Name: Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Poznaj obliczeniową metodę kwantyfikacji fenotypów oka Drosophila melanogaster wykorzystującą ilastik i Flynotyper. To podejście eliminuje stronniczość ręcznego rankingu i zapewnia dokładniejsze wyniki w badaniach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pedro Fernandez-Funez za użycie mikroskopu i kamery użytych w tym protokole. Chcielibyśmy również podziękować Avie Schapman za przekazanie informacji zwrotnych na temat przejrzystości protokołu. Wsparcie finansowe zostało udzielone Nam Chul Kimowi przez The Wallin Neuroscience Discovery Fund.

1. Przygotowanie do kwantyfikacji
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj ilastik11, ImageJ i wtyczkę ImageJ Flynotyper1. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać linki do stron internetowych z instalacją. Pobierz odpowiednie pakiety zgodnie z systemem operacyjnym komputera (Mac, Windows, Linux itp.). Postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji dokładnie tak, jak podano. 
	UWAGA: Konieczne jest postępowanie zgodnie ze wskazówkami podanymi w podanych linkach. Używany komputer wymaga 64-bitowego systemu operacyjnego; W przeciwnym razie nie ma innych wymaganych specyfikacji. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacją komputera systemu używanego dla tego protokołu.</li>
	<li>Użyj standardowego obrazu, aby wytrenować model uczenia maszynowego. Zrób zdjęcie zdrowego oka muchy za pomocą mikroskopu świetlnego ze światłem pierścieniowym (takim jak w1118 x GMR-GAL4), używając środka oka jako punktu ogniskowego. Analizuj samce i samice osobno; Dlatego uzyskaj standardowy obraz dla mężczyzn i kobiet. 
	UWAGA: Ustawienia będą się znacznie różnić w zależności od mikroskopu i aparatu. Zobacz drugi akapit dyskusji, aby uzyskać bardziej ogólne informacje na temat przygotowania muchy i pozyskiwania obrazów.</li>
	<li>Zrób zdjęcia eksperymentalnych oczu muchy, używając tych samych ustawień, które są używane do standardowej akwizycji obrazu. 
	UWAGA: Dobra orientacja ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji. Zobacz Rysunek 4 jako przykład dla prawidłowej orientacji.</li>
</ol>
2. Używanie ilastik do wykrywania ommatidia na podstawie obrazów z lotu ptaka
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem analizy upewnij się, że wszystkie grupy eksperymentalne, niezależnie od warunków eksperymentu, znajdują się w tym samym folderze plików, aby ułatwić następujące procesy. Upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i odróżnić samce od samic. 
	UWAGA: Zalecamy wydrukowanie protokołu i użycie komputera do powiększania rysunków, ponieważ ten protokół jest najłatwiejszy do naśladowania wizualnie.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie. 
	UWAGA: Zaleca się, aby nie otwierać innych aplikacji podczas uruchamiania oprogramowania; W przeciwnym razie komputer może działać bardzo wolno, szczególnie w starszych lub mniej niezawodnych systemach.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy projekt | Inne przepływy pracy, wybierz Zliczanie gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu (Rysunek 1A).</li>
	<li>Kliknij na 1. Dane wejściowe | Dodaj nowy | Dodaj osobne obrazy. Wybierz standardowy obraz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Kliknij 2. Wybór funkcji i wybierz funkcje, które mają być używane. Wybierz funkcje pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C; Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość (np. 10, 15, 20 itd.). 
	UWAGA: Jeśli zaznaczonych jest zbyt wiele pól, program może działać przez długi czas.</li>
	<li>Kliknij na 3. Zliczanie i ustaw wartość sigma pierwszego planu na 5.00. Zaznacz 50 lub więcej pojedynczych ommatidium za pomocą narzędzia Pierwszy plan na standardowym obrazie. 
	UWAGA: Pięćdziesiąt oznaczeń jest zazwyczaj wystarczających do analizy; jednak im bardziej zaznaczono ommatidia, tym dokładniejsze będą wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Kliknij na 3. Liczenie i użyj narzędzia Tło, aby oznaczyć zewnętrzną stronę ommatidia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół ommatidia. 
	UWAGA: Podobnie jak w przypadku większej liczby oznaczeń na ommatidii, im więcej narysowanych zielonych linii, tym dokładniejsze będą wyniki.</li>
	<li>Kliknij 4. Eksport gęstości | Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu, aby skonfigurować ustawienia obrazu (Rysunek 1F). Kliknij Informacje o pliku wyjściowym | wybierz Format i tif do dalszej analizy w Flynotyper.</li>
	<li>Kliknij na 5. Przetwarzanie wsadowe | Wybierz Raw Data Files i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane (Rysunek 1G). Lista zaimportowanych obrazów do analizy znajduje się w sekcji Wybierz pliki danych RAW (Rysunek 1H). Kliknij Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu 5. Sekcja przetwarzania wsadowego. 
	UWAGA: Przypominamy, że analizy mężczyzn i kobiet należy wykonywać oddzielnie. W zależności od używanego komputera ten krok może potrwać 10 minut lub dłużej, zwłaszcza jeśli istnieje wiele zaimportowanych obrazów.</li>
	<li>Po zakończeniu działania oprogramowania sprawdź ten sam folder plików zawierający eksperymentalne obrazy oka muchy; będą tam czarne obrazy o nazwie "YourSampleName_Probabilities" (Rysunek 1I).</li>
</ol>
3. Używanie ImageJ do przygotowania zdjęć dla Flynotyper
<ol>
	<li>Otwórz plik .tif wygenerowany przez ilastik (czarne pola) w ImageJ. 
	UWAGA: Każdy plik .tif wygenerowany przez ilastik musi być obsługiwany oddzielnie.</li>
	<li>Użyj narzędzia Zaznaczanie prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół samego oka. Po narysowaniu prostokąta przytnij obszar, wybierając Ctrl + X lub Ctrl + C (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A). Poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta. 
	UWAGA: System operacyjny komputera określi, czy użyć "Ctrl + X" czy "Ctrl + C". Zwykle "Ctrl + X" jest przeznaczony dla systemu Windows, a "Ctrl + C" jest używany dla komputerów Mac.</li>
	<li>Otwórz teraz wycięte oko muchy za pomocą ImageJ; kliknij Plik | Nowość | Wewnętrzny schowek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Zapisz wycięte oko muchowe jako JPEG, klikając Plik | Zapisz jako | Format JPEG. Wycięte obrazy znajdują się teraz w tym samym folderze plików, co oryginalne obrazy eksperymentalne. 
	UWAGA: Aby ułatwić następny krok, zaleca się utworzenie nowego folderu plików o nazwie "wytnij" i umieszczenie w nim wszystkich wyciętych obrazów.</li>
</ol>
4. Używanie Flynotyper do obliczania wyników fenotypowych
<ol>
	<li>Otwórz Flynotyper jako wtyczkę ImageJ, klikając Wtyczki | Flynotyper.</li>
	<li>Wybierz Dodaj genotypy i otwórz folder zawierający wycięte obrazy oka muchy (folder wyciętego pliku). Nazwa folderu pojawi się w sekcji Genotypy (Rysunek 2C).</li>
	<li>Zaznacz pola Mikroskop świetlny i Pionowo, ale w razie potrzeby odpowiednio dostosuj. Sprawdź pola Stabilność i Odległość od środka w obszarze Rank Ommatidia poprzez: (Rysunek 2C).</li>
	<li>W polu Liczba uwzględnionych ommatidii w rankingu wprowadź 200. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 200 to dobra liczba, ale dostosuj ją do preferencji.</li>
	<li>Kliknij Uruchom i poczekaj, aż pojawią się wyniki analizy (Rysunek 2D). 
	UWAGA: Ten krok może potrwać 5 minut lub dłużej (lub krócej) w zależności od mocy obliczeniowej używanego komputera.</li>
	<li>Skopiuj i wklej plik próbki i wskaźnik P-Score do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

Unbiased Quantification of Ommatidia in Drosophila Eye Models

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Ommatidia Drosophila stanowią przydatny system do badania różnych funkcji biologicznych i chorób genetycznych. Regularność ommatidiów jest dobrym pomiarem do zbadania wpływu mutacji genetycznych4. Mimo że istnieje kilka metod obliczania regularności ommatidiału, takich jak ręczne klasyfikowanie, metody te mogą być mocno stronnicze. Aby przezwyciężyć to tendencyjne podejście, opracowano narzędzia półautomatyczne 1,11.
Aby uzyskać dokładną ocenę ilościową oka, należy zoptymalizować przygotowanie i ustawienie muchy. Chociaż rozumiemy, że każde laboratorium będzie miało swoją konfigurację, udostępniamy następującą konfigurację w naszym laboratorium, aby dać czytelnikom wyobrażenie o tym, jak przygotować muchy do akwizycji obrazu. Muchy są zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Użyliśmy próby o wielkości 3, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że gdy GMR-GAL4 jest połączony z mutacją S81L, różnice w populacji są bardzo małe. Należy jednak pamiętać, że wielkość próby powinna być dostosowana do przeprowadzania testów istotności hipotezy zerowej. Aby zamontować muchy w celu uzyskania obrazu, głowica muchy spoczywa na bardzo małym arkuszu papieru, który działa jak poduszka, tak że środek oka znajduje się mniej więcej na płaszczyźnie ogniskowej (rysunek uzupełniający S1). Nasze laboratorium korzysta z mikroskopu Z-stack i kamery (patrz Tabela materiałów), ponieważ daje to ogólnie wyraźniejsze obrazy, co pozwala na najlepszą wizualizację całego oka, ponieważ oko muchy ma kształt kopuły. Jednak funkcja Z-stack nie jest wymagana dla tego protokołu, ponieważ z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę ze starszym mikroskopem stereoskopowym bez funkcji Z-stack13. Pokrętło światła pierścieniowego jasności jest obrócone nie więcej niż o 1/4 wysokości, aby uniknąć prześwietlenia. Całkowita grubość naszych próbek waha się od 300 do 450 mikronów.
W tym badaniu wykazaliśmy, że analiza oczu muchy za pomocą ilastik i Flynotyper generuje bezstronne i wiarygodne wyniki kwantyfikacji ommatidia. Przeanalizowaliśmy wzorce Drosophila ommatidia za pomocą ilastik, narzędzia do analizy bioobrazu opartego na uczeniu maszynowym, do oznaczania ommatidia, a następnie Flynotyper, metody obliczeniowej używanej do pomiaru regularności ommatidia 1,11. Wolimy używać lampy pierścieniowej do uzyskiwania obrazów w celu lepszej oceny jakościowej. Jednak takie podejście nie pozwala firmie Flynotyper na uzyskanie wyników ilościowych przy użyciu tych obrazów. W związku z tym ilastik jest wdrażany do wstępnego przetwarzania tych obrazów, a te przetworzone obrazy zostały z powodzeniem wykorzystane z Flynotyper w celu uzyskania wyników ilościowych. Gdy obrazy nie były wstępnie przetwarzane za pomocą ilastik przed Flynotyperem, ogólne wskaźniki P były podobne między oczami zdrowymi i zwyrodnieniowymi. Podkreśla to, jak ważne jest, aby przy wdrażaniu lampy pierścieniowej w pierwszej kolejności wdrażać lampę pierścieniową w celu uzyskania wyników ilościowych.
Istnieją pewne ograniczenia w naszych metodach. Ustawienia w ilastik mogą się znacznie różnić i mogą powodować nieistotne dane. Na przykład przeprowadziliśmy kolejny zestaw analiz przy użyciu tych samych obrazów, ale dostosowaliśmy wartość sigma pierwszego planu w ilastik do 2,5 zamiast 5. Spowodowało to utratę wrażliwości w umiarkowanie zwyrodnieniowych fenotypach (rysunek uzupełniający S2 i tabela uzupełniająca S1). Kolejnym ograniczeniem jest utrata wrażliwości w oczach przy zbyt dużym zwyrodnieniu. W porównaniu z 3x_S81L okiem, oko z martwiczymi plamami jest jakościowo znacznie bardziej zwyrodniałe. Jednak średni P-Score dla 3x_S81L oczu wynosił 60,2, podczas gdy średni P-score dla oczu z martwiczymi plamami wynosił 60,9. Tak więc oczy ze zbyt dużym zwyrodnieniem, takie jak plamy martwicze, mogą również powodować utratę wrażliwości (rysunek uzupełniający S3).
Krytycznym krokiem tego protokołu jest wybór odpowiedniego standardowego obrazu, który służy do trenowania ilastik. Niezdegenerowany standardowy obraz z wyraźnym kontrastem między ommatydiami a otaczającymi komórkami pigmentowymi, takimi jak czerwone lub pomarańczowe oczy, spowoduje dokładniejsze określenie ilościowe w Flynotyper. Kolejnym krytycznym krokiem jest wybór funkcji w ilastik, gdzie czułość, reprezentowana jako wartości sigma, jest wybierana w celu precyzyjnego dostrojenia oprogramowania uczenia maszynowego (rysunek 1D). Wybór zbyt małej liczby cech może zmniejszyć czułość ilastik, co prowadzi do niedokładnego oznaczenia ommatidii. Wybór zbyt wielu cech wydłuży czas i moc obliczeniową wymaganą do wygenerowania wyników, obniżając wydajność procedury. Alternatywnie, jeśli zauważalne jest jakościowe zwyrodnienie oka, ale wyniki analizy nie są statystycznie istotne, zwiększenie wartości sigma wybranych cech byłoby potencjalnym rozwiązaniem. Jednak wybór funkcji zapewniony w tym protokole regularnie daje dokładne wyniki. Wykonanie krytycznych kroków, jak napisano, pomoże złagodzić najczęstsze problemy i rozwiązywanie problemów w przyszłości.
Podsumowując, metoda ta zapewnia lepszą jakość obrazów, a jednocześnie zapewnia bezstronną i wiarygodną ocenę ilościową systemu oka Drosophila . W związku z tym metoda ta może zwiększyć użyteczność zwyrodnienia oczu jako potężnego narzędzia do modelowania chorób zwyrodnieniowych w przyszłości.

Genom Drosophila melanogaster zawiera ~75% ortologów genów związanych z ludzką chorobą. Dodatkowo, podczas rozwoju oka Drosophila, około dwie trzecie genów w genomie ulega ekspresji, co czyni oko Drosophila wyjątkowym systemem genetycznym do badania różnych funkcji molekularnych i komórkowych, rozwoju i modeli chorób1,2. Tak więc system oka Drosophila jest użytecznym narzędziem eksperymentalnym do badania różnych procesów biologicznych.
Oko złożone Drosophila to dobrze skonstruowany i wszechstronny zestaw ~800 ommatidia, które wykazują symetryczny i sześciokątny wzór3. Regularność tego sześciokątnego wzoru może być wykorzystana do oszacowania efektu wprowadzenia mutacji i zmian ekspresji genów w morfologii oka4. Wcześniejsze badania, które wymagały oceny morfologii oka, w dużej mierze opierały się na ręcznym rankingu nasilenia fenotypów oka wykrywanych gołym okiem. Aby uszeregować fenotypy oka, obrazy morfologii oka zewnętrznego są wykonywane za pomocą mikroskopu stereoskopowego5,6. Fenotyp oka każdej grupy ocenia się, dzieląc oko zewnętrzne na cztery obszary i obliczając proporcję zwyrodnienia w każdym obszarze5,6. Następnie wartości są używane do obliczania średnich, które są porównywane z wartościami uzyskanymi z kontroli much7. Punktacja jest oparta na stopniu fuzji, utracie ommatidii i organizacji szczeciny7,8. Zdjęcia oczu muchy wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego są pozyskiwane przez jednego badacza, a analiza fenotypu oka jest wykonywana przez innego badacza za pomocą potrójnych zestawów walidacyjnych7,8.
Jeśli chodzi o klasyfikację słabych zmian w morfologii oka gołym okiem, istnieją ograniczenia4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak FLEYE i Flynotyper1,9. Flynotyper to nowatorska metoda obliczeniowa służąca do ilościowego szacowania zmian morfologicznych w systemie oka Drosophila1. Automatycznie wykrywa oko Drosophila i poszczególne ommatidium, obliczając wyniki fenotypowe (P-Scores) na podstawie nieregularnościoka1. Wyższy wskaźnik P-Score wskazuje, że oko muchy jest bardziej zdegenerowane. To oprogramowanie zostało z powodzeniem wykorzystane do ilościowego określenia nieprawidłowości oczu Drosophila10. Chociaż Flynotyper zapewnia zautomatyzowany proces, nadal nie może być z powodzeniem zastosowany do niektórych obrazów oczu wykonanych różnymi metodami mikroskopii świetlnej.
Jakościowo, preferujemy pierścieniowe źródło światła w porównaniu z jednopunktowym źródłem światła, ponieważ oferuje ono dokładniejsze odwzorowanie każdego ommatidium. Jednak gdy używana jest lampa pierścieniowa, generuje cień w kształcie pierścienia na górze każdego ommatidium ze względu na półkulisty kształt ommatidium. Ten cień w kształcie pierścienia hamuje dokładne wykrywanie ommatydialne przez Flynotyper, co prowadzi do nieprawidłowego obliczania P-Scores.
Aby przezwyciężyć te problemy, wdrożyliśmy ilastik, narzędzie oparte na uczeniu maszynowym do różnych analiz, do klasyfikowania ommatidia na obrazach oczu muchy11. Następnie wprowadziliśmy obrazy wygenerowane przez ilastik do Flynotyper, aby obliczyć P-Scores. To pozwala nam na obiektywne określenie wad morfologicznych oka Drosophila1.

<table><tbody><tr><td>Specyfikacja</td><td></td><td></td> komputera <td>Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Pobierz oprogramowanie tutaj: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>Oprogramowanie Open source. Nie należy stosować leku Flynotyper 2.0. W momencie publikacji 2.0 był dość nowy i ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem oryginalnej wersji Flynotypera.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. i in. (2019)</td><td>Pobierz oprogramowanie tutaj: https://www.ilastik.org/download.html</td><td>Oprogramowanie open source. Pobierz wersję 1.4.0.post1 w ramach regularnych kompilacji odpowiadających systemowi operacyjnemu komputera.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Pobierz oprogramowanie tutaj: https://imagej.net/ij/download.html</td><td>Oprogramowanie open source. Używano wersji 1.53 i 1.54. 1.54 jest zaktualizowaną wersją i jest domyślnym plikiem do pobrania.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>System i oprogramowanie używane do akwizycji z-stack.</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica Z16 APO z kamerą DMC2900</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Określany w tekście jako mikroskop i kamera Z-stack. Ten produkt został zarchiwizowany.</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja fenotypów oczu drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

Oko złożone Drosophila melanogaster to dobrze zbudowany i wszechstronny układ około 800 ommatidiów, wykazujący symetryczny i sześciokątny wzór. Ta regularność i łatwość obserwacji sprawiają, że system oka Drosophila jest potężnym narzędziem do modelowania różnych chorób neurodegeneracyjnych człowieka. Jednak sposoby ilościowego określania nieprawidłowych fenotypów, takie jak ręczne klasyfikowanie ocen nasilenia oka, mają ograniczenia, zwłaszcza w przypadku oceny słabych zmian w morfologii oka. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak Flynotyper. Zastosowanie lampy pierścieniowej pozwala na uzyskanie lepszej jakości obrazów uzyskujących dostęp do nienaruszonego stanu poszczególnych ommatidiów. Jednakże, obrazy te nie mogą być analizowane bezpośrednio przez Flynotyper ze względu na cienie na ommatidiach wprowadzane przez światło pierścieniowe. W tym miejscu opisujemy bezstronny sposób ilościowego określania szorstkich fenotypów oczu obserwowanych w modelach choroby Drosophila poprzez połączenie dwóch programów, ilastik i Flynotyper. Dzięki wstępnemu przetwarzaniu obrazów za pomocą ilastik, za pomocą Flynotyper można osiągnąć pomyślną kwantyfikację fenotypu szorstkiego oka.

W poprzednim badaniu wykorzystaliśmy ten protokół do wyznaczenia modyfikatorów genetycznych mutantowego białka VCP powiązanego z bocznym stwardnieniem zanikowym z otępieniem czołowo-skroniowym (ALS-FTD)12. Dodatkowo metoda ta została zastosowana w innym artykule do oceny toksyczności ALS-FTD indukowanego przez CHCHD10S59L, nawet przy użyciu starszego stereomikroskopu13. Aby dodatkowo zwalidować te wyniki, zastosowaliśmy oprogramowanie ilastik oraz Flynotyper w tej samej mutacji chorobowej ALS-FTD co Baek i wsp.13; eksperyment został jednak przeprowadzony przez niewyszkolony personel laboratoryjny, który uzyskał podobne wyniki. Zatem połączenie programów ilastik i Flynotyper stanowi niezawodną metodę obiektywnej oceny degeneracji ommatidiów Drosophila.
Preferujemy stosowanie lampy pierścieniowej, ponieważ pozwala ona na lepszą ocenę jakościową (Rysunek 3). Jednak użycie lampy pierścieniowej powoduje powstanie cienia, którego program Flynotyper nie potrafi bezpośrednio analizować. Aby temu zaradzić, obrazy poddaliśmy wstępnemu przetwarzaniu w programie ilastik przed ilościowym oznaczeniem wartości P-Score za pomocą Flynotyper. Ogólnie rzecz biorąc, wartości P-Score dla niedegenerowanego oka muchy (GMR-GAL4) były znacznie niższe w porównaniu z okiem umiarkowanie zdegenerowanym (2x_S81L) oraz okiem silnie zdegenerowanym (3x_S81L) (Rysunek 4A,B oraz Tabela 1). Jest to oczekiwany rezultat, ponieważ wyższe wartości P-Score generowane przez Flynotyper wskazują na większy stopień degeneracji oka1. W przypadku niewykorzystania programu ilastik różnice w wartościach P-Score pomiędzy okiem niedegenerowanym a umiarkowanie zdegenerowanym były pomijalne (Rysunek 4C oraz Tabela 1). Sugeruje to, że Flynotyper ma trudności z dokładną identyfikacją wzorców ommatidiów w warunkach oświetlenia lampą pierścieniową bez zastosowania programu ilastik. Wynika to z faktu, że Flynotyper został zaprojektowany do pracy z obrazami wykonanymi przy użyciu dwupunktowego źródła światła, które są konwertowane na skalę szarości z dodatkowymi korektami w celu identyfikacji centrum ommatidium1. Program ilastik odwzorowuje ten proces poprzez wprowadzenie punktu w centrum każdego ommatidium, co umożliwia przeprowadzenie analizy ilościowej w programie Flynotyper.
<img alt="Przebieg analizy mikroskopowej; złożone oko owada; przetwarzanie obrazu; schemat interfejsu oprogramowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład przebiegu pracy w programie ilastik. (A) Tworzenie nowego projektu w programie ilastik. (B) Wybór obrazu standardowego. (C) Wybór wartości sigma w sekcji Feature Selection. (D) Zaznaczanie pierwszego planu ommatidii w celu określenia czułości. (E) Zaznaczanie tła ommatidii w celu określenia czułości. (F) Wybór sposobu eksportu przetworzonych plików przez oprogramowanie. (G) Wybór obrazów oczu much eksperymentalnych do analizy. (H) Wskazanie obrazów oczu much eksperymentalnych, które zostaną przeanalizowane. (I) Wynik końcowy po uruchomieniu oprogramowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda przetwarzania obrazów mikroskopowych z wykorzystaniem narzędzi programistycznych, analiza struktury; tabela analizy wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Przykład schematu działania Flynotyper. (A) Wybór wyłącznie oka muchy do dalszej analizy. (B) Otwieranie obrazu przekroju oka w nowym oknie. (C) Wybór obrazów z przekrojów do analizy oraz parametrów poddawanych weryfikacji podczas analizy. (D) Przykładowe wyniki. Wyniki fenotypowe przedstawiono po prawej stronie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Degeneracja oka złożonego, analiza z użyciem światła pierścieniowego i bez światła pierścieniowego; porównanie obrazów mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Jakościowe obrazy oka Drosophila . Zdjęcia tego samego oka muchy wykonane z użyciem światła pierścieniowego (lewo) oraz światła dwupunktowego (prawo) w warunkach braku degeneracji (góra) i degeneracji (dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Morfologia oka Drosophila i wyniki punktacji fenotypowej na wykresach słupkowych; eksperyment genetyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wykorzystanie oprogramowania ilastik przed Flynotyper w celu dokładnej kwantyfikacji fenotypu szorstkiego oka u Drosophila. (A) Reprezentatywne obrazy oka Drosophila dla oka niedegenerowanego (GMR-GAL4), oka umiarkowanie zdegenerowanego (2x_S81L) oraz oka silnie zdegenerowanego (3x_S81L). (B) Wyniki kwantyfikacji z Flynotyper po zastosowaniu ilastik. Obliczono wartości p dla dwustronnego permutacyjnego testu t, aby ułatwić interpretację wyników (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Wyniki kwantyfikacji z Flynotyper bez zastosowania ilastik. Obliczono wartości p dla dwustronnego permutacyjnego testu t, aby ułatwić interpretację wyników (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0.597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0.687). N = 3 dla każdej grupy. Punkty danych zostały rozproszone (jittered) lub skumulowane na osi x dla przejrzystości wizualnej. Ciągła pozioma linia reprezentuje średnią. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Za pomocą programu ilastik</td>
			<td>Bez użycia programu ilastik</td>
			<td>Z programem ilastik</td>
			<td>Bez użycia oprogramowania ilastik</td>
			<td>Za pomocą programu ilastik</td>
			<td>Bez użycia programu ilastik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wyniki P-Score przy użyciu Flynotyper z ilastik oraz przy użyciu samego Flynotyper.
Rycina dodatkowa S1: Stanowisko do mocowania głowy muchy do akwizycji obrazu.Jest to przykład przygotowania do akwizycji obrazu z wykorzystaniem kilku arkuszy papieru. Można jednak zastosować każdą metodę, która zapewni prawidłową orientację głowy i oka muchy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa S2: Wyniki ilościowe dla programów ilastik i Flynotyper przy zastosowaniu wartości sigma wynoszącej 2,5 podczas selekcji cech.Zastosowanie wartości sigma innej niż 5,0 podczas selekcji cech w programie ilastik może prowadzić do niedokładnej kwantyfikacji. W szczególności wartość sigma wynosząca 2,5 skutkuje utratą czułości. W celu ułatwienia interpretacji wyników obliczono wartości p dla dwustronnego permutacyjnego testu t (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 dla każdej grupy. Punkty danych zostały rozproszone lub ułożone warstwowo na osi x dla przejrzystości wizualnej. Ciągła pozioma linia reprezentuje średnią. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S3: Utrata czułości i niedokładne wyniki P-Score z powodu obszarów martwiczych. Białe strzałki wskazują fragmenty obszarów martwiczych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Wartości P-Score przy zastosowaniu wartości sigma wynoszącej 2,5 podczas selekcji cech. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.

Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Jesteśmy zainteresowani opracowaniem modeli chorób takich jak ALS, FTD i proteinopatia wieloukładowa, aby zrozumieć ich patologie molekularne. Jednym z modeli, których używamy, jest Drosophila Eye System. Regularność i symetryczny wzór oka można wykorzystać do oceny efektu wprowadzenia mutacji i zmian w ekspresji genów.Nasz protokół wypełnia lukę w sposobach ilościowego określania szorstkich fenotypów oka. W szczególności luka powstała w wyniku ręcznego klasyfikowania. Ręczny ranking opiera się na fuzji, utracie Ommatidii i organizacji szczeciny.Może to jednak prowadzić do stronniczości. Dlatego połączenie Ilastik i Flynotyper tworzy bardziej solidną metodę oceny nieprawidłowych fenotypów oczu. Nasz protokół może być korzystny dla ręcznego rankingu ze względu na swoją solidność.Nawet nieprzeszkoleni członkowie laboratorium mogą przeprowadzić udaną kwantyfikację, podczas gdy bardziej wyszkolony badacz jest prawdopodobnie potrzebny do ręcznego klasyfikowania, aby uniknąć różnic między wynikami między dwoma różnymi badaczami. Dlatego ten protokół może zaoszczędzić czas i zasoby. Nasze odkrycia naprzód badania, ponieważ protokół ten pozwala na dokładniejszą kwantyfikację szorstkich fenotypów oka, zwłaszcza słabych zmian w morfologii oka.Ze względu na stronniczość głównie w rankingu, znalezienie Ilastik i Flynotyper doprowadzi do dokładniejszej punktacji, a tym samym zaowocuje dokładniejszymi wynikami opublikowanych książek. Aby rozpocząć, umieść obrazy zdrowych i zdegenerowanych oczu muchy Drosophila w tym samym folderze, upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i rozróżnić samce i samice. Otwórz oprogramowanie Ilastik.Kliknij utwórz nowy projekt. Następnie z innych przepływów pracy wybierz inwentaryzację gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu. Kolejno klikaj na jedne dane wejściowe, dodaj nowe i dodaj osobne obrazy, aby wybrać obraz standardowy.Następnie kliknij na dwie opcje wyboru funkcji i wybierz funkcje. Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość, kliknij trzy zliczanie i ustaw wartość sigma na pierwszym planie na 5.00. Korzystając z narzędzia pierwszego planu, zaznacz 50 lub więcej pojedynczych Ommatidium na standardowym obrazie.Kliknij ponownie liczenie trzech i użyj narzędzia tła, aby zaznaczyć obszar poza Ommatidia. Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół Ommatidii. Kliknij cztery ustawienia eksportu obrazu i wybierz ustawienia eksportu obrazu, aby dostosować ustawienia obrazu.Następnie kliknij informacje o pliku wyjściowym i wybierz format tiff do dalszej analizy w Flynotyper, kliknij pięć procesów przetwarzania wsadowego. Wybierz pliki z surowymi danymi i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane. Lista zaimportowanych obrazów do analizy jest widoczna w wybranych plikach danych raw.Kliknij opcję Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu sekcji przetwarzania pięciu wsadów. Po zakończeniu przetwarzania przez oprogramowanie sprawdź folder zawierający eksperymentalne obrazy lotu ptaka. Upewnij się, że istnieją czarne obrazy o nazwie prawdopodobieństwa nazwy próbki.Na obrazie J otwórz plik Ilastik generated. tiff. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół oka.Naciśnij ctrl plus X lub ctrl plus C, aby przyciąć obszar i poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta. Kolejno kliknij plik, nowy i wewnętrzny schowek, aby otworzyć przycięte oko muchy. Aby zapisać wycięte oko muchy jako JPEG, kliknij plik, zapisz jako i JPEG Na obrazie J kliknij wtyczki i Flynotyper.W obszarze genotypy wybierz dodaj genotypy i otwórz folder zawierający obrazy wyciętych oczu muchy. Zaznacz pola mikroskopu świetlnego i pionowo. Następnie pod rangą Ommatidia według'sprawdź stabilność i odległość do środkowych pól.Dla liczby uszeregowanych Ommatidia przyjęto dane wejściowe zestawu jako 200. Kliknij przycisk Uruchom i poczekaj na wyświetlenie wyników analizy. Skopiuj i wklej przykładowy plik i wynik P do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.Obrazy oczu Drosophila przetworzone za pomocą Ilastik i analizowane w świetle pierścieniowym wykazały wyraźne wzorce ommatidialne w porównaniu z tymi bez światła pierścieniowego, co poprawiło ocenę jakościową. Analiza Flynotyper wykazała istotnie wyższe wyniki fenotypowe w umiarkowanie i poważnie zdegenerowanych oczach muchy w porównaniu z oczami bez zwyrodnienia. Gdy Ilastik nie był stosowany, wyniki P między oczami niezdegenerowanymi i umiarkowanie zwyrodniałymi były podobne.

quantifying-drosophila-melanogaster-eye-phenotypes-computational

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Test wyspowy jest stosunkowo nowym, opłacalnym testem, który może być użyty do oceny podstawowego zachowania lokomotorycznego Drosophila melanogaster. W tym manuskrypcie opisano algorytmy automatycznego przetwarzania danych i obiektywnej kwantyfikacji danych z testów wyspowych, dzięki czemu test ten jest czułym, wysokowydajnym odczytem dla dużych badań genetycznych lub farmakologicznych.

Wysokoprzepustowa analiza zachowań lokomotorycznych w teście na wyspie Drosophila

Opisano protokoły dotyczące okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera. Klasyfikacja i kwantyfikacja pigmentacji stanowią solidną podstawę do badania mechanizmów rozwojowych cech dorosłych i umożliwiają międzygatunkowe porównanie rozwoju cech.

Metody oceny stopnia zaawansowania okresów poczwarki i pomiaru pigmentacji skrzydeł Drosophila guttifera

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Poznaj obliczeniową metodę kwantyfikacji fenotypów oka Drosophila melanogaster wykorzystującą ilastik i Flynotyper. To podejście eliminuje stronniczość ręcznego rankingu i zapewnia dokładniejsze wyniki w badaniach neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Przeglądaj więcej filmów