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów wrażliwości na antybiotyki. Zalecamy przeprowadzenie małego badania pilotażowego trwającego 24 godziny i 48 godzin dla monogatunków i biofilmu wielodrobnoustrojowego w celu oceny wzrostu w standardowych warunkach modelowych. Odkryliśmy, że różne szczepy P. aeruginosa i pewne stężenia antybiotyków mogą indukować roj się od krążka poliwęglanowego. Można to łatwo przezwyciężyć, stosując dyski o większych rozmiarach, które są dostępne na rynku. Rozbijanie biofilmu może również wymagać optymalizacji w zależności od ubijaka do kulek i zastosowanych mikroorganizmów. Zoptymalizowaliśmy metodę przerywania, określając CFU/ml znanej próbki przed i po ubiciu ściegu. Wykorzystaliśmy również mikroskopię do wizualizacji próbek uderzeń koralików, aby zobrazować, jak dobrze biofilm został przerwany.
Jednym z ograniczeń tego modelu biofilmu naśladującego mukowiscydozę jest przyczepienie się do stałej powierzchni zawierającej poliwęglan, który nie znajduje się w płucach mukowiscydozy, a nie jest swobodnie unoszącym się agregatem w plwocinie mukowiscydozy37 . Jednak przedstawiony tutaj model stałego agaru wyklucza potrzebę płukania biofilmów w celu usunięcia drobnoustrojów planktonowych i zapewnia, że wyniki obejmują tylko drobnoustroje pochodzące z biofilmu, a nie mieszaną hodowlę biofilmu planktonowego. Odkryliśmy również, że przenikanie niektórych antybiotyków do głębszych obszarów tego modelu biofilmu może być zmniejszone, a zastosowanie DNazy może być wymagane do zmiany reologii macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejszenia oddziaływań elektrostatycznych z eDNA.
Uważamy, że model ten doskonale nadaje się do testów przeciwdrobnoustrojowych ze względu na jego wszechstronność, zdolność adaptacji i uwzględnienie czynników środowiskowych, których wiele istniejących modeli nie bierze pod uwagę. Jego zastosowanie w badaniach podstawowych i przedklinicznych testach wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe może zapewnić bardziej istotne klinicznie podejście do AST próbek klinicznych i opracowania nowych środków terapeutycznych.

Mukowiscydoza (CF) to choroba genetyczna, która dotyka ponad 11 000 osób w Wielkiej Brytanii i 162 000 osób na całym świecie1,2. Chociaż mukowiscydoza jest chorobą wielonarządową, kluczowym objawem doświadczanym przez osoby z mukowiscydozą (pwCF) jest tworzenie się nienormalnie gęstego, odwodnionego śluzu w drogach oddechowych3. To, wraz ze zmniejszonym biciem rzęsek, może zwiększyć kolonizację płuc przez szeroką gamę bakterii, grzybów, wirusów i archeonów4,5. Pomimo tego, że płuca z mukowiscydozą zapewniają warunki i selektywne naciski w celu ograniczenia wzrostu i przetrwania mikroorganizmów, bakterie takie jak Pseudomonas aeruginosa są wysoce przystosowane do tych trudnych środowisk6. Pozwala to zarówno na kolonizację, jak i przetrwanie, co skutkuje powstawaniem uporczywych przewlekłych infekcji7.
Wiele mikrobów, które powodują te przewlekłe infekcje, robi to za pomocą fenotypowego przejścia od początkowego planktonu do biofilmu, albo w formie przytwierdzonej powierzchni, albo w formie agregatów7. Te biofilmy charakteryzują się ciasno upakowanymi zbiorowiskami bakteryjnymi otoczonymi matrycą egzopolisacharydową (EPS) składającą się z różnych składników, w tym polisacharydów, białek, lipidów i środowiskowego DNA (eDNA)8. Ta matryca jest wspólną cechą mikroorganizmów; Jednak jego skład może się różnić. Na przykład głównymi składnikami polisacharydowymi macierzy bakteryjnej P. aeruginosa są Psl, Pel i alginian, w przeciwieństwie do grzybów Candida albicans, których głównymi składnikami matrycy polisacharydowej są mannany i glukany9. W biofilmach jednogatunkowych matryca ta może znacznie wpływać na tolerancję antybiotyków w porównaniu z planktonem, zmniejszając przenikanie antybiotyków do biofilmu, zmniejszając ich skuteczność10. Styl wzrostu biofilmu indukuje również tworzenie trwałych komórek o zmniejszonej aktywności metabolicznej w porównaniu z ich planktonowymi odpowiednikami, a tym samym dodatkowo zmniejsza podatność na antybiotyki11. Ten styl wzrostu charakteryzuje się również regulacją w górę niektórych mechanizmów oporności na antybiotyki, takich jak pompy wypływowe i te wymagane do horyzontalnego transferu genów, umożliwiając wymianę genów oporności11,12,13. Oprócz tego środowisko chorobowe gospodarza ma duży wpływ na fizjologię drobnoustrojów i sposób, w jaki reagują one na antybiotyki. Obejmuje to zwiększoną mikroaerobiozę w gęstym śluzie, a także dostępność niestandardowych źródeł węgla, takich jak aminokwasy i eDNA, pochodzących od gospodarza lub pochodzących z mikrobiologicznej degradacji produktów płucnych14,15,16.
Te specyficzne interakcje są dodatkowo komplikowane przez polimikrobiologiczną naturę biofilmów, co wprowadza dodatkową warstwę złożoności ze złożonymi interakcjami nie tylko między bakteriami, ale także między bakteriami i grzybami. W porównaniu z biofilmami bakteryjnymi, mniej wiadomo na temat niektórych interakcji między biofilmami bakteryjnymi i grzybiczymi, mimo że C. albicans został wyizolowany od ponad 75% osób z mukowiscydozą15. Ogólnie rzecz biorąc, interakcje między C. albicans a bakteriami, takimi jak P. aeruginosa, są antagonistyczne, ale mogą prowadzić do bardziej przewlekłych i ciężkich infekcji18. Połączenie interakcji mikrobiologicznych, zarówno patogennych, jak i komensalnych, wraz z szeregiem czynników środowiskowych związanych z mukowiscydozą może ostatecznie skutkować zwiększoną tolerancją na antybiotyki19,20. Wiele z tych czynników nie jest często branych pod uwagę w przedklinicznych testach antybiotykowych, mimo że przypisuje się je zwiększonej tolerancji na antybiotyki w istniejących modelach21.
Te warunki są również trudne do podsumowania in vitro, w wyniku czego wiele modeli nie ma obecności specyficznych czynników indukujących tolerancję obecnych w pwCF, takich jak te zwiększające produkcję beta-laktamazy u P. aeruginosa22, indukcja małych wariantów kolonii u Staphylococcus aureus i hamowanie dzielenia wyrazów u C. albicans; wykazano, że wszystkie te czynniki występują w plwocinie CF23,24.
Istnieje zatem duża rozbieżność między warunkami stosowanymi w obecnych metodach testowania wrażliwości na antybiotyki, opartych na planktonowych lub agarowych kulturach hodowanych na standardowych podłożach, takich jak Mueller-Hinton z dyfuzją krążkową, Etest i testami mikrorozcieńczenia bulionu CLSI, a warunkami napotkanymi w środowisku gospodarza25. Często nie pozwala to na dokładne określenie wrażliwości na antybiotyki26. Problem ten dodatkowo komplikuje brak standaryzacji w testowaniu biofilmu przeciwdrobnoustrojowego, co utrudnia dokładne przełożenie skuteczności przeciwdrobnoustrojowej z laboratorium na klinikę27,28.
Model polimikrobiologiczny, który tutaj opracowaliśmy, wykazuje zwiększoną tolerancję Pseudomonas aeruginosa na szereg środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym meropenem i tobramycynę. Ilustruje to dużą różnicę między obecnymi testami przeciwdrobnoustrojowymi z wykorzystaniem biofilmów jednogatunkowych a modelem biofilmu wielodrobnoustrojowego opracowanym w tym badaniu w celu określenia minimalnych stężeń hamujących. Model ten utrzymuje również stosunkowo wysoką przepustowość i niski koszt, co jest pożądane w przypadku testów przeciwdrobnoustrojowych. Model może być również wykorzystany do zbadania wpływu terapii przeciwdrobnoustrojowej na dynamikę polidrobnoustrojów i ustalenia, czy dane leczenie może prowadzić do dominacji określonego patogenu, co umożliwia przewidywanie dalszych powikłań. Chociaż model ten pozwala na tworzenie złożonych biofilmów, jego tworzenie nie wymaga zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego i stanowi platformę dla szerokiego zakresu wyników klinicznych i badawczych.

<table><tbody><tr><td>1 &mikro; Pętle inokulacyjne L&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 mm 0,2 i mikro; M Rozmiar porów Krążki poliwęglanowe&nbsp;</td><td>Izopore&nbsp;</td><td>GTTP01300</td><td>Dostępne są również większe tarcze&nbsp;</td></tr><tr><td>Wzmocnione probówki 2 ml&nbsp;</td><td>Rybak termiczny&nbsp;</td><td></td><td></td>15545809</tr><tr><td>kulki ceramiczne o pojemności 2,5 ml&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>500 ml butelka Duran ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z305197</td><td>większych butelek dostępnych w większych pojemnościach pożądane są</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>Greiner</td><td>657165</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Bijou</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>129B</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>167008</td><td>do seryjnych rozcieńczeń w teście CFU</td></tr><tr><td>Płytki agarowe do przygotowania płytek z P. aerugnisa, S. aureus, i C. albicans</td><td></td><td></td><td>&nbsp;LB młynarz do P. aeruginosa i S. aureus i dekstrozy Sabouraud&nbsp; dla C. albicans&nbsp; Ubijak do kulek </td></tr> <tr><td>- pasuje do probówek 2 ml</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>15515799</td><td>Młynek do kulek Thermofisher 24</td></tr><tr><td>wirówka stołowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td>musi być zdolny do co najmniej 8000 x g</td></tr><tr><td>Czarne przezroczyste dno 96-dołkowe płytki</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Palnik Bunsena&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki do utylizacji skażonego sprzętu i materiałów zgodnie z przepisami BHP instytutu.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>woda dejonizowana&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eDNA&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>31149</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca&nbsp;</td><td>Marka rybacka&nbsp;</td><td>FB12566504</td><td>Wymienne w zależności od zastosowanej pompy próżniowej, ale muszą mieć wielkość porów 0,2 i mikro; m</td></tr><tr><td>Hemocytometr i szkiełko nakrywkowe</td><td>Hawksley&nbsp;</td>Hemocytometry <td>HC001</td><td>mogą różnić się rozmiarem i objętością. Dokładnie sprawdź i odpowiednio dostosuj obliczenia CFU&nbsp;</td></tr><tr><td>Rosół LB&nbsp;</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>1.46813</td><td></td></tr><tr><td>Agar z solą mannitolu&nbsp;</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>CM0085B</tr><tr><td>meropenem</td><td>abcr</td><td>Ab243429</td><td></td></tr><tr><td>Mucyna z żołądka świni Typ II</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>Milipory nystatyny</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>1003352658</tr><tr><td>szalki Petriego&nbsp;</td><td>SLS</td><td>SLS2000</td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar do izolacji Pseudomonas</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>17208</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa rezazuryny&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>199303</tr><tr><td>Agar dekstrozowy Sabouraud&nbsp;</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>CM0041</td><td></td></tr><tr><td>dobór kleszczy&nbsp;</td><td></td><td></td><td>kleszczyki z cienką końcówką i tkankowe z zębami do przenoszenia kulek ceramicznych</td></tr><tr><td>pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>wytrząsanie i inkubatory statyczne&nbsp;</td><td></td><td></td><td>musi być sterowany temperaturą</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Sparks</td><td>Tecan&nbsp;</td><td></td><td>W przypadku testu Resazuryny czytnik płytek do mikromiareczkowania musi być wyposażony w odpowiednie filtry lub być monochromatorem do wykrywania fluorescencji.</td></tr><tr><td>spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar techniczny (Agar Techniczny nr 2 )</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td>LP0012B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td>Środek sieciujący <td>UV T7660</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Spektrolina&nbsp;</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>pompa próżniowa/ kolba</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td></td><td></td>FB12566504</tr><tr><td>kąpiel wodna&nbsp;</td><td></td><td></td><td>musi być zdolny do utrzymania 55 stopni Celsjusza; </td></tr><tr><td>Bulion C YPD&nbsp;</td><td>Milipore&nbsp;</td><td>Y1375&nbsp;</td><td>Można kupić gotowe lub wykonane z podstawowych składników</td></tr></tbody></table>

opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

Istnieje szereg modeli biofilmu bakterii do testowania antybiotyków. Jednak wiele z nich ogranicza się do jednego wyniku eksperymentalnego, takiego jak jednostki tworzące kolonie lub aktywność metaboliczna. Co więcej, wiele modeli biofilmu nie odzwierciedla biologicznych i fizykochemicznych właściwości środowiska gospodarza człowieka. Jest to ważna kwestia w wielu schorzeniach, ale najbardziej zauważalna w mukowiscydozie (CF). Duża część osób z mukowiscydozą cierpi zarówno na przewlekłe, jak i okresowe infekcje, a testy wrażliwości na antybiotyki in vitro słabo korelują z wynikami leczenia pacjentów. Niektóre modele biofilmu zawierają pożywki związane z płucami mukowiscydozy, w tym syntetyczne naśladownictwo plwociny, ale nie uwzględniają wielomikrobiologicznej natury środowiska, która zmienia architekturę biofilmu, fizjologię i sposób, w jaki drobnoustroje reagują na leczenie. Opisany tutaj model biofilmu kolonii na granicy faz ciało stałe i powietrze jest wysoce elastyczny i obejmuje zarówno pożywki istotne dla mukowiscydozy, jak i kontekst polimikrobiologiczny. Model ten może być również wykorzystywany do średnioprzepustowych badań przesiewowych środków przeciwdrobnoustrojowych oraz do badania ich wpływu na dynamikę polidrobnoustrojów. Pomiary wyjściowe z modelu mogą obejmować jednostki tworzące kolonie, aktywność metaboliczną i analizę mikroskopii konfokalnej. Model można łatwo dostosować do różnych mikroorganizmów, mediów, temperatur i zmiennych warunków tlenowych i może być używany do testowania szerokiej gamy zabiegów chemicznych, biologicznych i fizycznych.

Prostota modelu biofilmu na granicy faz ciało stałe-powietrze umożliwia jednoczesne przesiewanie dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych w różnych, istotnych klinicznie warunkach. Model ten pozwala na przeprowadzenie w ciągu tygodnia oceny skuteczności antybiotyków z wykorzystaniem zliczeń CFU oraz testów metabolicznych zarówno w biofilmach monomikrobowych, jak i polimikrobowych. Ze względu na charakter modelu, umożliwia on również łatwą manipulację warunkami środowiskowymi, takimi jak zmiana składu pożywek oraz hodowla biofilmów w warunkach obniżonej zawartości tlenu lub w warunkach beztlenowych. Wykorzystując ten model, wykazaliśmy zmiany w tolerancji na dwa antybiotyki powszechnie stosowane u osób z CF pomiędzy P. aeruginosa hodowaną w biofilmach jednoproduktowych a polimikrobowych (Rycina 1). Równolegle byliśmy w stanie określić, w jaki sposób leczenie przeciwdrobnoustrojowe może wpływać na dynamikę populacji w obrębie biofilmów polimikrobowych (Rycina 2).
Aby przeprowadzić te eksperymenty, początkowy inokulum przygotowano zgodnie z powyższym protokołem, co doprowadziło do powstania stabilnych biofilmów jednoproduktowych oraz polimikrobowych z powtarzalnymi wartościami CFU/mL i niewielkimi odchyleniami standardowymi, określonymi za pomocą jednoczynnikowej lub dwuczynnikowej analizy ANOVA. Model ten wykazał również spójny wzrost i odzyskiwanie CFU, a także umożliwił połączenie tych klasycznych technik mikrobiologicznych z innymi metodami niewykorzystanymi w niniejszym badaniu, bez konieczności stosowania zaawansowanego przetwarzania. Należą do nich techniki obrazowania, takie jak barwienie żywe/martwe, wizualizacja macierzy oraz analiza molekularna, których inne modele trójwymiarowe nie oferują w tak przystępny sposób (Rycina 1)31. Należy zauważyć, że oczekiwane odchylenie standardowe dla CFU/mL wzrasta, gdy dane są prezentowane jako procent przeżywalności w porównaniu do CFU/mL (Rycina 1). Przy porównywaniu skuteczności leczenia antybiotykami w biofilmach jednoproduktowych i polimikrobowych odnotowano istotny wzrost wszystkich stężeń antybiotyków wymaganych do osiągnięcia 50% redukcji drobnoustrojów. Aby osiągnąć ten poziom redukcji w przypadku meropenemu i tobramycyny, konieczny był 2-log wzrost stężenia antybiotyku (Rycina 1). Zaobserwowano również ogólny wzrost przeżywalności P. aeruginosa w obecności S. aureus i C. albicans w biofilmie polimikrobowym po zastosowaniu 64 µg/mL tobramycyny, podczas gdy w przypadku meropenemu sytuacja była odwrotna.
Metoda stosowana do określania aktywności metabolicznej mierzy całkowitą aktywność całego polimikrobowego biofilmu, nie umożliwiając rozróżnienia indywidualnego wkładu każdego z gatunków. Z tego powodu, w celu zademonstrowania zastosowania testów aktywności metabolicznej dla tego modelu, przedstawiono jedynie zmiany metaboliczne w biofilmach jednowidowych. W przypadku biofilmów jednowidowych stwierdzono silną zależność między przeżywalnością P. aeruginosa a aktywnością metaboliczną zarówno dla meropenemu, jak i tobramycyny (Rycina 2). Wykorzystanie zarówno pomiaru aktywności metabolicznej, jak i liczby CFU z tych samych próbek umożliwia łatwą identyfikację efektów bakteriostatycznych i bakteriobójczych. W przypadku biofilmów polimikrobowych określenie aktywności metabolicznej może wskazać, w jaki sposób celowanie w jeden gatunek może indukować ogólny wzrost aktywności metabolicznej biofilmu, a tym samym potencjalnie zwiększyć wzrost mikrobiologiczny innych gatunków.
Chociaż CFU stanowią złoty standard w testach wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, w biofilmach polimikrobowych pozwalają one również na ocenę składu gatunkowego wewnątrz biofilmu. Poprzez traktowanie P. aeruginosa w biofilmach polimikrobowych, jesteśmy w stanie nie tylko wykazać zwiększoną wartość MBEC50 dla tego organizmu, ale także ustalić wpływ, jaki ma to na inne współizolowane gatunki (Rycina 3). Jest to widoczne na przykład w przypadku meropenemu (leku przeciwpseudomonasowego), gdzie redukcja P. aeruginosa jest powiązana ze wzrostem CFU S. aureus i C. albicans, w wyniku czego S. aureus staje się najliczniejszym organizmem po narażeniu na określone stężenia antybiotyku (Rycina 3A). Podkreśla to znaczenie uwzględnienia polimikrobowej natury biofilmu ze względu na potencjalny wzrost liczebności populacji innych gatunków chorobotwórczych podczas leczenia konkretnego patogenu.
<img alt="Wykresy analizy przeżywalności po zastosowaniu antybiotyków; wpływ stężenia meropenemu i tobramycyny na bakterie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zmienność tolerancji przeciwdrobnoustrojowej P. aeruginosa na meropenem i tobramycynę w biofilmach monomikrobowych i polimikrobowych hodowanych w modelu interfejsu ciało stałe-powietrze. P. aeruginosa PAO1 hodowaną w biofilmach monomikrobowych lub polimikrobowych z S. aureus i C. albicans namnażano przez 24 h w modelu interfejsu ciało stałe-powietrze na podłożu SCFM2. Biofilmy poddano działaniu szeregu stężeń (A) meropenemu lub (B) tobramycyny od 0,125 µg/mL do 64 µg/mL, wraz z kontrolą bez antybiotyku. Wyznaczono CFU/mL dla każdego biofilmu. CFU P. aeruginosa oznaczono w PIA i przeliczono na procent przeżywalności, przyjmując kontrolę negatywną za 100% przeżywalności. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych pochodzi z 3 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy aktywności metabolicznej w zależności od stężenia antybiotyku; meropenem, tobramycyna; analiza dawka-odpowiedź." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zmienność aktywności metabolicznej biofilmów P. aeruginosa w obecności meropenemu lub tobramycyny hodowanych w modelu interfejsu ciało stałe-powietrze. P. aeruginosa PAO1 tworzyły biofilmy na pożywce SCFM2 w modelu interfejsu ciało stałe-powietrze, a następnie dodawano szereg stężeń (A) meropenemu lub (B) tobramycyny od 0,125 µg/mL do 64 µg/mL wraz z kontrolą bez antybiotyku. Płytkę odczytywano fluorescencyjnie przy wzbudzeniu 540 nm i emisji 590 nm co 30 min. Procent aktywności metabolicznej obliczono, wyznaczając procent tej aktywności w każdej próbce traktowanej antybiotykiem w porównaniu do kontroli bez antybiotyku. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych pochodzi z 3 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe inhibicji wzrostu bakterii; wpływ meropenemu i tobramycyny na P. aeruginosa, S. aureus oraz C. albicans." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67213/67213fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ na całkowitą liczbę CFU P. aeruginosa, S. aureus oraz C. albicans wyizolowanych z polimikrobowego modelu interfejsu ciało stałe-powietrze po zastosowaniu leczenia przeciwdrobnoustrojowego. S. aureus i C. albicans hodowano na pożywce SCFM2 w modelu interfejsu ciało stałe-powietrze. Następnie dodano P. aeruginosa oraz stężenia od 0,125 µg/mL do 64 µg/mL (A) meropenemu lub (B) tobramycyny do biofilmy, wraz z kontrolą bez antybiotyku. Wyznaczono liczbę CFU/mL dla każdego biofilmu. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych pochodzi z 3 powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/67213fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Ustanowienie i schemat pracy modelu interfejsu ciało stałe-powietrze. Graficzna reprezentacja ustanawiania modelu interfejsu ciało stałe-powietrze, rozbijania biofilmu oraz wyników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67213/Supplementary%20figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

Nasze badania koncentrowały się na wykorzystaniu złożonych modeli wielodrobnoustrojowych w celu zrozumienia złożonych interakcji między drobnoustrojami w środowisku mukowiscydozy oraz tego, jak skutkuje to zwiększoną tolerancją na środki przeciwdrobnoustrojowe. Mamy nadzieję, że uda nam się wykorzystać tę wiedzę do opracowania nowatorskich interwencji terapeutycznych. Postępy w dziedzinie biofilmu są napędzane przez wizualizację w połączeniu z metodologiami kwantyfikacji oraz podejściami biofizycznymi.Obejmuje to techniki takie jak 3D OrbiSIMS, które nadają rozdzielczość przestrzenną w skali mikro i nano. Badania te mają na celu stworzenie modelu polimikrobiologicznego, który utrzymuje poziom złożoności, reprezentatywny dla tego, co obserwuje się w leczeniu antybiotykami u pacjentów z mukowiscydozą. Pozwoli to również na zwiększenie przepustowości, bardziej odpowiednie wyniki i możliwość dostosowania się do innych szczepów i warunków.Protokół ten zapewnia odpowiednie środowisko testowe dla patogenów mukowiscydozy. Jest solidny i ma stosunkowo wysoką przepustowość. Jest również podatny na wiele punktów końcowych, co pozwala na podejmowanie bardziej złożonych badań.Badania te wykazały, że środowisko istotne dla mukowiscydozy zmienia się i podatność drobnoustrojów. Ponadto rodzaj obecnych grzybów może również zmieniać podatność Pseudomonas aeruginosa, co może mieć istotne znaczenie kliniczne. Na początek weź kultury Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans wyhodowane do fazy wykładniczej.Za pomocą mikropipety przenieś jeden mililitr każdej płynnej kultury do oddzielnej sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować probówki przez dwie minuty przy 8 000 x g, aby ogranulować bakterie lub grzyby. Następnie, za pomocą pipety, odessać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS.Rozcieńczyć zawieszone komórki Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus od 1 do 10 w PBS. Następnie za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną na długości fali 600 nanometrów. Po rozcieńczeniu umytych próbek Candida albicans w stosunku 1 do 100 w PBS, pipetować 10 mikrolitrów każdej próbki do dwóch oddzielnych komór hemocytometru.Następnie dostosuj próbkę Candida albicans do 1 x 10 do mocy ośmiu CFU na mililitr w PBS. Aby przygotować inokulum do dodania do biofilmu, należy dostosować inokulum Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans i Staphylococcus aureus za pomocą PBS. W przypadku biofilmów jednogatunkowych należy odpipetować 10 mikrolitrów rozcieńczonego drobnoustroju na środek krążka poliwęglanowego umieszczonego na 1,5% agarze technicznym SCFM2 w płytkach 6-dołkowych.Inkubować płytkę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed zabiegiem lub przerwaniem. W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych dodaj 10 mikrolitrów każdego Staphylococcus aureus i Candida albicans jeden na drugim na tym samym krążku poliwęglanowym. Inkubować zaszczepiony dysk statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji przy użyciu sterylnych kleszczy przenieś krążki poliwęglanu na świeże 1,5% techniczne płytki agarowe SCFM2. Dodaj 10 mikrolitrów 1 x 10 do mocy czterech CFU na mililitr rozcieńczenia Pseudomonas aeruginosa na wierzchu wcześniej ustalonego Staphylococcus aureus, biofilmu Candida albicans. Inkubować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Na początek weź biofilm kolonii stałych interfejsów powietrznych Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Dodaj ceramiczne koraliki o średnicy 2,8 milimetra do płytki i usieciuj płytkę promieniami UV. Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem przenieś pięć kulek ceramicznych do sterylnej dwumililitrowej probówki homogenizatora.Odpipetować jeden mililitr PBS do dwumililitrowej probówki homogenizującej. Wirować probówki przez co najmniej 10 sekund lub do momentu, gdy biofilm zostanie usunięty z krążka poliwęglanowego, zgodnie z ustaleniami oględzin. Po wyjęciu wyjmij krążek z poliwęglanu, a następnie umieść probówki z kulkami w homogenizatorze i ubijaj je dwa razy przez 10 sekund z prędkością sześciu metrów na sekundę z dziesięciosekundową przerwą między uderzeniami.Teraz wlej uszkodzony biofilm z probówki homogenizatora do siedmiomililitrowego biżu zawierającego cztery mililitry PBS, co daje końcową objętość pięciu mililitrów. Odwirować probówki homogenizatora o sile 8 000 x g przez dwie minuty. Następnie przenieś pozostały płyn do siedmiomililitrowego bijou, aby upewnić się, że cały płyn został przeniesiony.Dodać 200 mikrolitrów uszkodzonego biofilmu do przezroczystej, czarnej 96-dołkowej płytki, a następnie odpipetować 10 mikrolitrów 0,02% roztworu resazuryny do każdej studzienki. Inkubować biofilm potraktowany resazuryną w czytniku płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Stosuj wytrząsanie orbitalne co 30 minut przez 10 sekund przy 200 obr./min przed wykonaniem jakichkolwiek odczytów fluorescencyjnych.Zmierz fluorescencję za pomocą długości fali wzbudzenia 540 nanometrów i długości fali emisji 590 nanometrów. Biofilmy jednogatunkowe wymagały znacznie niższych stężeń meropenemu i tobramycyny, aby osiągnąć 50% zabijanie w porównaniu z biofilmami wielomikrobiologicznymi ze wzrostem stężenia antybiotyku o dwa logarytmy niezbędnym dla tych ostatnich. Przeżywalność Pseudomonas aeruginosa zwiększyła się w biofilmach wielodrobnoustrojowych przy 64 mikrogramach na mililitr tobramycyny, podczas gdy meropenem wykazał spadek przeżywalności w podobnych warunkach.W biofilmach jednogatunkowych zaobserwowano silną korelację między przeżywalnością Pseudomonas aeruginosa a jej aktywnością metaboliczną po leczeniu zarówno meropenamem, jak i tobramycyną.

development-polymicrobial-colony-biofilm-model-to-test-antimicrobials

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (Colon Ascendens Stent Peritonitis, CASP) jest wysoce ustandaryzowanym modelem polimikrobowej sepsy brzusznej u gryzoni. Niniejszy artykuł opisuje procedurę chirurgiczną CASP. Model CASP oraz jego warianty umożliwiają systematyczne badanie różnych zagadnień związanych z tematyką sepsy.

Zapalenie otrzewnej wywołane stentem w okrężnicy wstępującej (CASP) – standaryzowany model polimikrobowej sepsy brzusznej

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację zależnej od promotora IL-8 aktywacji stanu zapalnego w płucach myszy za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). To samo zwierzę może być poddawane BLI wielokrotnie przez okres do dwóch miesięcy od momentu dostarczenia konstruktu reporterowego lucyferazy.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Poznaj metodę tworzenia wielogatunkowego modelu biofilmu dla patogenów mukowiscydozy z użyciem Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Technika umożliwia szybkie testowanie leków przeciwbakteryjnych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Przeglądaj więcej filmów