Name: Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj kompleksową charakterystykę mineralizacji tkanek w modelu ex vivo dla regeneracji kości. Metoda obejmuje mikro-CT, nanoindentację i spektroskopię Ramana, umożliwiając ocenę jakości nowo zmineralizowanej tkanki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy podziękować obiektom technicznym zaangażowanym w zbieranie i przetwarzanie okazów, w tym SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), University of Nantes), SFR ICAT (University of Angers), BIO3, HiMolA i SC4BIO. Inserm UMR_S 1229 RMeS jest wspierany przez dotacje rządu francuskiego za pośrednictwem instytucji Inserm, Nantes Université, Univ Angers i Oniris VetAgroBio. CL jest również wdzięczny HTL Biotechnology.

Multimodal Analysis of Bone Formation Using Explant Models

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
<li>Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoussi%2C+H+%22SSRN%22">SSRN</a>. , (2024).</li>
<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Naprawa ubytków kostnych jest głównym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej mającym na celu przywrócenie mobilności, zmniejszenie bólu i poprawę jakości życia osób dotkniętych chorobą. Stosowanie modeli eksplantatów oferuje szereg korzyści w porównaniu z badaniami in vivo w zakresie badania naprawy ubytków kostnych. Oprócz względów etycznych, model ten pozwala na rygorystyczną kontrolę warunków eksperymentalnych i zmniejszenie zmienności biologicznej, ułatwiając w ten sposób generowanie dokładniejszych i bardziej powtarzalnych wyników. Ponadto właściwości mechaniczne i biologiczne kości owcy są ściśle zbliżone do właściwości kości ludzkiej w porównaniu z innymi zwierzętami23,24. To sprawia, że model eksplantatu owiec jest szczególnie istotnym wyborem dla badań przedklinicznych i reprezentatywnym modelem warunków klinicznych u ludzi.
Wraz z rozwojem metodologii obrazowania i nauk o materiałach, opisany tutaj model eksplantatu stanowi dobry model do badania wpływu medycyny regeneracyjnej na tkanki szkieletowe w kontrolowanym środowisku, zmniejszając błąd systematyczny eksperymentu. Wymiary i morfologia eksplantatu są optymalne do szczegółowej analizy neoosteogenezy i właściwości materiału, umożliwiając kompleksową ocenę i charakterystykę25. Wyniki te podkreślają potencjał modelu w zakresie przekładu klinicznego, oferując solidne ramy do oceny substytutów przeszczepów kostnych i zwiększając prawdopodobieństwo pomyślnych wyników klinicznych w terapiach regeneracji kości. Co więcej, model ułatwia precyzyjną ocenę osteointegracji i wydajności biomateriału, które są kluczowymi czynnikami w opracowywaniu skutecznych strategii naprawy kości.
Aby zapewnić powodzenie badania, bardzo ważne jest skrupulatne przestrzeganie kluczowych kroków protokołu. Jednym z najważniejszych aspektów jest upewnienie się, że próbka jest całkowicie odwodniona podczas procesu zatapiania. Pozostała wilgoć może utrudniać prawidłowe osadzanie żywicy, prowadząc do rozmytej i nieprzezroczystej żywicy, co może zagrozić jasności i dokładności wyników, a także może spowodować podczas sekcji histologicznej. Ta staranna dbałość o szczegóły jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Aby zapewnić dokładną konwersję poziomów szarości na mapę zawartości wapnia, konieczne jest zastosowanie kalibracji przy użyciu kubka Faradaya oraz wzorców C, Al i Si do analizy SEM. Kluczowe znaczenie ma zapewnienie spójności w stosowaniu tego samego SEM dla wszystkich próbek, ponieważ różnice w detektorach elektronów wstecznie rozproszonych mogą prowadzić do zmienności wyników. W spektroskopii Ramana kalibracja liczby falowej i dokładna korekta linii podstawowej są niezbędne do wykluczenia tła fluorescencji i rozróżnienia pików z żywicy zatapiającej i próbki. W przypadku nanotwardości uzyskanie idealnie gładkiej powierzchni ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę limity przemieszczenia wgłębników, a kalibracja za pomocą znanego wzorca, takiego jak stopiona krzemionka, jest niezbędna do zapewnienia wiarygodnych pomiarów.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów związanych z tymi technikami często dotyczą anizotropowej natury materiału kostnego, która może potencjalnie wpływać na spójność pomiarów. Dla przykładu, w spektroskopii Ramana polaryzacja padającego lasera może mieć znaczący wpływ na rejestrowaną intensywność. Użycie obiektywu 20x z małą aperturą numeryczną może pomóc w złagodzeniu tego problemu. Niezwykle ważne jest również zapewnienie spójnych warunków kalibracji i pomiarów we wszystkich próbkach w celu utrzymania integralności danych. Nieodłączna anizotropia kości stanowi ograniczenie tych metodologii, ponieważ może wpływać na jednolitość pomiarów, szczególnie w technikach takich jak spektroskopia Ramana. Co więcej, konieczność precyzyjnej kalibracji i kontroli środowiskowej może ograniczyć ogólne zastosowanie, jeśli aspekty te nie są skrupulatnie zarządzane.
Potencjalne zastosowanie tych podejść w znacznym stopniu obejmuje ocenę nowych biomateriałów i strategii terapeutycznych w zakresie naprawy kości. Zdolność modelu do ścisłego naśladowania fizjologii kości człowieka stanowi solidną platformę do badań przedklinicznych, umożliwiając dokładną ocenę bezpieczeństwa i skuteczności nowych metod leczenia w kontrolowanych warunkach. Użyteczność tego modelu jest szczególnie istotna dla przyspieszenia ścieżki translacyjnej od badań laboratoryjnych do praktyki klinicznej, ułatwiając wczesną identyfikację obiecujących kandydatów do terapii regeneracji kości. Zapewniając wiarygodną i powtarzalną metodę oceny materiałów do naprawy kości, technika ta wspiera postęp medycyny regeneracyjnej i opracowywanie klinicznie opłacalnych rozwiązań.

Wady kości, czy to spowodowane urazem, resekcją guza, wrodzonymi anomaliami czy infekcją, stanowią główne wyzwanie dla medycyny regeneracyjnej. Zmiany te zagrażają integralności strukturalnej układu kostnego, prowadząc do dyskomfortu, upośledzenia funkcjonalnego i obniżenia jakości życia pacjentów.
Aby sprostać tym wyzwaniom, pojawiły się innowacyjne strategie naprawy kości, koncentrujące się na poprawie osteogenezy i regeneracji tkanki kostnej. Podejścia te obejmują stosowanie wszczepialnych, wstrzykiwanych lub drukowanych w 3D substytutów kości, które mogą być pochodzenia naturalnego (np. makrocząsteczki pochodzenia biologicznego, hydroksyapatyt pochodzenia zwierzęcego) lub syntetycznego (np. bioszkła, fosforany wapnia)1. Aby zwiększyć ich niską wrodzoną zdolność do kierowania i stymulowania regeneracji kości, substytuty kości mogą być ładowane czynnikami osteoindukcyjnymi, takimi jak białka morfogenetyczne kości (BMP), w celu promowania osteogennego różnicowania komórek progenitorowych i poprawy tworzenia kości2.
Tworzenie kości opiera się na początkowym tworzeniu matrycy kolagenowej, która jest następnie mineralizowana przez kryształy hydroksyapatytu, wzmacniając w ten sposób strukturę kości3. Proces ten nadaje kości określoną sztywność i wytrzymałość. Jakość zmineralizowanej tkanki jest ściśle regulowana przez jej cechy mikrostrukturalne i stopień mineralizacji4. Ta cecha odgrywa kluczową rolę w gojeniu kości i funkcjonalności zregenerowanej kości5. Jednak charakterystyka mineralizacji kości pozostaje trudnym zadaniem ze względu na nieodłączną zmienność w badaniach wielowymiarowych6,7,8.
Ponadto, wstępne oceny biokompatybilności, cytokompatybilności i potencjału różnicowania substytutów przeszczepów kostnych są zazwyczaj przeprowadzane in vitro. Rozbieżności metodologiczne utrudniają jednak bezproblemowe porównywanie wyników. Co więcej, te badania in vitro nie oddają w pełni interakcji wielokomórkowych i złożonego dialogu między populacjami komórek, w tym komórkami szpiku kostnego, które są niezbędne do regulacji procesu regeneracji kości9. Ten brak dokładnego odwzorowania mikrośrodowiska kości może zagrozić dokładności kolejnych badań przedklinicznych10.
Chociaż oceny in vivo dostarczają dokładniejszego odwzorowania kontekstów fizjologicznych, są one ograniczone względami etycznymi, logistycznymi i finansowymi. W związku z tym oceny ex vivo odgrywają kluczową rolę jako interfejs między badaniami in vitro i in vivo, służąc jako niezbędny etap pośredni przed przejściem do eksperymentów na żywych obiektach11,12,13.
W tym kontekście, potrzebne jest wdrożenie kompleksowych metodologii charakteryzacji, aby ocenić jakość zregenerowanej tkanki kostnej i zapewnić adekwatność strategii przed przejściem do modelu przedklinicznego. W związku z tym proponujemy protokół oparty na analizie modelu eksplantacji z wykorzystaniem tkanki stawu kolanowego owcy. Ta innowacyjna metodologia polega na wszczepieniu cementu obciążonego BMP2 do eksplantatów i przeprowadzeniu szczegółowej analizy mineralizacji tkanek po 28 dniach hodowli.
Podejścia techniczne zastosowane w tym badaniu są zróżnicowane i komplementarne, łącznie zapewniając kompleksowe podejście do oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Obrazowanie mikrotomografią komputerową o wysokiej rozdzielczości umożliwia szczegółową wizualizację 3D struktury kości, dostarczając cennych informacji na temat gęstości mineralnej, morfologii i integralności nowo powstałej tkanki. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla oceny skuteczności regeneracji kości i monitorowania postępu mineralizacji w czasie. Nanotwardość to precyzyjne podejście do określania właściwości mechanicznych tkanki, takich jak jej twardość i wytrzymałość. Mierząc reakcję materiału na przyłożoną siłę w skali nanometrycznej, metoda ta umożliwia ocenę wytrzymałości i jakości zmineralizowanej tkanki. Badania histologiczne z użyciem powszechnych barwień, takich jak hematoksylina / eozyna / szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata dostarczają bezcennych informacji na temat struktury i składu tkanek. Barwienia te umożliwiają różnicowanie różnych składników tkanki, w tym komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i złogów mineralnych, umożliwiając w ten sposób kompleksową ocenę jakościową procesu regeneracji kości. Mapowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z rozproszeniem wstecznym (SEM) zapewnia wizualizację powierzchni próbek w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając szczegółową analizę stopnia mineralizacji macierzy kostnej, a także interfejsów między wszczepionym materiałem a tkanką gospodarza. Wreszcie, spektroskopia Ramana dostarcza informacji na temat składu molekularnego tkanki, w szczególności poprzez identyfikację określonych składników, takich jak białka, lipidy i minerały. Takie podejście umożliwia scharakteryzowanie zmineralizowanej matrycy i wykrycie czynników wzrostu, takich jak BMP2, dostarczając tym samym kluczowych informacji na temat utrzymywania się bodźców proosteogennych w pożywce regeneracyjnej.
Korzystając z multidyscyplinarnego podejścia, integrując różne techniki analityczne, nasze badanie ma na celu dostarczenie dokładnej i wszechstronnej oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej, zapewniając tym samym solidną podstawę do oceny substytutów przeszczepów kostnych i ich potencjalnego zastosowania klinicznego.

<table><tbody><tr><td>Filtry 0,20</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18 G (1,2x40 mm)</td><td></td><td>Strzykawka Sterican</td> 4665120 <td></td></tr><tr><td>3 ml</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>37% kwas solny&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowaty)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Apatytyczny fosforan trójwapniowy&nbsp;</td><td>Centrum Inżynierii Biomedycznej i Opieki Zdrowotnej (Mines Saint Etienne, Francja)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azofloksyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Nadtlenek benzoilu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp;</td><td>InductOs 1,5 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Brillant crocein&nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Skyscan-Diamond</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>blade</td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Piła diamentowa</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 roztwór diamentowy</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 roztwór diamentowy</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Phtalan dibutylu</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie DragonFly&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX(TM), pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y- Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Erytrozyna B</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Firma Merck&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fuksynowy</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Biosura</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prasa izostatyczna</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 prętów</td><td></td></tr><tr><td>Granulometria dyfrakcji laserowej</td><td>&nbsp; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Jasnozielony</td><td>Prolabo&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Węglan litu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ściereczka polerska MD-Mol</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Metylocykloheksan</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metylocykloheksan&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metylocykloheksan&nbsp;</td><td>Firma VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metakrylan metylu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomografia komputerowa, mikroskaner&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Dimethylanilin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Stacja nanotwardości</td> Ściereczka polerska <td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego OATS, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)Sigma</td><td>&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do obsadzania</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfomolibdenowy&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfotynowy</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do</td><td>polerowania Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospektrometr Ramana</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>Folie SiC/Bibułki szlifierskie</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Farba srebrna</td><td>Mikroskopia elektronowa nauki</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy króciec z kubkiem Faradaya, wzorcami węglowymi, aluminiowymi i silikonowymi</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xylidine Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Obszerna charakterystyka mineralizacji tkanek w kontekście regeneracji kości stanowi poważne wyzwanie, biorąc pod uwagę liczne modalności, które są obecnie dostępne do analizy. W tym miejscu proponujemy przepływ pracy w celu kompleksowej oceny tworzenia się nowych kości przy użyciu odpowiedniego eksplantatu kostnego ex vivo dla dużych zwierząt. Ubytek kostny (średnica = 3,75 mm; głębokość = 5,0 mm) powstaje w eksplantowanej głowie kości udowej owcy i wstrzykuje się mu makroporowaty substytut kości obciążony proosteogennym czynnikiem wzrostu (białko morfogenetyczne kości 2 - BMP2). Następnie eksplant jest utrzymywany w kulturze przez okres 28 dni, co umożliwia kolonizację komórkową i późniejsze tworzenie kości. Aby ocenić jakość i strukturę nowo zmineralizowanej tkanki, stosuje się następujące następujące metody: (i) Charakterystyka i obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości całego eksplantatu za pomocą mikro-CT, a następnie analizy obrazów głębokiego uczenia w celu zwiększenia dyskryminacji zmineralizowanych tkanek; (ii) nanowgłębienie w celu określenia właściwości mechanicznych nowo powstałej tkanki; (iii) badania histologiczne, takie jak hematoksylina/eozyna/szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata w celu zapewnienia jakościowej oceny zmineralizowanej tkanki, szczególnie w odniesieniu do wizualizacji bariery kostnej i obecności komórek kostnych; (iv) Mapowanie skaningowej mikroskopii elektronowej z rozpraszaniem wstecznym (SEM) z wewnętrznym odniesieniem w celu ilościowego określenia stopnia mineralizacji i dostarczenia szczegółowych informacji na temat morfologii powierzchni, składu mineralnego i granicy faz kość-biomateriał; (v) Spektroskopia Ramana w celu scharakteryzowania składu molekularnego zmineralizowanej matrycy i uzyskania wglądu w trwałość BMP2 w cemencie poprzez wykrycie wiązań peptydowych. Ta multimodalna analiza zapewni skuteczną ocenę nowo powstałych kości oraz kompleksowe jakościowe i ilościowe informacje na temat zmineralizowanych tkanek. Poprzez standaryzację tych protokołów dążymy do ułatwienia porównań między badaniami oraz poprawy trafności i wiarygodności wyników badań.

Obraz mikro-TK eksplantu przedstawiono na Rysunku 2. Przy zastosowaniu segmentacji ręcznej nie można optymalnie oddzielić kości od cementu znajdującego się w kanale centralnym przy użyciu globalizacji progu. Aby poprawić rozpoznawanie kości beleczkowej i cementu, proponujemy zastosowanie uczenia głębokiego. Uczenie głębokie jest skuteczne w rozpoznawaniu charakterystyk biomateriałów i pomaga usprawnić oddzielenie kości od cementu, co umożliwia lepszą ocenę oddziaływań na styku cement-kość. Jest to kwestia najwyższej wagi, aby dokładnie określić ilość kości powstałej na granicy z cementem i nie włączać błędnych pikseli do tych obliczeń.
Jednak samo ilościowe określenie zawartości kości na styku nie jest wystarczające do charakterystyki nowo powstałej tkanki kostnej. Wymagane jest bardziej szczegółowe badanie jakości macierzy kostnej oraz składu komórkowego, aby lepiej zrozumieć wytrzymałość nowej kości i mechanizmy komórkowe, które doprowadziły do powstania tej nowej macierzy. Macierz kostną można scharakteryzować za pomocą dwóch komplementarnych podejść: qBEI oraz mikrospektroskopii Ramanowskiej. Przykład obrazu qBEI przedstawiono na Rysunku 3. W metodzie qBEI każdy piksel zakodowany w skali szarości jest przekształcany w stężenie wapnia. Jest to warunek niezbędny do oceny rozkładu zawartości wapnia w kości beleczkowej i zrozumienia (i) stopnia mineralizacji nowo powstałej kości na styku z cementem oraz (ii) czy obecność cementu zaburza mineralizację kości beleczkowej. Zaletą qBEI jest możliwość uzyskania obrazu o wysokiej rozdzielczości w bardzo krótkim czasie, w przeciwieństwie do mikrospektroskopii Ramanowskiej, która wymaga dłuższego czasu akwizycji. Parametry qBEI, takie jak Camean, Capeak i Cawidth, mogą być następnie wyprowadzone z rozkładu wapnia i wykorzystane do porównania odpowiedzi między dwoma cementami lub biomateriałami.
Z drugiej strony qBEI nie dostarcza żadnych informacji na temat jakości fazy organicznej macierzy kostnej na styku z biomateriałem. Dodatkowe informacje dotyczące właściwości materiałowych fazy organicznej pozyskuje się za pomocą mikrospektroskopii Ramanowskiej. Mikrospektroskopię Ramanowską wykonuje się na tej samej próbce, która była wykorzystywana do qBEI, po szybkim szlifowaniu i polerowaniu powierzchni w celu usunięcia przewodzącej warstwy węgla. W mikrospektroskopii Ramanowskiej widma są zbierane dla każdego piksela. Przykłady surowych, nieprzetworzonych i przetworzonych widm Ramanowskich przedstawiono na Rysunku 4. Każde widmo zawiera informacje o składzie analizowanego piksela i obejmuje piki związane z żywicą zatapiającą (w tym przypadku pMMA), fazą mineralną (piki v1PO4 i v1CO3) oraz fazą organiczną (piki Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. i Amide I). W przykładzie na Rysunku 4 nieprzetworzone widmo wykazuje udział żywicy powłokowej przy ~812 cm-1 oraz niezerową, zakrzywioną linię bazową z powodu fluorescencji, mimo zastosowania laseru bliskiej podczerwieni. Przetwarzanie widm jest niezbędne dla zapewnienia dokładnego obliczenia poszczególnych parametrów Ramanowskich, w szczególności w celu wyeliminowania fluorescencji tła. Podczas akwizycji danych użytkownik powinien zadbać zarówno o dokładne pozycjonowanie, jak i unikanie nasycenia detektora, aby potwierdzić obecność piku v1PO4 znajdującego się przy ~960 cm-1. Po obróbce danych oblicza się stosunki intensywności pików zgodnie z położeniem charakterystycznego modu wibracyjnego.
Należy jednak rozważyć, czy zmiany w składzie materiału doprowadziły do zmian w odpowiedzi biomechanicznej. Aby zebrać informacje na temat biomechaniki nowo powstałej kości, systematycznie przeprowadzamy badania nanoindentacyjne na tej samej próbce, która była wykorzystywana do mikrospektroskopii Ramanowskiej. Informacje o właściwościach mechanicznych tkanki uzyskuje się z krzywych nanoindentacyjnych przedstawiających zależność obciążenia od głębokości (Rysunek 5). Warto zauważyć, że głębokość nie powraca do zera po zakończeniu testu, co wskazuje na odkształcenie plastyczne i trwałe uszkodzenie materiału. Szybkość pełzania przy wciskaniu jest wyznaczana z krzywej zależności głębokości od czasu.
Na koniec, do oceny odpowiedzi tkankowej na biomateriał na poziomie komórkowym stosuje się barwienie histologiczne (Rysunek 6). Zaproponowane barwienia histologiczne pozwalają na określenie obecności tkanki osteoidowej, a także na identyfikację komórek (makrofagów, wielojądrowych komórek olbrzymich, osteoklastów, osteoblastów) oraz ewentualną obecność torebki włóknistej na styku z biomateriałem. Jest to niezwykle istotne dla zrozumienia biokompatybilności biomateriału, a także trwałości nowo powstałej kości w miarę degradacji biomateriału.
Ogólnie rzecz biorąc, podejście wielometodowe umożliwia szczegółowe badanie procesu tworzenia kości, jakości nowo powstałej tkanki kostnej oraz składu komórkowego. Przy zastosowaniu proponowanej kolejności sekwencyjnej wszystkie analizy można przeprowadzić na tej samej próbce, co pozwala zredukować koszty i czas przetwarzania.
<img alt="Analiza cementu eksplantatu: mikrotomografia, SEM, spektroskopia Ramana, uczenie głębokie, barwienie histologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Abstrakt graficzny. Tutaj przedstawiono podsumowanie kroków protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza próbki kostnej; porównanie segmentacji; manualna vs. głębokie uczenie; wyniki obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analizy micro-CT i głębokiego uczenia. (A) Rekonstrukcja 3D obrazów micro-CT. (B) Segmentacja kości i cementu: porównanie segmentacji manualnej i głębokiego uczenia. Pasek skali = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie gęstości kości i analiza zawartości wapnia; schemat z danymi spektralnymi; mapowanie minerałów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ilościowe obrazowanie elektronów wstecznie rozproszonych w celu określenia zawartości wapnia. (A) Obraz elektronów wstecznie rozproszonych, składający się z poziomów szarości uzyskanych w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jest przekształcany przez oprogramowanie do analizy obrazu w (B) mapę wapnia pokazującą punkty o najwyższym stężeniu w próbce kości. (C) Przedstawiono wykres rozkładu zawartości wapnia w zależności od powierzchni kości i obliczono trzy główne parametry qBEI: Camean, Capeak oraz Cawidth. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy widm Ramana porównujące struktury molekularne; zawierają etykiety piku dla v_PO4 i v_CO3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład widm Ramana. (A) Surowe, nieprzetworzone widmo Ramana uzyskane w zakresie spektralnym 800 - 1800 cm-1. Tło fluorescencyjne jest wyraźnie widoczne, ponieważ widma nie zaczynają się od 0. Wkład żywicy (pMMA) jest wyraźnie widoczny przy ~812 cm-1. (B) Widmo przetworzone. Pozycje różnych interesujących modów drgań są zaznaczone na widmie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do nanoindentacji z systemem optycznym; wykresy obciążenia w funkcji czasu; analiza głębokości wgłębienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Badanie właściwości mechanicznych tkanki za pomocą nanoindentacji. (A) Urządzenie do nanoindentacji składa się z części optycznej służącej do zdefiniowania lokalizacji obszaru zainteresowania na powierzchni bloku próbki, po czym blok zostaje przesunięty pod część indentyczną. (B>) Podczas testu indentacji wykreślone są zależności obciążenia od czasu oraz głębokości od czasu, które służą do wygenerowania (C>) krzywej obciążenia w funkcji głębokości. W tym przykładzie wybrano stałą głębokość 400 nm. Obciążenie maksymalne (Lm), głębokość na koniec obciążania (hl), głębokość po okresie pauzy (hm), nachylenie odcinka odciążania (S) oraz pole pod fazą obciążania i odciążania testu (Wplast) są wyznaczane z krzywej obciążenia w funkcji głębokości i służą do obliczenia różnych parametrów nanoindentacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna prezentująca próbki tkanek barwione do badania; obraz z preparatu mikroskopowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza histologiczna eksplantów osteochondralnych traktowanych cementem po 28 dniach hodowli. (A) Barwienie metodą Movata obrazuje strukturę tkanki, w tym kość oraz cement wypełniający ubytek. (B) Barwienie HES ilustruje integrację tkanki i odpowiedź komórkową wokół cementu. Pasek skali: 2,5 mm. (C) Powiększenie zaznaczonego obszaru na (B), szczegółowo pokazujące interfejs między cementem a otaczającą tkanką, gdzie widoczne są komórki naciekające cement. Pasek skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu i poprawie regeneracji kości. W tym miejscu naszym celem jest obszerne scharakteryzowanie mineralizacji tkanek przy użyciu różnych i uzupełniających się podejść technicznych, aby ułatwić wczesną identyfikację obiecujących kandydatów do terapii regeneracji kości. Aby ocenić jakość i strukturę nowo zmineralizowanej tkanki, stosujemy podejścia uzupełniające, w tym obrazowanie 3D o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikro-CT w połączeniu z analizą głębokiego uczenia, nano wgłębienie, badania histologiczne, mapowanie skaningowej mikroskopii elektronowej z rozpraszaniem wstecznym i spektroskopię Ramana.Naprawa ubytków kostnych jest dużym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej. Opracowaliśmy modele eksplantatów, które ułatwiają ocenę regeneracji kości i monitorowanie mineralizacji w czasie. Na początek użyj systemu transferu autografów kostno-chrzęstnych, aby stworzyć defekt o średnicy 4,75 milimetra w bocznym kłykciu owcy, która została poddana eutanazji.Za pomocą młotka ortopedycznego stwórz ubytek o głębokości 10 milimetrów i odzyskaj eksplant kostno-chrzęstny z kłykcia. Przygotować cement fosforanowo-wapniowy uzupełniony 40 mikrogramami na mililitr BMP-2 i załadować pastę cementową do 3-mililitrowej strzykawki. Następnie wstrzyknąć cement do ubytku eksplantatu za pomocą igły o rozmiarze 18.Włącz aparat rentgenowski do mikrotomografii i umieść probówkę eksplantacyjną na uchwycie próbki. Ustaw rozdzielczość na 10,7 mikrometra, a czas ekspozycji na 1 200 milisekund za pomocą 1-milimetrowego filtra aluminiowego o napięciu 80 kilowoltów i 125 mikroamperach. Uśredniaj trzy obrazy na każdy przyrost obrotu o 0,45 stopnia, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.Aby przeprowadzić segmentację obrazu, użyj kreatora zintegrowanej segmentacji, aby wytrenować model uczenia głębokiego w celu rozróżnienia kości i cementu. Wybierz reprezentatywną strefę zawierającą kość, cement i tło ze zrekonstruowanych obrazów mikrotomografii komputerowej i podziel tę pierwszą klatkę na segmenty. Teraz w zakładce model wygeneruj model głębokiego uczenia i wybierz procedurę 3D U-Net.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy wygenerowany model i ustaw parametry eksperymentalne, takie jak głębokość 5, rozmiar łaty 32 na 32, algorytm Adadelta, współczynnik kroku 0,25 i dane 10X. Użyj podzielonej na segmenty ramki, aby wytrenować model uczenia głębokiego, klikając przycisk trenowania. Po zakończeniu trenowania zdefiniuj drugą klatkę i automatycznie podziel ją na segmenty za pomocą funkcji przewidywania.Następnie kliknij eksport, aby opublikować wytrenowany model i zastosować go do całego zestawu danych mikrotomografii komputerowej, wybierając segment, wyeksportowany model, pełny zestaw danych segmentu. Na początek odwodnić eksplant kostno-chrzęstny pobrany od owiec w 40-mililitrowej szklanej fiolce zawierającej 25 mililitrów roztworu odwadniającego. Umieścić fiolki na obracającym się kole na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Po ostatnim praniu zastąp roztwór odwadniający 25 mililitrami ksylenu. Umieścić szklane fiolki na obracającym się kole na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10% nadtlenku benzoilu, 10% ftalanu dibutylu i 450 mikrolitrów N, N-dimetyloaniliny rozcieńczonej od 1 do 20 w propanolu i umieść szklaną fiolkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc.Teraz umieść eksplant w średniej wielkości formie do osadzania w plastikowym pudełku. Wlej metakrylan metylu, nadtlenek benzoilu, ftalan dibutylu, N, roztwór N-aniliny do formy. Przewietrz formę przepływem azotu przez pięć minut.Zamknij hermetycznie pudełko i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 48 godzin w celu polimeryzacji i utwardzenia MMA. Po dwóch dniach usuń żywicę zawierającą eksplant z formy. Przeciąć blok polimetakrylanu metylu zawierający eksplant za pomocą piły diamentowej wzdłuż jego długiej osi, aby wygenerować przekrój o grubości 1,5 milimetra przy 3 000 obr./min z prędkością 3 milimetrów na minutę.Zmiel sekcję papierem z węglika krzemu z rosnącymi liczbami. Węgiel pokryj gruby przekrój 10-nanometrową folią węglową. Zamontuj sekcję na aluminiowym króćcu, a następnie utwórz srebrny mostek malarski między górną częścią sekcji a króćcem, aby umożliwić odprowadzanie ładunku elektronów do ziemi.Umieść kikut na stoliku skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM. Zamknij komorę i zainicjuj próżnię. Włącz wiązkę elektronów i dostosuj ustawienia SEM, aby działały w trybie elektronów wstecznie rozproszonych.Ustaw standardy poziomu szarości na 25 dla węgla, 225 dla aluminium i 253 dla krzemu. Po skalibrowaniu SEM ze wzorcami uzyskaj obrazy próbki w trybie elektronów wstecznie rozproszonych. Użyj obrazu elektronów wstecznie rozproszonych próbki, aby przekształcić poziomy szarości na zawartość wapnia.Następnie wykreśl zawartość rozkładu wapnia na obrazie. Umieść sekcję na stoliku mikrospektrometru Ramana. Skalibruj liczbę fali pod kątem dokładności i wyrównaj laser przed pomiarem.Aby zebrać widma Ramana, użyj lasera o długości fali 785 nm i mocy 30 miliwatów. Ustaw czas integracji na 20 sekund. Powtórz trzy razy i użyj zakresu spektralnego od 350 do 1 800 centymetrów z gradacją 1 200 linii na milimetr.Po skalibrowaniu systemu nano indentation umieść próbkę w układzie optycznym i określ miejsce nano indentacji. Następnie przenieś próbkę pod urządzenie do wtłaczania. Ustaw głębokość wcięcia na 900 nanometrów z prędkością załadunku i rozładunku 40 milimetrów na minutę i 15-sekundową przerwą między załadunkiem a rozładunkiem.Ustaw współczynnik Poissona dla tkanki kostnej na 0,3 i rozpocznij nanowcięcie.

comprehensive-characterization-tissue-mineralization-an-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

W tym filmie opisujemy metodę wykrywania złogów wapnia wydzielanych przez osteoblasty za pomocą barwnika anionowego, Alizarin Red S. Wyhodowane osteoblasty są najpierw barwione, a następnie barwnik jest odzyskiwany w celu kolorymetrycznego oznaczania ilościowego depozytów wapnia lub stopnia mineralizacji osteoblastów.

Test mineralizacji in vitro: metoda kolorymetryczna do ilościowego oznaczania złogów wapnia w osteoblastach na substytucie przeszczepu kostnego przez barwienie i ekstrakcję czerwieni alizarynowej

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Zwapnienie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do obciążenia chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych. Protokół ten opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania wytrącania wapnia za pośrednictwem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Ten protokół przedstawia ekonomiczną i efektywną metodę ilościowej oceny mikroarchitektury kości w mysim modelu osteoporozy poprzez połączenie barwienia Hematoxylin-Eosin (HE) i technik mikrotomografii komputerowej (Micro-CT).

Ocena mikroarchitektury kości beleczkowej w mysim modelu osteoporozy

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj kompleksową charakterystykę mineralizacji tkanek w modelu ex vivo dla regeneracji kości. Metoda obejmuje mikro-CT, nanoindentację i spektroskopię Ramana, umożliwiając ocenę jakości nowo zmineralizowanej tkanki.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Przeglądaj więcej filmów