Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK

Nasze badania koncentrują się na małych pęcherzykach wytwarzanych przez rodzaj komórek odpornościowych, które są naturalnie skuteczne w zabijaniu komórek rakowych. Pęcherzyki te mają obiecujący potencjał terapeutyczny w leczeniu guzów litych, zarówno w miejscach pierwotnych, jak i wtórnych, takich jak mózg. W tym badaniu używamy żywicy bimodalnej do izolowania pęcherzyków za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, maksymalizując czystość produktu poprzez fizyczne oddzielenie pęcherzyków od zanieczyszczeń, jednocześnie zatrzymując zanieczyszczenia w żywicy za pomocą sił elektrostatycznych.

Następnie sterylizujemy, zagęszczamy i buforujemy wymianę pęcherzyków przed użyciem Szczegóły procesu bioprodukcji w tym filmie wykorzystują klinicznie istotne warunki i są skalowalne pod względem kosztów, skutecznie wytwarzając duże ilości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o wysokiej czystości. To sprawia, że technika ta jest dostępna dla laboratoriów akademickich, które mogą pewnie inwestować zasoby w badania nad takimi terapiami z niezawodnym procesem produkcji i izolacji. Obecnie badamy potencjał terapeutyczny tych pęcherzyków i modeli przedklinicznych oraz pogłębiamy naszą wiedzę na temat ich działania.

Aby rozpocząć, należy przeprowadzić szybką inicjację systemu chromatografii cieczowej białek zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj połączenia metodą kroplówka-kroplówka, aby upewnić się, że powietrze nie jest wprowadzane do wnętrza kolumny. Ustawić kolektor frakcji z odpowiednimi probówkami do pobierania próbek.

Zmień ustawienia frakcjonowania na żądaną objętość zbierania. Usuń od 40 do 80 mililitrów wcześniej przygotowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub kondycjonowanych pożywek bogatych w EV z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i szybko rozmroź w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wirować próbkę w temperaturze 10 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przenieść supernatant do nowej probówki.

Aby zmniejszyć poziom dwuniciowego DNA, potraktuj kondycjonowane podłoże bogate w EV pięcioma milimolami chlorku magnezu i 50 jednostkami na mililitr endonukleazy. Inkubować próbkę przez dwie do czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z umiarkowanym mieszaniem. Gdy system chromatograficzny jest gotowy, załaduj kondycjonowane podłoże bogate w EV do 60-mililitrowej strzykawki i podłącz je do linii próbki.

Kliknij przycisk Uruchom ręcznie, aby uruchomić system i ustawić natężenie przepływu na zero. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby zapobiegawczo zapisać przebieg. Następnie kliknij przycisk Start.

Wybierz Line Beat Double-Filtered PBS i pracuj z prędkością przepływu dwóch mililitrów na minutę, upewniając się, że roztwór przepływa przez kolumnę. Gdy absorbent się ustabilizuje, naciśnij Auto Zero UV. Zmień ścieżkę przepływu, aby skierować próbkę do pojemnika na odpady przed kolumną. Po pięciu do 20 sekundach skieruj próbkę do kolumny.

Gdy odczyty UV osiągną około 230 jednostek miliabsorbancji, kliknij Frakcjonowanie. Po całkowitym wstrzyknięciu próbki należy przełączyć system buforowy na podwójnie filtrowany PBS, aby kontynuować oczyszczanie. Gdy wartość promieniowania UV osiągnie około 1 600 jednostek miliabsorbancji, ponownie kliknij opcję Frakcjonowanie.

Po zatrzymaniu przebiegu zapisz chromatogram jako dokument PDF. Przepłucz każdy element aparatu ultrafiltracyjnego 20 do 30 mililitrami 90% etanolu. Wirować z prędkością 4 000 G przez pięć do 10 minut i wyrzucić przepływ.

Następnie wykonaj płukanie sterylnym PBS, aby wyrównać urządzenie i powtórzyć etapy wirowania jak poprzednio. Połączyć wszystkie rozcieńczone frakcje NK-EV. Aby zmaksymalizować sterylność, przefiltruj rozcieńczony roztwór NK-EV za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra, wstępnie zwilżonego podwójnie przefiltrowanym PBS.

Zebrać filtrat do wysterylizowanego aparatu zagęszczającego. Wirować filtrat o stężeniu 4 000 G przez 15 do 40 minut. Po odwirowaniu wymieszać roztwór w górnej komorze filtra za pomocą pipety serologicznej.

Ponownie wiruj z prędkością 4 000 G przez 10 minut. Odwróć urządzenie filtrujące i podłącz je do urządzenia zbierającego, aby zebrać NK-EV. Wirować NK-EV w temperaturze 2 000 G przez dwie minuty i przenieść oczyszczony produkt do sterylnej probówki.

Uruchom system analizy śledzenia nanocząstek zgodnie z instrukcjami producenta. Obserwuj komórkę przepływową pod kątem pęcherzyków powietrza. Jeśli obecny jest pęcherzyk powietrza, usuń go, przepłukując komorę przepływową 20% etanolem i podwójnie przefiltrowaną wodą.

Po wyczyszczeniu ostrożnie włóż moduł laserowy do przyrządu do analizy śledzenia nanocząstek. Zamknij drzwi i kliknij przycisk Uruchom kamerę. Zmień ustawienia przechwytywania na wzmocnienie ekranu dwa i poziom kamery 14.

Włącz grzałkę, aby ustabilizować temperaturę komory przepływowej. Kliknij opcję Pomiar standardowy, aby utworzyć skrypt na karcie SOP do zbierania jednego ujęcia w ciągu jednej minuty przy natężeniu przepływu 30 w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Dodaj nazwę folderu i pliku do nazwy ścieżki, aby zapisać dane.

Odwirować oczyszczony produkt NK-EV i przygotować jego rozcieńczenie przy użyciu podwójnie przefiltrowanego PBS. Po wirowaniu rozcieńczonej próbki załadować ją do 1-mililitrowej strzykawki akwizycyjnej bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Ostrożnie podłączyć strzykawkę do przewodu ładowania instrumentu.

Powoli wepchnij połowę próbki, pozostawiając około 0,5 mililitra w strzykawce. Gdy cząsteczki są widoczne na ekranie, ustaw ostrość kamerę tak, aby wokół każdej cząsteczki było maksymalnie jedno halo, Na karcie Sprzęt kliknij Infuse i ustaw szybkość 1 000 na pięć sekund. Następnie obniż stawkę do 30.

Naciśnij Uruchom skrypt. Po upewnieniu się, że ustawienia są poprawne, kliknij Tak i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania. Po zakończeniu przechwytywania kliknij przycisk Anuluj, gdy oprogramowanie poprosi o przetworzenie lub wyeksportowanie plików.

Po zarejestrowaniu pięciu wychwytów na rozcieńczenie, zaimportuj wszystkie pięć wychwytów do analizy. Zaznacz pliki i kliknij przycisk Przetwarzaj wybrane pliki. Na karcie Proces dostosuj ustawienia analizy do wzmocnienia ekranu wynoszącego dwa i progu wykrywania wynoszącego 15.

Zaznacz i kliknij przycisk OK do analizy. Po przetworzeniu kliknij przycisk Tak bez klikania dodatkowych pól lub kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować pliki. Wielkość cząstek oczyszczonych NK-EV wahała się od 76,30 do 174,30 nanometrów przy średnim stężeniu 1,39 razy 10 do mocy 12 EV na mililitr.

Dodatkowo kwantyfikacja fluorometrem wykazała stężenie białka około 300 miligramów na mililitr i stężenie dwuniciowego DNA 225 miligramów na mililitr. Leczenie ludzkimi komórkami białaczkowymi K562 za pomocą NK-EV wykazało zależny od dawki spadek żywotności komórek przy EC 50 wynoszącym 9,33 razy 10 do mocy dziewięciu EV na mililitr.