Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

Zakres naszych badań polega na scharakteryzowaniu replikacji DNA niestabilnych powtórzeń patogennych w komórkach ludzkich. Mamy nadzieję, że odpowiemy na takie pytania, jak: jakie konkretnie powtórzenia kosztują przeciąganie widełek replikacji? Jakie unikalne struktury drugorzędowe tworzą te powtórzenia?

I jak te powtórzenia rozszerzają się podczas replikacji DNA? Chociaż wiemy, że wiele z tych powtórzeń tworzących strukturę może upośledzać replikację DNA, nadal nie jest jasne, jakie dokładnie kroki następują dalej. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże odpowiedzieć na to pytanie i rzuci światło na mechanizmy ekspansji tych patogennych powtórzeń.

Żele 2D dają unikalną możliwość wizualizacji struktur we względnych populacjach cząsteczek, które mogą powstać podczas replikacji DNA. W ramach jednego eksperymentu masz w zasadzie pełną mapę tego, jak wygląda postęp replikacji przez określoną sekwencję DNA. Na początek umieść odczynniki potrzebne do przygotowania elektroforezy żelowej na platformie roboczej.

Dodaj tris-boran-EDTA lub TBE do agarozy i podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej. Następnie wlej 0,4 do 0,5% agarozy do tacki odlewniczej, aby przygotować żel agarozowy pierwszego wymiaru i pozwól mu zastygnąć przez godzinę. Po zestaleniu załaduj drabinę w ciągu pierwszych trzech centymetrów w stosunku do skrajnej lewej krawędzi żelu.

Następnie załaduj próbki DNA strawione enzymami restrykcyjnymi, zapewniając trzycentymetrową odległość między każdą parą. Uruchom żel w KZM przez 19 do 24 godzin przy napięciu 0,85 V na centymetr, aby oddzielić produkty pośrednie według wielkości. Następnego dnia usuń żel z bufora.

Wyciąć pierwsze trzy centymetry żelu zawierającego drabinę. Wybarwić segment żelu w KZM zawierającym 0,3 mikrograma na mililitr bromku etydyny przez 10 do 15 minut. Następnie zwizualizuj drabinę za pomocą systemu dokumentacji żelowej.

Na żelu agarozowym dodaj 1,3 centymetra do szacowanej lokalizacji, uzyskując wartość A. Następnie odejmij 7,5 centymetra od wartości A, uzyskując wartość B. Dopasuj linijkę do żelu pierwszego wymiaru i przetnij poziomo w poprzek przy wartościach A i B. Następnie przetnij pionowo w dół trzycentymetrowej przestrzeni zarezerwowanej dla każdej próbki. W nowej tacy odlewniczej obróć segmenty zgodnie z ruchem wskazówek zegara i umieść je w pozycji studzienek na próbki. Przygotować żel agarozowy drugiego wymiaru o stężeniu od 1 do 1,3% w TBE z 0,3 mikrograma na mililitr bromku etydyny.

Podgrzej żel, a po schłodzeniu do około 55 stopni Celsjusza wylej go na obrócone segmenty pierwszego wymiaru. Pozostaw żel do zestalenia się na godzinę. Po zestaleniu przenieść żel do komory zawierającej KZM w stężeniu 0,3 mikrograma na mililitr bromku etydyny i pozostawić do zrównoważenia przez 30 minut.

Przykryj żel i pracuj przez dziewięć do 10 godzin przy napięciu 4,23 wolta na centymetr w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć żel drugiego wymiaru z komory. i oczyszczać fragmenty DNA przez 10 minut w 0,24 molowym roztworze kwasu solnego z delikatnym kołysaniem.

Spłucz żel wodą dejonizowaną i namocz go w 0,4 molowym wodorotlenku sodu na 10 do 15 minut. Następnie złożyć dwa długie arkusze bibuły chromatograficznej prostopadle do tafli szkła, rozciągając się do pojemnika. Aby złożyć Southern blot, napełnij pojemnik jednym litrem 0,4 molowego wodorotlenku sodu.

Wyrównaj długą taflę szkła w poprzek pojemnika. Zwilż górną część papieru wodorotlenkiem sodu i ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza pod jego powierzchnią. Namocz trzy arkusze bibuły chromatograficznej wodorotlenkiem sodu i umieść je na papierze folderowym.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Odwróć żel drugiego wymiaru do góry nogami i umieść go na bibułkach chromatograficznych. Zwilż dodatnio naładowaną nylonową membranę wodą dejonizowaną i umieść ją na żelu.

Następnie umieść trzy arkusze chromatograficzne zwilżone wodą dejonizowaną na membranie. Przykryj odsłonięty wodorotlenek sodu w pojemniku folią, aby zapobiec parowaniu. Umieść na plamie stos serwetek lub ręczników papierowych o wysokości od 0,3 do 0,5 metra.

Ściśnij całą plamę ciężarkiem, aby ułatwić szczelne działanie naczyń włosowatych i pozostaw go na dwa dni w celu przeniesienia DNA do błony.