Name: Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek mezenchymalnych do zastosowań w regeneracji tkanek. Protokół zapewnia wysoką czystość izolowanych pęcherzyków przy zachowaniu ich integralności strukturalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Emanuele Canonico za wsparcie techniczne. Część tych prac została przeprowadzona w ALEMBIC, zaawansowanym laboratorium mikroskopowym założonym przez IRCCS Ospedale San Raffaele i Università Vita-Salute San Raffaele. Prace Enrico Ragni i Laury de Girolamo były wspierane przez włoskie Ministerstwo Zdrowia "Ricerca Corrente".

Fluorescence-Based Sorting of Adipose-Derived Extracellular Vesicles

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza i sortowanie EV jest trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary i fakt, że znajdują się one w pobliżu granicy wykrywalności większości cytometrów przepływowych. Naszym celem było opracowanie protokołu izolacji pojazdów elektrycznych pochodzących z AMSC oznaczonych CFSE. CFSE została wybrana jako metoda barwienia ze względu na zgłoszoną wysoką skuteczność znakowania EV (≥90%), bez tworzenia się niepożądanych cząstek, takich jak agregaty białkowe wydzielane przez przeciwciała. Niemniej jednak możliwe jest, że niewiele EV bez esterazy może zostać pominiętych i konieczne będą przyszłe badania w celu zidentyfikowania metod barwienia zdolnych do oznaczania tych cząstek do protokołów sortowania19.
Naszym celem było stworzenie warunków sortowania, które pozwolą na zbieranie czystych pojazdów elektrycznych bez zmiany ich właściwości fizycznych. Udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu możliwości technicznych zastosowanego sortera i wdrożeniu określonych środków, takich jak zmniejszenie standardowego ciśnienia sortowania w zależności od rozmiaru dyszy. Ustaliliśmy i zwalidowaliśmy te warunki sortowania za pomocą kulek polistyrenowych FSC. Następnie zastosowaliśmy ten protokół do pojazdów elektrycznych ASC, powtarzając eksperyment cztery razy i konsekwentnie osiągając podobne wyniki, potwierdzając w ten sposób powtarzalność naszego protokołu.
Należy jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych aspektów i ograniczeń, które tutaj przedstawiamy. (i) Czystość posortowanej próbki: trudno jest jednoznacznie udowodnić czystość posortowanych EV z dodatnim wynikiem CFSE, ponieważ szum tła przyrządu zawsze pojawia się podczas ponownej analizy. Możemy jednak założyć, że wzbogaciliśmy populację CFSE-dodatnią. Brak zdarzeń CFSE dodatnich w populacji CFSE ujemnej wskazuje, że nasz proces sortowania zakończył się sukcesem, pośrednio wykazując czystość posortowanej próbki. (ii) Potencjalne zanieczyszczenie posortowanej próbki: nie możemy wykluczyć możliwości, że posortowana frakcja może zawierać małe pęcherzyki, które są niewykrywalne przez przyrząd i mogą zostać przypadkowo włączone do kropli sortujących. (iii) Integralność EV po sortowaniu: Zdajemy sobie sprawę, że nacisk wywierany przez przyrząd może potencjalnie uszkodzić pęcherzyki. Aby temu zapobiec, zastosowaliśmy dyszę 70 μm o niższym ciśnieniu 35 psi zamiast standardowych 60 psi. Dodatkowo starannie przygotowaliśmy próbki, unikając etapów ultrawirowania, które mogłyby zmienić właściwości fizyczne pojazdów elektrycznych. Pomimo tych środków ostrożności nie możemy zagwarantować, że posortowane pojazdy elektryczne pozostaną nienaruszone i niezmienione. Dlatego zalecamy włączenie analizy po sortowaniu oraz, jeśli to możliwe, testów funkcjonalnych w celu oceny stanu pojazdów elektrycznych.
Oto kilka możliwych modyfikacji i rozwiązywania problemów z protokołem. Protokół ten został ustalony za pomocą przyrządu, który umożliwia zmianę ciśnień; jednak w przypadku instrumentów o bardziej rygorystycznych ustawieniach zaleca się użycie dyszy 100 μm, aby uzyskać niższe ciśnienie, aby w jak największym stopniu zachować integralność pojazdów elektrycznych.
Pomimo tych rozważań twierdzimy, że nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami separacji EV. Po pierwsze, pozwala na izolację określonych populacji pojazdów elektrycznych. Chociaż zdecydowaliśmy się na barwienie pęcherzyków za pomocą CFSE - barwnika fluorescencyjnego, który identyfikuje struktury z nienaruszonymi błonami komórkowymi - możliwe jest również sortowanie określonych populacji EV za pomocą przeciwciał monoklonalnych. W takich przypadkach niezbędne są dodatkowe kontrole barwienia. Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV), Międzynarodowe Towarzystwo Postępu Cytometrii (ISAC) oraz Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH) zapewniają kompleksowe wytyczne dotyczące przeprowadzania powtarzalnych eksperymentów z cytometrią przepływową. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w wytycznych MISEV 20231 i MIFlowCyt -EV18. Po drugie, procedura ta jest mniej czasochłonna niż inne metody, które obejmują wiele etapów ultrawirowania.
Naszym zdaniem protokół ten może być skuteczną strategią separacji i zbierania określonej populacji pojazdów elektrycznych, która może być potencjalnie przydatna do celów terapeutycznych.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna grupa pęcherzyków o strukturze błonowej, uwalnianych przez prawie wszystkie komórki, oddzielonych dwuwarstwą lipidową, niezdolnych do samodzielnej replikacji1. Można je znaleźć w kilku płynach biologicznych, takich jak osocze krwi, surowica, ślina, mleko matki, mocz, płyn z płukania oskrzeli, płyn owodniowy, płyn mózgowo-rdzeniowy i wodobrzusze złośliwe2. Jedną z głównych funkcji EV jest transport różnych cząsteczek, w tym kwasów nukleinowych, białek, lipidów i węglowodanów, między komórką dawcy a biorcą. Może się to zdarzyć poprzez różne mechanizmy, takie jak bezpośrednia fuzja błony, interakcja receptor-ligand, endocytoza i fagocytoza3,4. Z tego powodu wykazano, że odgrywają one ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych i są bardzo obiecujące jako nowe biomarkery choroby, jako nośniki dostarczania leków i jako środki terapeutyczne5,6.
Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) to komórki multipotencjalne, które można wyizolować z wielu tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, miazgi zębowej, krwi pępowinowej, łożyska, płynu owodniowego, galaretki Whartona, a nawet mózgu, płuc, grasicy, trzustki, śledziony, wątroby i nerek. W ostatnich latach wzbudziły one spore zainteresowanie medycyną regeneracyjną7. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) mogą być pobierane z tkanki tłuszczowej za pomocą mniej inwazyjnej procedury w porównaniu z innymi źródłami, takimi jak szpik kostny, co skutkuje niższym ryzykiem poważnych powikłań i unikaniem problemów etycznych8.
Dodatkowo, tkanka tłuszczowa zawiera znacznie wyższe stężenie MSCs niż szpik kostny (1% w porównaniu do >0,01%) i inne źródła, takie jak skóra właściwa, miazga zębowa, pępowina i łożysko. MSCs odgrywają kluczową rolę w regeneracji uszkodzonych tkanek i komórek ze względu na ich zdolność do różnicowania i wydzielania szerokiego repertuaru czynników wzrostu, chemokin i cytokin; Te korzyści terapeutyczne wynikają z ich zdolności różnicowania, ale także z faktu, że wydzielają szeroki repertuar czynników wzrostu, chemokin i cytokin. Uderzającym przykładem jest potencjał terapeutyczny MSCs w przypadku schorzeń ortopedycznych, przy czym termin "choroby układu mięśniowo-szkieletowego" ma większą liczbę zarejestrowanych badań klinicznych w ramach clinicaltrials.gov (dostęp 13 maja 2024 r.).>
Ponadto, MSC mogą również wydzielać EVs, które biorą udział w regeneracji tkanek poprzez przekazywanie informacji do uszkodzonych komórek lub tkanek i wywierają aktywność biologiczną podobną do komórek macierzystych9,10. Z tego powodu MSC-EVs mogą być cennym substytutem terapii komórkowej w celu osiągnięcia podejścia bezkomórkowego11, z dwoma badaniami klinicznymi z udziałem MSC-EV w schorzeniach ortopedycznych (NCT05261360 i NCT04998058). Nadal jednak istnieje kilka wyzwań związanych z klinicznymi zastosowaniami pojazdów elektrycznych. Na przykład istnieją pewne obawy dotyczące technik izolacji pojazdów elektrycznych: większość z nich nie gwarantuje czystości ani integralności pęcherzyków. Co więcej, niektóre techniki izolacji są złożone, czasochłonne i mają niską powtarzalność, co czyni je nieodpowiednimi do użytku klinicznego12.
Sortowanie komórek, z drugiej strony, jest powszechnie stosowaną metodą, która pozwala na izolację pojedynczych komórek od heterogenicznych zawiesin komórkowych przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych13. Może być używany do wielu zastosowań i dostosowany do różnych typów próbek. Jednakże, chociaż sortowanie komórek jest dobrze ugruntowaną i szeroko stosowaną technologią, sortowanie EV jest nadal bardzo trudne, ponieważ większość EV znajduje się poniżej minimalnego progu wykrywalności nawet dla najbardziej czułych cytometrów przepływowych. Istnieje kilka cech, które sprawiają, że sorter jest bardziej odpowiedni do tego celu. Po pierwsze, zastosowanie systemu Jet-in-air, w którym strumień zawieszający cząstki jest badany przez lasery w powietrzu, a nie w komorze przepływowej; System ten zachowuje próbkę poprzez zmniejszenie naprężeń, którym jest poddawana. Drugim ważnym punktem jest obecność paska "zaciemniającego" między strumieniem a soczewką zbierającą, która zmniejsza szum optyczny tła instrumentu. Chociaż jest niski, szum tła nie jest całkowicie wyeliminowany i stanowi odniesienie, które zapewnia częściowy wgląd w zdarzenia, które mieszczą się w progu: jest to bardzo ważne dla analizy zdarzeń, które są bliskie "granicy wykrywalności" instrumentu14. Wreszcie, sortownik jest wyposażony w dwuścieżkowe rozproszenie do przodu (FSC) z dwiema różnymi maskami, które pozwalają na lepszą dyskryminację małych i dużych cząstek w próbce.
Na tej podstawie opracowaliśmy protokół mający na celu oddzielenie estrów sukcynimidylowych karboksyfluoresceiny (CFSE) oznaczonych MSC-EV za pomocą sortera komórek o wysokiej czułości. Aby zminimalizować manipulację pojazdami elektrycznymi oraz zachować ich integralność i ilość, uniknęliśmy etapów ultrawirowania podczas przygotowywania próbki. Ponadto dostosowano warunki sortowania w celu zminimalizowania naprężeń pęcherzyków, w tym dalszej optymalizacji naszego urządzenia poprzez zmniejszenie ciśnienia sortowania związanego z rozmiarem dyszy (dysza 70 μm przy ciśnieniu 35 psi).

<table><tbody><tr><td>Dioctan 5(6)-karboksyfluoresceiny&nbsp; Ester N-sukcynimidylowy</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalne komórki zrębu tłuszczowego</td><td>Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gr&eacute; goire, Francja</td><td></td><td>Komórki użyte w tym badaniu</td></tr><tr><td>Alexa 488 anty-kaweolina</td><td>R& D Systems</td><td>IC5736G</td><td>Przeciwciało do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie CD44</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>Przeciwciało do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie CD63</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>Przeciwciało do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie CD81 (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>Przeciwciało do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie CD9</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>Cytometria przepływowa przeciwciało</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>BC CytoFLEX S wyposażone w 3 lasery, niebieski, czerwony i fioletowy</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>Fluorescencyjne kulki kontrolne do MoFLO Astrios EQ</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo (wersja 10.8.1)</td><td>BD</td><td>wersja 10.8.1</td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>Zestaw IntraSure</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>Utrwalanie i przepuszczalność do barwienia wewnątrzkomórkowego</td></tr><tr><td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>Koraliki polistyrenowe FSC&nbsp;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ wyposażony w 4 lasery, niebieski, żółty - zielony, fioletowy i czerwony</td></tr><tr><td>Mysz przeciwciało anty-FLOT1</td><td>Laboratoria Transdukcji BD</td><td>610820</td><td>Przeciwciało Western Blot</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Calnexin</td><td>Origene</td><td>TA336279</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze anty-CD9 i CD81 (zestaw przeciwciał ExoAb)</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Przeciwciała Western Blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało królika anty-TSG101&nbsp;</td><td>Merck</td><td>HPA006161</td><td>Przeciwciało Western Blot</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Fluorescencyjne cząstki</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometry</td><td></td><td>Organo kulki krzemionkowe do kalibracji rozproszenia</td></tr></tbody></table>

ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) uwalniane przez mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zawierają zestaw mikroRNA pełniących funkcje regeneracyjne i przeciwzapalne. W związku z tym oczyszczone MSC-EV są postrzegane jako opcja terapeutyczna nowej generacji dla szerokiego spektrum chorób. W tym protokole przedstawiamy strategię skutecznego sortowania EV od supernatantu MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), często stosowanych w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej w ortopedii.
Najpierw opisaliśmy przygotowanie próbki, skupiając się na etapach izolacji EV i znakowania estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE) do wykrywania fluorescencji; następnie szczegółowo opisaliśmy proces sortowania, który stanowi główną część protokołu. 
Oprócz zasad określonych w wytycznych MISEV 2023 i MIFlowCyt EV, zastosowaliśmy specyficzne warunki eksperymentalne dotyczące rozmiaru dyszy, częstotliwości i ciśnienia w osłonie. Parametry morfologiczne ustala się za pomocą koralików o średnicach dobranych tak, aby pokrywały teoretyczny zakres wielkości EV. Po sortowaniu ASC-EVs przeprowadziliśmy kontrolę czystości posortowanej frakcji, ponownie analizując ją za pomocą sortera i weryfikując rozkład wielkości EV za pomocą techniki analizy śledzenia nanocząstek.
Ze względu na rosnące znaczenie pojazdów elektrycznych, posiadanie czystej populacji do zbadania i scharakteryzowania staje się kluczowe. W tym miejscu przedstawiamy zwycięską strategię, aby skonfigurować sortowanie, aby osiągnąć ten cel.

Kulek polistyrenowych FSC poddano sortowaniu w celu walidacji konfiguracji instrumentu oraz warunków sortowania. Kulki polistyrenowe FSC stanowią mieszaninę kulek fluorescencyjnych o rozmiarach 10 nm, 30 nm, 50 nm i 90 nm, które są widoczne w kanale FITC. Rysunek 7A przedstawia wykres kropkowy w skali logarytmicznej SSC względem skali logarytmicznej FITC z czterema populacjami kulek przed sortowaniem. Populacje fluorescencyjne o rozmiarach 10 nm, 30 nm i 50 nm zostały wyznaczone za pomocą bramek i posortowane. Posortowane kulki przeanalizowano pod kątem czystości i wzbogacenia jako wstępny dowód koncepcji (Rysunek 7B). Wszystkie populacje były czyste po sortowaniu. Referencyjny szum tła jest zawsze widoczny na wykresach kropkowych przed i po sortowaniu.
Aby spełnić wymagania określone w wytycznych MISEV2018/2023 oraz wykazać naturę pęcherzyków i stopień ich czystości, przeprowadzono eksperymenty w celu analizy markerów obecnych lub nieobecnych na EV. Pęcherzyki EV wykazują obecność niektórych specyficznych markerów powierzchniowych15: CD9, CD63, CD81 oraz CD44. CD9, CD63 i CD81 należą do rodziny tetraspanin wśród białek błonowych i są najczęstszymi markerami służącymi do identyfikacji egzosomów16. CD4 jest markerem silnie ekspresowanym przez MSC i ASC17.
EVs wykazują również obecność białka cytozolowego Caveolin, co zostało wykazane w eksperymencie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, analiza western blot potwierdza obecność CD9, CD81, TSG101 i Flotillin oraz brak obecności Calnexin (Rycina 2).
Następnie ASC-EVs znakowane CFSE zostały poddane sortowaniu zgodnie z opisem w protokole. Procedurę sortowania powtórzono czterokrotnie, zachowując dokładnie te same warunki przygotowania próbek, barwienia i sortowania (Tabela 1). W ten sposób wykazano powtarzalność protokołu.
Przeprowadzono zestaw eksperymentów w celu analizy populacji ASC-EV wykupionych przy użyciu CFSE oraz wykazania, że ich charakterystyka nie uległa zmianie w wyniku sortowania. W szczególności ekspresja CD9, CD63, CD81 oraz CD4 nie zmienia się po sortowaniu (Rysunek 6A).
Kolejnym krytycznym punktem jest kwestia wymiarów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) oraz tego, jak mogą one ulec zmianie po procedurze sortowania z powodu stresu wywołanego przez ciśnienie. Analiza po sortowaniu była trudna do przeprowadzenia ze względu na niewielką ilość próbki, jednak analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) wykazuje, że rozkład dwóch próbek ASC-EVs (przed i po sortowaniu) był taki sam (Rycina 6B). Wreszcie analiza EVs za pomocą TEM wykazuje, że ich morfologia nie uległa znaczącej zmianie po sortowaniu (Rycina 6C).
Warto zauważyć, że zgodnie z wytycznymi ramowymi MIFlowCyt-EV18, po potraktowaniu próbek 0,1% Triton X-100 zaobserwowano zmniejszenie liczby EVs dodatnich dla CFSE, co potwierdza ich pęcherzykowe pochodzenie (Rycina 8).
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg" /> 
Rycina 7:&#160;Sortowanie polistyrenowych kulek. (A) Wykres kropkowy SSC/FITC kulek przed sortowaniem. Wykresy kropkowe SSC/FITC kulek po ponownej analizie po sortowaniu: (B) posortowane kulki 10 nm, (C) posortowane kulki 30 nm oraz (D) posortowane kulki 50 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rycina 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg" /> 
Rycina 8:&#160;Degradacja błony EV w obecności Triton X-10. Do próbki dodano Triton X-10 w stężeniu 0,1% na 15 min w temperaturze pokojowej. Przedstawiono reprezentatywne wykresy rozproszone z trzech niezależnych eksperymentów dla próbek niepoddanych działaniu odczynnika (lewo) i poddanych działaniu odczynnika (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eksperyment</td>
			<td>Liczba wyseparowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)&#160;</td>
			<td>Liczba CFSE+ posortowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs)</td>
			<td>Ciśnienie (psi)</td>
			<td>Dysza mm</td>
			<td>Częstotliwość (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106</td>
			<td>4,8 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>4 x 106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Powtarzalność procedury sortowania

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

Dlatego głównym celem naszych badań jest zbadanie mezenchymalnych komórek zrębu, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do regeneracji tkanek. Zagadnieniem i celem naszych badań jest przełożenie podejścia bezkomórkowego na zastosowanie kliniczne wraz z terapiami komórkowymi. Charakterystyka ma kluczowe znaczenie, a obecnie posiadanie czystego pęcherzyka do głębokiej charakterystyki jest bardzo trudne, ponieważ nie ma protokołów pozwalających osiągnąć wysoką czystość.Dlatego chcieliśmy wdrożyć technologię sortowania komórek, aby zbadać, scharakteryzować i ostatecznie przełożyć na praktykę kliniczną to nowe podejście oparte na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, Nasz protokół składa się z czterech części, przygotowania próbki, charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, sortowania i analizy po sortowaniu. Skupimy się na części sortującej. Jak zobaczysz, niektóre polecenia będą wykonywane w oprogramowaniu sortującym, a inne na ekranie dotykowym.Nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami separacji pojazdów elektrycznych. Po pierwsze, zastosowanie 70 mikrodysz przy ciśnieniu 35 psi pozwala zachować integralność sortowania końcowego EV. Następnie możliwe jest wyizolowanie określonej populacji EV, a na końcu urządzenie pozwala zapisać ustawienia sortowania, aby proces był powtarzalny.W naszym laboratorium pracujemy nad opracowaniem nowego wielokolorowego panelu do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W szczególności skupiamy się na ustawieniu aparatury i badaniu fluorochromów. Wierzymy, że możliwość zidentyfikowania i oddzielenia rzadkiej populacji pęcherzyków może zapewnić dobrą poprawę ich charakterystyki, a także badania ich roli w procesach biologicznych.Aby rozpocząć, otwórz przewód ciśnieniowy i system próżniowy sortera komórek. Włącz urządzenie, otwórz szafę bezpieczeństwa biologicznego i uruchom oprogramowanie sortownika. Zwiększ ciśnienie w układzie hydraulicznym, a następnie włącz układ hydrauliczny.Aktywuj napęd kroplowy kryształu piezoelektrycznego w dyszy, który wibruje, tworząc kropelki. Wykonaj procedurę usuwania bąbelków, aby wyeliminować pęcherzyki w systemie. Następnie uruchom pięciomililitrową tubkę roztworu czyszczącego na pięć minut przy wysokiej różnicy ciśnień, a następnie pięciomililitrową rurkę z dejonizowaną wodą na pięć minut.Aby wykonać procedurę ręcznego uruchamiania, przejdź do zakładki sterowania laserem i włącz moc lasera. Sprawdź wyrównanie strumienia w pionie. Aby określić plamkę lasera, naciśnij zaczep przechwytywania strumienia laserowego.Kliknij przycisk z zieloną strzałką i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze dotykowym. Zainicjuj IntelliSort i ustaw częstotliwość upuszczania wraz z domyślną wartością amplitudy, która powoduje, że strumień tworzy kropelkę. W przypadku procedury precyzyjnego wyrównywania laserowego załaduj pięciomililitrową tubkę koralików wyrównujących QC do próbnika i uruchom ją w protokole QC.Na karcie precyzyjnego wyrównania wybierz żądane parametry na osiach X i Y, aby wyświetlić dobrze zagęszczone i zestawione ściegi. Po sprawdzeniu ręcznego wyrównania wykonaj automatyczną kontrolę jakości przy średnicy koralików QC ustawionej na trzy mikrometry. Zapisz akwizycję QC w protokole wyrównania oprogramowania.Aby sfinalizować IntelliSort, umieść płytki odchylające we właściwej pozycji w sortowniku i włącz napięcie na około 3 000 woltów. Wybierz wyjście sortowania z sześcioma probówkami. Wybierz strumienie na wskaźniku strumienia, aby je włączyć, i wykonaj strumień testowy.Włącz przycisk automatycznego określania opóźnienia upuszczania przez funkcję IntelliSort, aby ustawić prawidłowe opóźnienie upuszczania i ponownie zweryfikować strumienie. Następnie aktywuj tryb utrzymywania funkcji IntelliSort i ręcznie sprawdź opóźnienie upuszczania. Załaduj ręczny protokół opóźnienia zrzutu do oprogramowania sortera i zdobądź fluorescencyjne kulki kontrolne.Po wstawieniu odpowiedniego uchwytu slajdu wybierz sortowanie, a następnie kreatora opóźnienia upuszczania i logiki sortowania. Sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, czy 97% koralików fluorescencyjnych jest obecnych na piątej kałuży. Aby rozpocząć, skonfiguruj sortowanie komórek i aktywuj funkcję IntelliSort.Po wykonaniu kalibracji rozproszenia należy wykonać kroki akwizycji próbki dla każdej próbki. Aby utworzyć nowy protokół sortowania próbek, wybierz plik, a następnie protokół i nowy na pasku narzędzi. Kliknij ustawienie akwizycji danych w oprogramowaniu sortującym.W oknie parametrów akwizycji wybierz interesujące Cię kanały i wyłącz pozostałe. Następnie umieścić pięciomililitrową probówkę z próbką w próbniku. Na ekranie dotykowym kliknij przycisk ładowania.Na pasku narzędzi oprogramowania sortującego wybierz opcję Pobieranie i naciśnij przycisk Start. Gdy pojawi się okno właściwości próbki, wstaw nazwę próbki i kliknij przycisk OK. Aby utworzyć strategię bramkowania, wybierz histogram, a następnie utwórz histogram.Utwórz trzy wykresy kropkowe, pierwszy z logarytmem 488-FSC1-Height na osi X i 488-SSC-Height log na osi Y. Drugi z 488-FSC-2 Height log na osi X i 488-SSC-Height log na osi Y, a trzeci z 488 513 X 26 CFSE Height log na osi X i 488-SSC Height log na osi Y. Kliknij pozycję pobieranie, a następnie przycisk Start i wstaw nazwę przykładu.Podczas akwizycji narysuj region identyfikujący negatywne zdarzenia CFSE i jeden identyfikujący pozytywne zdarzenia CFSE. Następnie na karcie sortowania zidentyfikuj region do sortowania. Gdy natężenie przepływu jest stabilne, wybierz akwizycję, a następnie zatrzymaj.Rozpocznij sortowanie, wybierając opcję sortowania na pasku narzędzi oprogramowania sortującego. Aby zapisać ustawienia sortowania, wybierz opcję sortuj na pasku narzędzi, a następnie kliknij przycisk Zapisz ustawienia sortowania. Aby sprawdzić czystość posortowanej populacji, najpierw zaopatrz się w pięciomililitrową tubkę roztworu czyszczącego na 10 minut przy wysokiej różnicy ciśnień, a następnie pięciomililitrową probówkę z dejonizowaną wodą przez 10 minut.Pobrać 0,22-mikrometrowy, przefiltrowany PBS i sprawdzić, czy nie występują żadne pozytywne zdarzenia CFSE. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów posortowanej próbki w 100 mikrolitrach 0,22-mikrometrowego, przefiltrowanego PBS. Pobrać posortowane próbki i zapisać objętości Ekspresja CD9, CD63, CD81 i CD44 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki tłuszczowej nie zmieniła się po sortowaniu CFSE.Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że rozkład wielkości pęcherzyków pozostał spójny przed i po sortowaniu. Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała, że morfologia pęcherzyków nie uległa znaczącym zmianom w procesie sortowania. Dodatkowo leczenie było 0,1%Triton X-100 zmniejszył liczbę pęcherzyków CFSE dodatnich, potwierdzając ich pęcherzykowe pochodzenie.

setting-a-successful-sorting-for-extracellular-vesicle-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Poznaj metodę sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek mezenchymalnych do zastosowań w regeneracji tkanek. Protokół zapewnia wysoką czystość izolowanych pęcherzyków przy zachowaniu ich integralności strukturalnej.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów