Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo
September 27th, 2024
Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.
Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu i poprawie regeneracji kości. W tym miejscu naszym celem jest obszerne scharakteryzowanie mineralizacji tkanek przy użyciu różnych i uzupełniających się podejść technicznych, aby ułatwić wczesną identyfikację obiecujących kandydatów do terapii regeneracji kości. Aby ocenić jakość i strukturę nowo zmineralizowanej tkanki, stosujemy podejścia uzupełniające, w tym obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikro-CT w połączeniu z analizą głębokiego uczenia, nano wgłębienie, badania histologiczne, mapowanie skaningowej mikroskopii elektronowej z rozpraszaniem wstecznym i spektroskopię Ramana.
Naprawa ubytków kostnych jest dużym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej. Opracowaliśmy modele eksplantatów, które ułatwiają ocenę regeneracji kości i monitorowanie mineralizacji w czasie. Na początek użyj systemu transferu autografów kostno-chrzęstnych, aby stworzyć defekt o średnicy 4,75 milimetra w bocznym kłykciu owcy, która została poddana eutanazji.
Za pomocą młotka ortopedycznego stwórz ubytek o głębokości 10 milimetrów i odzyskaj eksplant kostno-chrzęstny z kłykcia. Przygotować cement fosforanowo-wapniowy uzupełniony 40 mikrogramami na mililitr BMP-2 i załadować pastę cementową do 3-mililitrowej strzykawki. Następnie wstrzyknąć cement do ubytku eksplantatu za pomocą igły o rozmiarze 18.
Włącz aparat rentgenowski do mikrotomografii i umieść probówkę eksplantacyjną na uchwycie próbki. Ustaw rozdzielczość na 10,7 mikrometra, a czas ekspozycji na 1 200 milisekund za pomocą 1-milimetrowego filtra aluminiowego o napięciu 80 kilowoltów i 125 mikroamperach. Uśredniaj trzy obrazy na każdy przyrost obrotu o 0,45 stopnia, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
Aby przeprowadzić segmentację obrazu, użyj kreatora zintegrowanej segmentacji, aby wytrenować model uczenia głębokiego w celu rozróżnienia kości i cementu. Wybierz reprezentatywną strefę zawierającą kość, cement i tło ze zrekonstruowanych obrazów mikrotomografii komputerowej i podziel tę pierwszą klatkę na segmenty. Teraz w zakładce model wygeneruj model głębokiego uczenia i wybierz procedurę 3D U-Net.
Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowany model i ustaw parametry eksperymentalne, takie jak głębokość 5, rozmiar łaty 32 na 32, algorytm Adadelta, współczynnik kroku 0,25 i dane 10X. Użyj podzielonej na segmenty ramki, aby wytrenować model uczenia głębokiego, klikając przycisk trenowania. Po zakończeniu trenowania zdefiniuj drugą klatkę i automatycznie podziel ją na segmenty za pomocą funkcji przewidywania.
Następnie kliknij eksport, aby opublikować wytrenowany model i zastosować go do całego zestawu danych mikrotomografii komputerowej, wybierając segment, wyeksportowany model, pełny zestaw danych segmentu. Na początek odwodnić eksplant kostno-chrzęstny pobrany od owiec w 40-mililitrowej szklanej fiolce zawierającej 25 mililitrów roztworu odwadniającego. Umieścić fiolki na obracającym się kole na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Po ostatnim praniu zastąp roztwór odwadniający 25 mililitrami ksylenu. Umieścić szklane fiolki na obracającym się kole na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10% nadtlenku benzoilu, 10% ftalanu dibutylu i 450 mikrolitrów N, N-dimetyloaniliny rozcieńczonej od 1 do 20 w propanolu i umieść szklaną fiolkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc.
Teraz umieść eksplant w średniej wielkości formie do osadzania w plastikowym pudełku. Wlej metakrylan metylu, nadtlenek benzoilu, ftalan dibutylu, N, roztwór N-aniliny do formy. Przewietrz formę przepływem azotu przez pięć minut.
Zamknij hermetycznie pudełko i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 48 godzin w celu polimeryzacji i utwardzenia MMA. Po dwóch dniach usuń żywicę zawierającą eksplant z formy. Przeciąć blok polimetakrylanu metylu zawierający eksplant za pomocą piły diamentowej wzdłuż jego długiej osi, aby wygenerować przekrój o grubości 1,5 milimetra przy 3 000 obr./min z prędkością 3 milimetrów na minutę.
Zmiel sekcję papierem z węglika krzemu z rosnącymi liczbami. Węgiel pokryj gruby przekrój 10-nanometrową folią węglową. Zamontuj sekcję na aluminiowym króćcu, a następnie utwórz srebrny mostek malarski między górną częścią sekcji a króćcem, aby umożliwić odprowadzanie ładunku elektronów do ziemi.
Umieść kikut na stoliku skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM. Zamknij komorę i zainicjuj próżnię. Włącz wiązkę elektronów i dostosuj ustawienia SEM, aby działały w trybie elektronów wstecznie rozproszonych.
Ustaw standardy poziomu szarości na 25 dla węgla, 225 dla aluminium i 253 dla krzemu. Po skalibrowaniu SEM ze wzorcami uzyskaj obrazy próbki w trybie elektronów wstecznie rozproszonych. Użyj obrazu elektronów wstecznie rozproszonych próbki, aby przekształcić poziomy szarości na zawartość wapnia.
Następnie wykreśl zawartość rozkładu wapnia na obrazie. Umieść sekcję na stoliku mikrospektrometru Ramana. Skalibruj liczbę fali pod kątem dokładności i wyrównaj laser przed pomiarem.
Aby zebrać widma Ramana, użyj lasera o długości fali 785 nm i mocy 30 miliwatów. Ustaw czas integracji na 20 sekund. Powtórz trzy razy i użyj zakresu spektralnego od 350 do 1 800 centymetrów z gradacją 1 200 linii na milimetr.
Po skalibrowaniu systemu nano indentation umieść próbkę w układzie optycznym i określ miejsce nano indentacji. Następnie przenieś próbkę pod urządzenie do wtłaczania. Ustaw głębokość wcięcia na 900 nanometrów z prędkością załadunku i rozładunku 40 milimetrów na minutę i 15-sekundową przerwą między załadunkiem a rozładunkiem.
Ustaw współczynnik Poissona dla tkanki kostnej na 0,3 i rozpocznij nanowcięcie.
Przegląd
To badanie koncentruje się na ocenie regeneracji kości poprzez kompleksową ocenę mineralizacji tkanki. Zastosowanie różnych podejść technicznych ma na celu zwiększenie zrozumienia nowego tworzenia kości i poprawę rozwoju terapii regeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Regeneracja kości
- Mineralizacja tkanki
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Naprawianie uszkodzeń kości jest znaczącym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej.
- Rozumienie mineralizacji tkanki jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Komplementarne podejścia techniczne mogą zapewnić kompleksową ocenę jakości kości.
- Modele eksplantów mogą ułatwić ocenę regeneracji kości w czasie.
Cel badania
- Dokładna charakterystyka mineralizacji tkanki.
- Identyfikacja obiecujących kandydatów na terapie regeneracji kości.
- Dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat nowego tworzenia kości.
Stosowane metody
- Wysokiej rozdzielczości 3D z obrażem micro-CT.
- Analiza głębokiego uczenia.
- Nano wciskanie.
- Badania histologiczne i mapowanie skaningową mikroskopią elektronową z rozproszeniem tyłowym.
- Spektroskopia Ramana.
Główne wyniki
- Opracowanie modeli eksplantów do oceny regeneracji kości.
- Skuteczna monitoryzacja mineralizacji w czasie.
- Identyfikacja metryk strukturalnych i jakościowych dla nowo zmineralizowanej tkanki.
Wnioski
- Multimodalna analiza zwiększa rygor badań w zakresie regeneracji kości.
- Oceny jakościowe i ilościowe mogą prowadzić do lepszych kandydatów terapeutycznych.
- To podejście może znacząco wpłynąć na przyszłe strategie medycyny regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Comprehensive characterization of tissue mineralization in ex vivo bone models addresses a critical gap in early-stage regenerative medicine R&D by enabling robust evaluation of bone substitute performance. This multimodal workflow enhances predictive confidence in candidate biomaterials and growth factors, supporting more informed portfolio triage and de-risking at the discovery-to-preclinical interface. Standardized, quantitative outputs facilitate cross-study comparability and accelerate translational decision-making for bone regeneration therapies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of pro-osteogenic growth factor effects on bone formation.
- Supports mechanistic de-risking by integrating structural, compositional, and mechanical readouts.
- Provides functional validation of biomaterial and growth factor combinations in a disease-relevant ex vivo system.
- Facilitates predictive confidence in candidate selection for further development.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible protocols for quantitative assessment of mineralization and tissue quality.
- Prepares validated explant models for downstream screening of novel bone substitutes and biologics.
- Enables high-throughput, multi-modal data generation for comparative evaluation of candidate materials.
- Supports assay scalability and platform reuse across discovery programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo mineralization metrics with translational biomarkers relevant to bone healing.
- Ensures continuity from discovery-stage screening to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces translational risk by providing mechanistic insight into bone-biomaterial interactions.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for pipeline candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing a standardized platform for evaluating bone regeneration strategies in a controlled ex vivo environment.
- Discovery Biology: Integrates hypothesis-driven testing of growth factors and biomaterials using quantitative mineralization and mechanical endpoints.
- Screening: Offers reproducible, multi-modal assays for comparative analysis of candidate bone substitutes.
- Analytics: Delivers high-resolution imaging, deep learning segmentation, and quantitative compositional data to support robust statistical comparisons.
- Translational Research: Aligns ex vivo findings with preclinical and clinical biomarker strategies for bone repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow adaptable to diverse bone regeneration programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone regeneration candidate evaluation.
- Operational Value: Drives standardization, reproducibility, and scalability of mineralization assays across teams.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires multidisciplinary expertise in imaging, histology, biomechanics, and data analytics.
- Demands access to advanced instrumentation such as micro-CT, SEM, Raman spectroscopy, and nano-indentation systems.
- Necessitates rigorous cross-team protocol standardization for reproducibility.
- Adaptable to various large animal and biomaterial models with appropriate validation.
- Dependent on robust data management and statistical analysis infrastructure.
