Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper
4 października 2024
System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.
Jesteśmy zainteresowani opracowaniem modeli chorób takich jak ALS, FTD i proteinopatia wieloukładowa, aby zrozumieć ich patologie molekularne. Jednym z modeli, których używamy, jest Drosophila Eye System. Regularność i symetryczny wzór oka można wykorzystać do oceny efektu wprowadzenia mutacji i zmian w ekspresji genów.
Nasz protokół wypełnia lukę w sposobach ilościowego określania szorstkich fenotypów oka. W szczególności luka powstała w wyniku ręcznego klasyfikowania. Ręczny ranking opiera się na fuzji, utracie Ommatidii i organizacji szczeciny.
Może to jednak prowadzić do stronniczości. Dlatego połączenie Ilastik i Flynotyper tworzy bardziej solidną metodę oceny nieprawidłowych fenotypów oczu. Nasz protokół może być korzystny dla ręcznego rankingu ze względu na swoją solidność.
Nawet nieprzeszkoleni członkowie laboratorium mogą przeprowadzić udaną kwantyfikację, podczas gdy bardziej wyszkolony badacz jest prawdopodobnie potrzebny do ręcznego klasyfikowania, aby uniknąć różnic między wynikami między dwoma różnymi badaczami. Dlatego ten protokół może zaoszczędzić czas i zasoby. Nasze odkrycia naprzód badania, ponieważ protokół ten pozwala na dokładniejszą kwantyfikację szorstkich fenotypów oka, zwłaszcza słabych zmian w morfologii oka.
Ze względu na stronniczość głównie w rankingu, znalezienie Ilastik i Flynotyper doprowadzi do dokładniejszej punktacji, a tym samym zaowocuje dokładniejszymi wynikami opublikowanych książek. Aby rozpocząć, umieść obrazy zdrowych i zdegenerowanych oczu muchy Drosophila w tym samym folderze, upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i rozróżnić samce i samice. Otwórz oprogramowanie Ilastik.
Kliknij utwórz nowy projekt. Następnie z innych przepływów pracy wybierz inwentaryzację gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu. Kolejno klikaj na jedne dane wejściowe, dodaj nowe i dodaj osobne obrazy, aby wybrać obraz standardowy.
Następnie kliknij na dwie opcje wyboru funkcji i wybierz funkcje. Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość, kliknij trzy zliczanie i ustaw wartość sigma na pierwszym planie na 5.00. Korzystając z narzędzia pierwszego planu, zaznacz 50 lub więcej pojedynczych Ommatidium na standardowym obrazie.
Kliknij ponownie liczenie trzech i użyj narzędzia tła, aby zaznaczyć obszar poza Ommatidia. Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół Ommatidii. Kliknij cztery ustawienia eksportu obrazu i wybierz ustawienia eksportu obrazu, aby dostosować ustawienia obrazu.
Następnie kliknij informacje o pliku wyjściowym i wybierz format tiff do dalszej analizy w Flynotyper, kliknij pięć procesów przetwarzania wsadowego. Wybierz pliki z surowymi danymi i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane. Lista zaimportowanych obrazów do analizy jest widoczna w wybranych plikach danych raw.
Kliknij opcję Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu sekcji przetwarzania pięciu wsadów. Po zakończeniu przetwarzania przez oprogramowanie sprawdź folder zawierający eksperymentalne obrazy lotu ptaka. Upewnij się, że istnieją czarne obrazy o nazwie prawdopodobieństwa nazwy próbki.
Na obrazie J otwórz plik Ilastik generated. tiff. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół oka.
Naciśnij ctrl plus X lub ctrl plus C, aby przyciąć obszar i poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta. Kolejno kliknij plik, nowy i wewnętrzny schowek, aby otworzyć przycięte oko muchy. Aby zapisać wycięte oko muchy jako JPEG, kliknij plik, zapisz jako i JPEG Na obrazie J kliknij wtyczki i Flynotyper.
W obszarze genotypy wybierz dodaj genotypy i otwórz folder zawierający obrazy wyciętych oczu muchy. Zaznacz pola mikroskopu świetlnego i pionowo. Następnie pod rangą Ommatidia według'sprawdź stabilność i odległość do środkowych pól.
Dla liczby uszeregowanych Ommatidia przyjęto dane wejściowe zestawu jako 200. Kliknij przycisk Uruchom i poczekaj na wyświetlenie wyników analizy. Skopiuj i wklej przykładowy plik i wynik P do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.
Obrazy oczu Drosophila przetworzone za pomocą Ilastik i analizowane w świetle pierścieniowym wykazały wyraźne wzorce ommatidialne w porównaniu z tymi bez światła pierścieniowego, co poprawiło ocenę jakościową. Analiza Flynotyper wykazała istotnie wyższe wyniki fenotypowe w umiarkowanie i poważnie zdegenerowanych oczach muchy w porównaniu z oczami bez zwyrodnienia. Gdy Ilastik nie był stosowany, wyniki P między oczami niezdegenerowanymi i umiarkowanie zwyrodniałymi były podobne.
Przegląd
System oka Drosophila służy jako model do badania chorób neurodegeneracyjnych, takich jak ALS i FTD. To badanie wprowadza metodę ilościowego określania fenotypów oka przy użyciu ilastik i Flynotyper, eliminując stronniczość w manualnej ilościowej ocenie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Organizmy modelowe
Tło
- System oka Drosophila jest cennym narzędziem do modelowania chorób.
- Manualne klasyfikowanie fenotypów oka może prowadzić do stronniczości.
- Rozumienie molekularnych patologii chorób neurodegeneracyjnych jest kluczowe.
- Regularność i symetria oka Drosophila mogą wskazywać na zmiany genetyczne.
Cel badania
- Rozwój bezstronnych metod ilościowego określania fenotypów oka.
- Poprawa dokładności oceny efektów mutacji.
- Wypełnienie luki pozostawionej przez tradycyjne metody manualnej klasyfikacji.
Stosowane metody
- Wykorzystanie ilastik do analizy obrazów.
- Zastosowanie Flynotyper do ilościowego określania fenotypu.
- Ocena struktury oka na podstawie organizacji ommatidialnych i szczecinek.
- Porównanie wyników z metodami manualnej klasyfikacji.
Główne wyniki
- Nowa metoda zapewnia bardziej wiarygodne ilościowe określenie fenotypów oka.
- Zmniejsza stronniczość związaną z manualnymi ocenami.
- Demonstruje wpływ modyfikacji genetycznych na strukturę oka.
- Poprawia zrozumienie modeli chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Badanie przedstawia znaczący postęp w ilościowym określaniu fenotypu.
- Wykorzystanie ilastik i Flynotyper może poprawić wyniki badań.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu lepszych modeli chorób.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative phenotyping of Drosophila eye morphology using computational tools addresses a critical need for unbiased, reproducible target validation in neurodegeneration research. Integrating ilastik and Flynotyper enables robust detection of subtle morphological changes, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. This workflow enhances portfolio decision-making by reducing operator bias and standardizing phenotypic assessment across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of genetic perturbation effects in disease-relevant models.
- Supports functional target validation by distinguishing weak and moderate phenotypic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking through reproducible phenotype scoring.
- Improves predictive confidence for advancing genetic targets in neurodegeneration pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated image datasets for downstream screening and analysis workflows.
- Standardizes phenotype quantification, reducing inter-operator variability in assay outputs.
- Enables scalable, high-throughput assessment of compound or genetic intervention effects.
- Supports reliable comparison of experimental groups for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant morphological endpoints in preclinical models.
- Provides continuity from genetic discovery to translational biomarker development.
- De-risks advancement decisions by quantifying subtle morphological changes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This computational quantification method fits from early discovery through lead identification, enabling standardized phenotype scoring and supporting translational research continuity.
- Discovery Biology: Objectively tests genetic hypotheses and clarifies pathway effects in a model system.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative phenotype outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides statistical outputs (e.g., P scores) for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical endpoints by quantifying disease-relevant phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for phenotypic quantification across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of phenotype assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing subjective bias.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in image analysis and familiarity with ilastik and Flynotyper software.
- Needs access to imaging infrastructure and computational resources for batch processing.
- Demands cross-team agreement on image acquisition and analysis standards.
- Adaptable to other model systems with similar morphological endpoints.
- Dependent on image quality and consistent sample preparation for optimal results.
