Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy
20 września 2024
Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.
Egzosomy pochodzące z tkanek przyciągają coraz większą uwagę ze względu na ich zdolność do dokładnego odzwierciedlania specyfiki tkankowej i mikrośrodowiska. Nasze badania koncentrowały się na ustaleniu podstawowej i translacyjnej roli egzosomów pochodzących ze śledziony w chorobach sercowo-naczyniowych. W tym badaniu opracowujemy praktyczny protokół izolowania egzosomów z tkanek śledziony myszy, zapewniając powtarzalną technikę późniejszej analizy identyfikacyjnej i badań funkcjonalnych.
Do trawienia używamy kolagenazy typu I, a następnie filtracji przez ultrawirowanie różnicowe, aby uzyskać wysokiej jakości egzosom śledziony. W przeciwieństwie do poprzednich doniesień, wykorzystujących homogenizację tkanek w celu uzyskania zawiesiny tkankowej, nasze podejście zachowuje integralność błonową komórek w tkankach. Technika ta może być szczególnie przydatna w badaniu roli egzosomu w odpowiedziach immunologicznych.
Biorąc pod uwagę krytyczną funkcję śledziony w układzie odpornościowym, przyszłe badania mogą dostosować ten protokół do tkanek ludzkich, umożliwiając ekstrakcję klinicznie istotnego egzosomu w celach diagnostycznych i terapeutycznych. Na początek należy wstępnie schłodzić wirówki szybkoobrotowe i ultraszybkie do czterech stopni Celsjusza i ustawić temperaturę wytrząsarki biurkowej na 37 stopni Celsjusza. Przygotuj naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 milimetrów.
Następnie ułóż 50 mililitrów sterylnych probówek wirówkowych, lód i sterylne sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Spryskaj 75% alkoholem, aby wysterylizować nożyczki i kleszcze i podgrzej je w wysokiej temperaturze, aby dalej sterylizować. Następnie umieść tkankę śledziony na sterylnej 100-milimetrowej szalce Petriego na lodzie i zmyj krew z powierzchni zimnym 1X PBS.
Dokładnie osusz śledzionę sterylną gazą przed zważeniem tkanek. Następnie, za pomocą sterylnej pipety transferowej, dodaj jeden mililitr PBS do sitka komórkowego o średnicy 70 mikrometrów, aby je zwilżyć. Na koniec przygotuj 0,1% kolagenazę typu I w 1X PBS za pomocą miksera wirowego, aby uzyskać bufor trawienny.
Aby rozpocząć, przygotuj odczynniki i sterylne narzędzia do przetwarzania tkanek. Nożyczkami posiekaj tkankę śledziony na małe, jednolite kawałki w naczyniu hodowlanym na lodzie i przenieś je do 50-mililitrowej probówki wirówkowej za pomocą sterylnej pipety transferowej. Następnie dodaj bufor wytrawiający do probówki w oparciu o wagę tkanki śledziony i potrząśnij rurką pod kątem 45 stopni na poziomym wytrząsarce ustawionym na 37 stopni Celsjusza.
Przerwij trawienie, gdy kawałki tkanki rozproszą się, a większość kawałków straci swój kształt. Przełóż strawioną mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów w temperaturze pokojowej, aby usunąć włókniste i większe resztki tkanek. Zebrać filtrat do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej.
Odwirować filtrat o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki i powtórzyć etap wirowania z odpowiednią prędkością. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant i przemyć osad PBS.
Ponownie odwirować w temperaturze 120 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wyizolować egzosomy. Na koniec rozpuść wyizolowane egzosomy w 200 mikrolitrach sterylnego PBS na śledzionę i przechowuj je w dwumililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniły obecność pęcherzyków w kształcie miseczki z dwuwarstwą lipidową, charakterystyczną dla egzosomów.
Rozmiary egzosomów wahały się od 30 do 150 nanometrów, ze szczytowym stężeniem na poziomie 60 nanometrów, jak pokazano na wykresie rozkładu rozmiarów. Analiza Western blot potwierdziła obecność markerów egzosomalnych, TSG101 i CD9, podczas gdy GM130 i kontrola negatywna nie zostały wykryte.
Przegląd
To badanie przedstawia praktyczny protokół izolacji egzosomów z tkanek śledziony myszy, który jest kluczowy dla zrozumienia ich roli w chorobach układu krążenia. Metoda łączy trawienie kolagenazą typu I z ultrawirowaniem, zapewniając wysokiej jakości wydajność egzosomów przy jednoczesnym zachowaniu integralności błony komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Badania nad układem krążenia
Tło
- Egzosomy pochodzące z tkanek odzwierciedlają specyficzność tkankową i mikrośrodowisko.
- Egzosomy pochodzące ze śledziony odgrywają rolę w odpowiedziach immunologicznych.
- Zrozumienie funkcji egzosomów jest istotne dla badań nad chorobami układu krążenia.
- Poprzednie metody mogą naruszać integralność błony.
Cel badania
- Rozwój powtarzalnego protokołu izolacji egzosomów pochodzących ze śledziony.
- Ułatwienie późniejszych analiz identyfikacji i badań funkcjonalnych.
- Poprawa rozumienia ról egzosomów w chorobach układu krążenia.
Zastosowanie metod
- Trawienie tkanki śledziony za pomocą kolagenazy typu I.
- Filtracja poprzez różnicowe ultrawirowanie.
- Izolacja wysokiej jakości egzosomów.
- Zachowanie integralności błony komórkowej podczas procesu.
Główne wyniki
- Udana izolacja egzosomów pochodzących ze śledziony.
- Wysokiej jakości egzosome nadające się do dalszej analizy.
- Metoda wykazuje poprawę zachowania integralności błony.
- Potencjalne zastosowania w badaniu odpowiedzi immunologicznych.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w izolowaniu egzosomów ze śledziony myszy.
- Ta technika może ulepszyć badania nad funkcjami egzosomów w chorobach układu krążenia.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do różnych zastosowań w immunologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
