Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego
5 lipca 2024
Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.
Nasze laboratorium bada, w jaki sposób łączność komórkowa jest kształtowana w układzie nerwowym podczas rozwoju i regeneracji. Badamy, w jaki sposób sygnały środowiskowe wpływają na zachowanie neuronów, wykorzystując przeszczep komórek, aby sprawdzić, jak zmienia się ich zachowanie, gdy są umieszczane w różnych środowiskach genetycznych, przestrzennych lub czasowych. Chociaż przeszczep jest powszechny w zarodkach danio pręgowanego, zwykle wykonuje się go w stadiach blastuli i gastruli, kiedy komórki są w dużej mierze niezróżnicowane.
Jest to cenne dla generowania mozaik genetycznych, ale ogranicza zdolność techniki do badania, w jaki sposób dynamika sygnalizacji przestrzennej wpływa na rozwój poza tymi etapami. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na przeszczepienie komórek, w tym zróżnicowanych neuronów w zarodkach i larwach do co najmniej siedmiu dni po zapłodnieniu. Możemy przeszczepić tylko jedną komórkę o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz wykorzystać genetyczne znakowanie fluorescencyjne do długoterminowego śledzenia przeszczepionych komórek u zwierzęcia gospodarza.
Protokół ten pozwala nam zmieniać środowisko genetyczne, przestrzenne i czasowe komórek na wielu różnych etapach rozwoju, otwierając nowe możliwości badania zasad sygnalizacji stylu podczas rozwoju i regeneracji. Aby rozpocząć, nałóż prostokątny kontur przezroczystego lakieru do paznokci na szklane szkiełko. Przygotuj kilka takich szkiełek do przeszczepów.
Do zamontowania znieczulonego zwierzęcia użyj pipety Pasteura i pompy, aby przenieść go z RPT do niskotopliwej agarozy lub LMA. Następnie przenieś zwierzę w małej kropli LMA na szkiełko w obrębie konturu lakieru do paznokci. Zanim LMA zastygnie, użyj popychacza do zarodków, aby ustawić zwierzę pionowo tak, aby zamierzone miejsce wprowadzenia igły było po prawej stronie i pozwól agarozie w pełni zastygnąć przez około pięć minut.
Za pomocą skalpela przetnij prosty pionowy plasterek przez kroplę agarozy tuż po prawej stronie dosiadanego zwierzęcia. Zetrzyj luźną agarozę ze szkiełka. Za pomocą skalpela wytnij kliny z agarozy, aby odsłonić miejsce wkłucia igły.
Nałóż RPT na szkiełko, aż krople agarozy zostaną całkowicie zanurzone, a przygotowany szkiełko zamontuj na mikroskopie transplantacyjnym. Opuść obiektyw 40x, aż przebije się przez powierzchnię nośnika, a następnie podnieś go, aby ustawić ostrość na zwierzęciu dawcy. Następnie skoncentruj się na fluorescencyjnie znakowanych komórkach dawcy, które są przedmiotem zainteresowania.
Przesuń stolik w lewo, przygotowując się do zlokalizowania igły do przeszczepu. Aby rozpocząć, włóż mikropipetę do ściągacza do mikropipet i pociągnij igłę do mikroiniekcji. Dopasuj końcówkę igły do podziałów mikrometru stage pod lunetą sekcyjną.
Mając mikrometr jako wskazówkę pomiarową, użyj zaostrzonej pary kleszczyków, aby złamać igłę do rozmiaru otworu nieco większego niż średnica komórki. Za pomocą 50-mililitrowej strzykawki wyposażonej w napełniacz do pipet całkowicie napełnij igłę olejem mineralnym. W aparacie do przeszczepu obrócić trójdrożny kurek zatrzymujący tak, aby jego długie ramię było skierowane w stronę pompy mikrostrzykawkowej.
Wcisnąć tłok strzykawki zbiornika, aby wypłukać wszystkie pęcherzyki powietrza z przewodu hydraulicznego. Utrzymując lekki nacisk na tłok, obrócić trójdrożny kurek odcinający tak, aby długie ramię było teraz skierowane w stronę strzykawki z zbiornikiem. Następnie włóż igłę do uchwytu bez wprowadzania pęcherzyków powietrza.
Wyreguluj igłę tak, aby była skierowana bezpośrednio w lewo pod kątem od 10 do 15 stopni od poziomu. Korzystając z kursu i precyzyjnych mikromanipulatorów, manewruj końcówką igły pod obiektywem mikroskopu, aby ustawić ostrość. Jeśli płyn wpływa lub wypływa z końcówki igły, wyreguluj ciśnienie za pomocą pompki strzykawkowej, aż do zaobserwowania stabilnej menisku między olejem a RPT.
Jeśli pozostanie pęcherzyk oleju, przesuń igłę w prawo, aby wyjąć jej końcówkę z RPT, a następnie z powrotem w lewo, aby zmienić położenie. Przesuń stolik w prawo, aż zwierzę dawcy zostanie ponownie przyniesione do pola widzenia. Wyśrodkuj i skup się na komórkach, które mają zostać przeszczepione, wyrównując igłę z komórkami znajdującymi się na zewnątrz zwierzęcia.
Następnie należy wprowadzić igłę do zwierzęcia dawcy i w razie potrzeby ponownie ustabilizować menisk olejowy w końcówce igły za pomocą pompy mikrostrzykawkowej. Przyłożyć końcówkę igły do interesujących komórek i delikatnie odsysać za pomocą pompki mikrostrzykawkowej. Po pobraniu odpowiedniej ilości komórek należy wyjąć igłę od dawcy i ponownie ustabilizować materiał w końcówce igły.
Zmień położenie stołu montażowego, aby wyświetlić pierwsze zwierzę żywicielskie. Wyśrodkuj i skup się na obszarze, w którym mają zostać umieszczone komórki, i wyrównaj igłę z tym obszarem tuż na zewnątrz zwierzęcia. Następnie wbij igłę w zwierzę żywiciela i ponownie ustabilizuj menisk olejowy w końcówce igły.
Umieścić końcówkę igły w miejscu osadzania i delikatnie uciskać pompką mikrostrzykawkową, aż do uwolnienia z igły prawidłowej liczby komórek dawcy. Na koniec wyjmij igłę z hosta. Po 12 godzinach od przeszczepu udało się zaobserwować neuron dawcy w przedniej części jądra ruchowego błędnika gospodarza, wykazując oznaki zdrowych wypukłości neurytów.
Dwa dni po przeszczepie przeszczepiony neuron nie tylko pozostał prawidłowo ustawiony, ale także zaczął rozciągać nowy akson w kierunku czwartego łuku gardłowego, co wskazuje na udaną integrację z gospodarzem.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wysokorozdzielczej transplantacji komórek w embrionach i larwach danio pręgowanego, możliwy do zastosowania od 1 do 7 dni po zapłodnieniu. Technika ta umożliwia transplantację zróżnicowanych neuronów, co pozwala na badanie przestrzennych i czasowych dynamik sygnalizacji podczas rozwoju.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Wstęp
- Łączność komórkowa w układzie nerwowym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozwoju i regeneracji.
- Sygnały środowiskowe wpływają na zachowanie neuronów, co można badać za pomocą transplantacji komórek.
- Tradycyjne metody transplantacji są ograniczone do wczesnych etapów rozwoju.
- Celem niniejszego badania jest rozszerzenie zastosowania transplantacji na późniejsze etapy rozwoju danio pręgowanego.
Cel badania
- Opracowanie protokołu transplantacji komórek u danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju.
- Zbadanie wpływu środowiska przestrzennego i czasowego na zachowanie neuronów.
- Umożliwienie długoterminowego śledzenia transplantowanych komórek przy użyciu genetycznego znakowania fluorescencyjnego.
Zastosowane metody
- Transplantacja komórek do embrionów i larw danio pręgowanego.
- Wykorzystanie genetycznego znakowania fluorescencyjnego do śledzenia komórek.
- Wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa transplantacji.
- Zastosowanie protokołu od 1 do 7 dni po zapłodnieniu.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia pomyślną transplantację zróżnicowanych neuronów.
- Przeszczepione komórki mogą być śledzone w czasie w organizmie gospodarza, jakim jest danio pręgowany.
- Dynamikę przestrzenną i czasową można badać poza etapami blastuli i gastruli.
- Metoda ta pogłębia zrozumienie rozwoju i regeneracji układu nerwowego.
Wnioski
- Opracowany protokół rozszerza możliwości transplantacji komórek w badaniach nad danio pręgowanym.
- Dostarcza on wiedzy na temat wpływu czynników środowiskowych na zachowanie neuronów.
- Podejście to może ułatwić przyszłe badania nad łącznością i rozwojem neuronów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcza transplantacja komórek w embrionach i larwach danio pręgowanego umożliwia precyzyjną manipulację zmiennymi genetycznymi, przestrzennymi i czasowymi, co bezpośrednio wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów we wczesnej fazie odkrywania leków. Możliwość ta rozszerza okno eksperymentalne dla badań funkcjonalnych, pozwalając zespołom badawczo-rozwojowym na badanie losów komórek i dynamiki ich integracji poza stadiami niezróżnicowanymi. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną dla portfolio biologii rozwoju i regeneracji poprzez umożliwienie wiarygodnego, ilościowego śledzenia przeszczepionych komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie testowanie hipotez genetycznych i środowiskowych w żywym systemie kręgowców.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów poprzez manipulowanie kontekstem komórkowym na określonych etapach rozwoju.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację przestrzennych i czasowych efektów sygnalizacji na los komórki.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do późniejszych badań translacyjnych dzięki możliwości śledzenia linii komórkowych i integracji.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, oznakowane genetycznie populacje komórek do późniejszego screeningu fenotypowego.
- Standaryzuje procedury transplantacji w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników w różnych eksperymentach.
- Umożliwia skalowalne opracowywanie testów poprzez rozszerzenie transplantacji na zróżnicowane typy komórek oraz komórki progenitorowe.
- Wspiera wiarygodną ocenę perturbacji genetycznych lub wpływu związków chemicznych w kontrolowanym kontekście in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność z modelami istotnymi dla danej choroby poprzez umożliwienie transplantacji specyficznych podtypów neuronów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki długoterminowemu śledzeniu komórek i analizie ich integracji.
- Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez wyjaśnienie zachowania komórek w kontekstach regeneracyjnych i rozwojowych.
- Usprawnia odkrywanie translacyjnych biomarkerów dzięki możliwości precyzyjnej manipulacji i obserwacji losów komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół transplantacji łączy wczesny etap odkryć, identyfikację wiodących kandydatów oraz badania przedkliniczne, umożliwiając sterowaną hipotezami manipulację i śledzenie komórek in vivo od 1 do 7 dni po zapłodnieniu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie kontrolowanych niedopasowań genetycznych, przestrzennych i czasowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do porównywania integracji i zachowania komórek w różnych warunkach.
- Analityka: Dostarcza wysokorozdzielcze odczyty podłużne dzięki znakowaniu fluorescencyjnemu i obrazowaniu przeszczepionych komórek.
- Badania translacyjne: Ułatwia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie procesów regeneracyjnych i rozwojowych w systemie kręgowców.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy solidną, wielokrotnie wykorzystywalną platformę dla różnych typów komórek i pytań badawczych w biologii rozwoju i regeneracji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy transplantacji i śledzenia w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki wczesnemu wyjaśnieniu wyników losów komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów regeneracyjnych i rozwojowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z danio pręgowanym, mikroiniekcji oraz obrazowaniem żywych organizmów.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej oraz precyzyjnego sprzętu do mikromanipulacji.
- Wymaga standaryzacji protokołów transplantacji i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Może być konieczna adaptacja metody dla różnych typów komórek lub etapów rozwoju.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wymaganą biegłość techniczną oraz ograniczenia przepustowości w przypadku prac w rozdzielczości pojedynczych komórek.
