Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Dlatego głównym celem naszych badań jest zbadanie mezenchymalnych komórek zrębu, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych do regeneracji tkanek. Zagadnieniem i celem naszych badań jest przełożenie podejścia bezkomórkowego na zastosowanie kliniczne wraz z terapiami komórkowymi. Charakterystyka ma kluczowe znaczenie, a obecnie posiadanie czystego pęcherzyka do głębokiej charakterystyki jest bardzo trudne, ponieważ nie ma protokołów pozwalających osiągnąć wysoką czystość.

Dlatego chcieliśmy wdrożyć technologię sortowania komórek, aby zbadać, scharakteryzować i ostatecznie przełożyć na praktykę kliniczną to nowe podejście oparte na pęcherzykach zewnątrzkomórkowych, Nasz protokół składa się z czterech części, przygotowania próbki, charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, sortowania i analizy po sortowaniu. Skupimy się na części sortującej. Jak zobaczysz, niektóre polecenia będą wykonywane w oprogramowaniu sortującym, a inne na ekranie dotykowym.

Nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami separacji pojazdów elektrycznych. Po pierwsze, zastosowanie 70 mikrodysz przy ciśnieniu 35 psi pozwala zachować integralność sortowania końcowego EV. Następnie możliwe jest wyizolowanie określonej populacji EV, a na końcu urządzenie pozwala zapisać ustawienia sortowania, aby proces był powtarzalny.

W naszym laboratorium pracujemy nad opracowaniem nowego wielokolorowego panelu do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W szczególności skupiamy się na ustawieniu aparatury i badaniu fluorochromów. Wierzymy, że możliwość zidentyfikowania i oddzielenia rzadkiej populacji pęcherzyków może zapewnić dobrą poprawę ich charakterystyki, a także badania ich roli w procesach biologicznych.

Aby rozpocząć, otwórz przewód ciśnieniowy i system próżniowy sortera komórek. Włącz urządzenie, otwórz szafę bezpieczeństwa biologicznego i uruchom oprogramowanie sortownika. Zwiększ ciśnienie w układzie hydraulicznym, a następnie włącz układ hydrauliczny.

Aktywuj napęd kroplowy kryształu piezoelektrycznego w dyszy, który wibruje, tworząc kropelki. Wykonaj procedurę usuwania bąbelków, aby wyeliminować pęcherzyki w systemie. Następnie uruchom pięciomililitrową tubkę roztworu czyszczącego na pięć minut przy wysokiej różnicy ciśnień, a następnie pięciomililitrową rurkę z dejonizowaną wodą na pięć minut.

Aby wykonać procedurę ręcznego uruchamiania, przejdź do zakładki sterowania laserem i włącz moc lasera. Sprawdź wyrównanie strumienia w pionie. Aby określić plamkę lasera, naciśnij zaczep przechwytywania strumienia laserowego.

Kliknij przycisk z zieloną strzałką i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze dotykowym. Zainicjuj IntelliSort i ustaw częstotliwość upuszczania wraz z domyślną wartością amplitudy, która powoduje, że strumień tworzy kropelkę. W przypadku procedury precyzyjnego wyrównywania laserowego załaduj pięciomililitrową tubkę koralików wyrównujących QC do próbnika i uruchom ją w protokole QC.

Na karcie precyzyjnego wyrównania wybierz żądane parametry na osiach X i Y, aby wyświetlić dobrze zagęszczone i zestawione ściegi. Po sprawdzeniu ręcznego wyrównania wykonaj automatyczną kontrolę jakości przy średnicy koralików QC ustawionej na trzy mikrometry. Zapisz akwizycję QC w protokole wyrównania oprogramowania.

Aby sfinalizować IntelliSort, umieść płytki odchylające we właściwej pozycji w sortowniku i włącz napięcie na około 3 000 woltów. Wybierz wyjście sortowania z sześcioma probówkami. Wybierz strumienie na wskaźniku strumienia, aby je włączyć, i wykonaj strumień testowy.

Włącz przycisk automatycznego określania opóźnienia upuszczania przez funkcję IntelliSort, aby ustawić prawidłowe opóźnienie upuszczania i ponownie zweryfikować strumienie. Następnie aktywuj tryb utrzymywania funkcji IntelliSort i ręcznie sprawdź opóźnienie upuszczania. Załaduj ręczny protokół opóźnienia zrzutu do oprogramowania sortera i zdobądź fluorescencyjne kulki kontrolne.

Po wstawieniu odpowiedniego uchwytu slajdu wybierz sortowanie, a następnie kreatora opóźnienia upuszczania i logiki sortowania. Sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, czy 97% koralików fluorescencyjnych jest obecnych na piątej kałuży. Aby rozpocząć, skonfiguruj sortowanie komórek i aktywuj funkcję IntelliSort.

Po wykonaniu kalibracji rozproszenia należy wykonać kroki akwizycji próbki dla każdej próbki. Aby utworzyć nowy protokół sortowania próbek, wybierz plik, a następnie protokół i nowy na pasku narzędzi. Kliknij ustawienie akwizycji danych w oprogramowaniu sortującym.

W oknie parametrów akwizycji wybierz interesujące Cię kanały i wyłącz pozostałe. Następnie umieścić pięciomililitrową probówkę z próbką w próbniku. Na ekranie dotykowym kliknij przycisk ładowania.

Na pasku narzędzi oprogramowania sortującego wybierz opcję Pobieranie i naciśnij przycisk Start. Gdy pojawi się okno właściwości próbki, wstaw nazwę próbki i kliknij przycisk OK. Aby utworzyć strategię bramkowania, wybierz histogram, a następnie utwórz histogram.

Utwórz trzy wykresy kropkowe, pierwszy z logarytmem 488-FSC1-Height na osi X i 488-SSC-Height log na osi Y. Drugi z 488-FSC-2 Height log na osi X i 488-SSC-Height log na osi Y, a trzeci z 488 513 X 26 CFSE Height log na osi X i 488-SSC Height log na osi Y. Kliknij pozycję pobieranie, a następnie przycisk Start i wstaw nazwę przykładu.

Podczas akwizycji narysuj region identyfikujący negatywne zdarzenia CFSE i jeden identyfikujący pozytywne zdarzenia CFSE. Następnie na karcie sortowania zidentyfikuj region do sortowania. Gdy natężenie przepływu jest stabilne, wybierz akwizycję, a następnie zatrzymaj.

Rozpocznij sortowanie, wybierając opcję sortowania na pasku narzędzi oprogramowania sortującego. Aby zapisać ustawienia sortowania, wybierz opcję sortuj na pasku narzędzi, a następnie kliknij przycisk Zapisz ustawienia sortowania. Aby sprawdzić czystość posortowanej populacji, najpierw zaopatrz się w pięciomililitrową tubkę roztworu czyszczącego na 10 minut przy wysokiej różnicy ciśnień, a następnie pięciomililitrową probówkę z dejonizowaną wodą przez 10 minut.

Pobrać 0,22-mikrometrowy, przefiltrowany PBS i sprawdzić, czy nie występują żadne pozytywne zdarzenia CFSE. Następnie rozcieńczyć pięć mikrolitrów posortowanej próbki w 100 mikrolitrach 0,22-mikrometrowego, przefiltrowanego PBS. Pobrać posortowane próbki i zapisać objętości Ekspresja CD9, CD63, CD81 i CD44 w pęcherzykach zewnątrzkomórkowych pochodzących z tkanki tłuszczowej nie zmieniła się po sortowaniu CFSE.

Analiza śledzenia nanocząstek wykazała, że rozkład wielkości pęcherzyków pozostał spójny przed i po sortowaniu. Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała, że morfologia pęcherzyków nie uległa znaczącym zmianom w procesie sortowania. Dodatkowo leczenie było 0,1%Triton X-100 zmniejszył liczbę pęcherzyków CFSE dodatnich, potwierdzając ich pęcherzykowe pochodzenie.