Kwantyfikacja adherentnych leukocytów wywołanych cukrzycą w unaczynieniu siatkówki

Badania w naszym laboratorium koncentrują się na poznaniu, co powoduje retinopatię w cukrzycy i jak można jej zapobiegać. Kilka laboratoriów wykazało, że białaczka, nadmierna akumulacja białych krwinek w małych naczyniach oka, zwiększa cukrzycę. A to może przyczyniać się do niedrożności i zwyrodnienia naczyń w siatkówce w cukrzycy. Technika ta pozwala na wizualizację i ilościowe określenie nasilenia białaczki w unaczynieniu siatkówki. I może być stosowany w badaniach, które chcą ocenić skuteczność różnych terapii, w tym leków.

[Instruktor] Aby skonfigurować zaparzacz ciśnieniowy, podłącz szeregowo worek z solą fizjologiczną o zawartości 0,9%. zestaw cewnika dożylnego, czterodrogowy zawór odcinający i igłębnik do zgłębnika. Otwórz system perfuzyjny i przepłucz przewody i porty solą fizjologiczną przez dwie minuty przy natężeniu przepływu od 18 do 20 mililitrów na minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Umieść znieczuloną mysz na wznak na etapie perfuzji. Zidentyfikuj wizualnie wyrostek mieczykowaty. Trzymając hemostat w ręce dominującej, zabezpiecz i zablokuj skórę. Następnie przenieś hemostat do ręki niedominującej i unieś skórę. Następnie za pomocą nożyczek wytnij fragment skóry pod kątem 90 stopni do kręgosłupa, aby odsłonić zewnętrzną ścianę brzucha. Mając widoczny wyrostek mieczykowaty i klatkę piersiową, wypreparuj obustronnie przez ścianę brzucha, ostrożnie unikając wszelkich narządów lub głównych naczyń. Teraz wyobraź sobie komory serca i płuca przez przeponę. Za pomocą końcówki nożyczek wykonaj nacięcie w przeponie z jednej strony w pobliżu kręgosłupa. Odsłoń serce w jamie piersiowej po przecięciu mostka na pół. Za pomocą kleszczy w ręce niedominującej chwyć serce w pobliżu jego wierzchołka. Używając ręki dominującej, przytrzymaj igłę do zgłębnika przymocowaną do cewnika dożylnego i nakłuj wierzchołek serca. Upewnij się, że końcówka kulowa igły do zgłębnika lekko wystaje z miejsca nakłucia, aby uniknąć całkowitej perforacji lewej komory lub dostania się do układu krążenia płucnego. Następnie otwórz kurek, aby umożliwić przepływ 0,9% soli fizjologicznej. Jednocześnie użyj nożyczek, aby rozciąć prawe przedsionek. Kontynuuj perfuzję przez dwie do trzech minut, delikatnie przesuwając igłę z boku na bok oraz w górę iw dół, aby zapobiec załamaniu się naczyń krwionośnych i zwiększyć drenaż krwi z serca. Po perfuzji przekręć uchwyt kranu, aby odciąć przepływ soli fizjologicznej i umożliwić przepływ ze strzykawki do igły do zgłębnika. Następnie ręcznie przelej 10 mililitrów roztworu konkanawaliny A w ciągu 30 do 35 sekund. Po przetworzeniu serca znieczulonej myszy roztworem konkanawaliny A, obróć mysz na bok. Połóż palec wskazujący ręki niedominującej na powiece górnej, a kciuk na powiece dolnej. Delikatnie cofnij powieki i otaczającą skórę, aby podeprzeć oko, pozwalając mu częściowo wybrzuszyć się z oczodołu. Następnie, używając zakrzywionych nożyczek w dominującej ręce, nabierz pod okiem pod kątem 45 stopni. Przetnij przyczepy mięśniowe i nerw wzrokowy. Używając nożyczek jako szpatułki, przenieś oko do małego pojemnika. Umieść oko na wosku dentystycznym, aby przygotować się do otwarcia kuli. Pod mikroskopem preparacyjnym, za pomocą mikrokleszczyków, przytrzymaj fałd twardówkowy lub resztki mięśni przyczepione do tylnej części oka i ustaw oko tak, aby rogówka była skierowana na jedną stronę. Wykonaj nacięcie z tyłu i równolegle do rąbka. Użyj mikronożyczek, aby oddzielić przedni odcinek oka, w tym soczewkę na obwodzie muszli ocznej, upewniając się, że siatkówka jest całkowicie odłączona od twardówki. Wyciągnij siatkówkę z twardówki za pomocą mikroszpatułki. Jeśli siatkówka jest nadal przyczepiona przez nerw wzrokowy, włóż mikronożyczki między siatkówkę a twardówkę, aby przeciąć nerw wzrokowy. Umieść nieutrwaloną siatkówkę na szkiełku z kroplą PBS. Wykonaj od czterech do pięciu promienistych nacięć w siatkówce, tworząc wzór liścia koniczyny, tak aby leżał płasko. Obserwuj płasko zamontowaną siatkówkę pod mikroskopem w powiększeniu 100x za pomocą obiektywu 10x. Mikroskopia fluorescencyjna naczyń siatkówki wykazała, że siatkówki cukrzycowe wykazywały łagodną białaczkę z typowo 3 do 12 leukocytami na siatkówkę w porównaniu z 1 do 3 w grupie kontrolnej bez cukrzycy. Znaczące skupiska leukocytów zaobserwowano w modelach zapalnych zakażonych lipopolisacharydami, w przeciwieństwie do łagodnego grupowania w próbkach z cukrzycą.