Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Nasze badania koncentrowały się na wykorzystaniu złożonych modeli wielodrobnoustrojowych w celu zrozumienia złożonych interakcji między drobnoustrojami w środowisku mukowiscydozy oraz tego, jak skutkuje to zwiększoną tolerancją na środki przeciwdrobnoustrojowe. Mamy nadzieję, że uda nam się wykorzystać tę wiedzę do opracowania nowatorskich interwencji terapeutycznych. Postępy w dziedzinie biofilmu są napędzane przez wizualizację w połączeniu z metodologiami kwantyfikacji oraz podejściami biofizycznymi.

Obejmuje to techniki takie jak 3D OrbiSIMS, które nadają rozdzielczość przestrzenną w skali mikro i nano. Badania te mają na celu stworzenie modelu polimikrobiologicznego, który utrzymuje poziom złożoności, reprezentatywny dla tego, co obserwuje się w leczeniu antybiotykami u pacjentów z mukowiscydozą. Pozwoli to również na zwiększenie przepustowości, bardziej odpowiednie wyniki i możliwość dostosowania się do innych szczepów i warunków.

Protokół ten zapewnia odpowiednie środowisko testowe dla patogenów mukowiscydozy. Jest solidny i ma stosunkowo wysoką przepustowość. Jest również podatny na wiele punktów końcowych, co pozwala na podejmowanie bardziej złożonych badań.

Badania te wykazały, że środowisko istotne dla mukowiscydozy zmienia się i podatność drobnoustrojów. Ponadto rodzaj obecnych grzybów może również zmieniać podatność Pseudomonas aeruginosa, co może mieć istotne znaczenie kliniczne. Na początek weź kultury Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans wyhodowane do fazy wykładniczej.

Za pomocą mikropipety przenieś jeden mililitr każdej płynnej kultury do oddzielnej sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Wirować probówki przez dwie minuty przy 8 000 x g, aby ogranulować bakterie lub grzyby. Następnie, za pomocą pipety, odessać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS.

Rozcieńczyć zawieszone komórki Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus od 1 do 10 w PBS. Następnie za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną na długości fali 600 nanometrów. Po rozcieńczeniu umytych próbek Candida albicans w stosunku 1 do 100 w PBS, pipetować 10 mikrolitrów każdej próbki do dwóch oddzielnych komór hemocytometru.

Następnie dostosuj próbkę Candida albicans do 1 x 10 do mocy ośmiu CFU na mililitr w PBS. Aby przygotować inokulum do dodania do biofilmu, należy dostosować inokulum Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans i Staphylococcus aureus za pomocą PBS. W przypadku biofilmów jednogatunkowych należy odpipetować 10 mikrolitrów rozcieńczonego drobnoustroju na środek krążka poliwęglanowego umieszczonego na 1,5% agarze technicznym SCFM2 w płytkach 6-dołkowych.

Inkubować płytkę statycznie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed zabiegiem lub przerwaniem. W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych dodaj 10 mikrolitrów każdego Staphylococcus aureus i Candida albicans jeden na drugim na tym samym krążku poliwęglanowym. Inkubować zaszczepiony dysk statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przy użyciu sterylnych kleszczy przenieś krążki poliwęglanu na świeże 1,5% techniczne płytki agarowe SCFM2. Dodaj 10 mikrolitrów 1 x 10 do mocy czterech CFU na mililitr rozcieńczenia Pseudomonas aeruginosa na wierzchu wcześniej ustalonego Staphylococcus aureus, biofilmu Candida albicans. Inkubować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Na początek weź biofilm kolonii stałych interfejsów powietrznych Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Candida albicans. Dodaj ceramiczne koraliki o średnicy 2,8 milimetra do płytki i usieciuj płytkę promieniami UV. Za pomocą kleszczy sterylizowanych płomieniem przenieś pięć kulek ceramicznych do sterylnej dwumililitrowej probówki homogenizatora.

Odpipetować jeden mililitr PBS do dwumililitrowej probówki homogenizującej. Wirować probówki przez co najmniej 10 sekund lub do momentu, gdy biofilm zostanie usunięty z krążka poliwęglanowego, zgodnie z ustaleniami oględzin. Po wyjęciu wyjmij krążek z poliwęglanu, a następnie umieść probówki z kulkami w homogenizatorze i ubijaj je dwa razy przez 10 sekund z prędkością sześciu metrów na sekundę z dziesięciosekundową przerwą między uderzeniami.

Teraz wlej uszkodzony biofilm z probówki homogenizatora do siedmiomililitrowego biżu zawierającego cztery mililitry PBS, co daje końcową objętość pięciu mililitrów. Odwirować probówki homogenizatora o sile 8 000 x g przez dwie minuty. Następnie przenieś pozostały płyn do siedmiomililitrowego bijou, aby upewnić się, że cały płyn został przeniesiony.

Dodać 200 mikrolitrów uszkodzonego biofilmu do przezroczystej, czarnej 96-dołkowej płytki, a następnie odpipetować 10 mikrolitrów 0,02% roztworu resazuryny do każdej studzienki. Inkubować biofilm potraktowany resazuryną w czytniku płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Stosuj wytrząsanie orbitalne co 30 minut przez 10 sekund przy 200 obr./min przed wykonaniem jakichkolwiek odczytów fluorescencyjnych.

Zmierz fluorescencję za pomocą długości fali wzbudzenia 540 nanometrów i długości fali emisji 590 nanometrów. Biofilmy jednogatunkowe wymagały znacznie niższych stężeń meropenemu i tobramycyny, aby osiągnąć 50% zabijanie w porównaniu z biofilmami wielomikrobiologicznymi ze wzrostem stężenia antybiotyku o dwa logarytmy niezbędnym dla tych ostatnich. Przeżywalność Pseudomonas aeruginosa zwiększyła się w biofilmach wielodrobnoustrojowych przy 64 mikrogramach na mililitr tobramycyny, podczas gdy meropenem wykazał spadek przeżywalności w podobnych warunkach.

W biofilmach jednogatunkowych zaobserwowano silną korelację między przeżywalnością Pseudomonas aeruginosa a jej aktywnością metaboliczną po leczeniu zarówno meropenamem, jak i tobramycyną.