Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych
16 września 2025
W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.
Laboratorium Mensah koncentruje się na badaniach naczyniowych i opracowuje nowe techniki badania glikokaliksu śródbłonka i jego roli w chorobach naczyniowych. Ostatnie osiągnięcia obejmują tworzenie bardziej zaawansowanych modeli in vitro do badań nad glikokaliksem oraz badania nad strategiami terapeutycznymi ukierunkowanymi na zdrowie i naprawę glikokaliksu śródbłonka w chorobach. Wyzwania eksperymentalne obejmują niekompletne modele in vitro, które nie są w stanie dokładnie odtworzyć zdrowej glikokaliksu, a także trudne techniki kwantyfikacji i pomiaru.
Nasz obecny wkład w tę dziedzinę poszerzył obecną wiedzę na temat glikokaliksu śródbłonka, szczególnie w zakresie jego roli w przerzutach raka, regeneracji uszkodzonego glikokaliksu i interakcjach z receptorami na powierzchni naczyń krwionośnych. Nasza metoda przedstawia niedrogą i skuteczną metodę tworzenia układów naczyniowych typu narząd na chipie, które wyrażają bardziej rozwinięty i biomimetyczny glikokaliks śródbłonka w porównaniu z konwencjonalnymi technikami. Na początek zważ 10 części bazy z elastomeru silikonowego w 50-mililitrowej probówce wirówkowej.
Wlej jedną część utwardzacza do probówki zawierającej bazę z elastomeru silikonowego do końcowej objętości 30 mililitrów. Dokładnie wymieszaj, aby uzyskać jednolity roztwór. Teraz wlej dobrze wymieszany roztwór do foremek, a następnie umieść foremki w komorze próżniowej, aby odgazować PDMS przez 30 do 60 minut lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne pęcherzyki.
Wyjmij odgazowany PDMS z komory próżniowej i pozostaw do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Wyodrębnij utwardzony PDMS z formy PLA. Następnie umieść dwa kawałki taśmy dwustronnej na każdej płytce do hodowli komórkowej.
Następnie umieść każdą połówkę układu krwionośnego PDMS na wierzchu taśmy we własnym naczyniu do hodowli komórkowych. Umieść kilka 30-mikrolitrowych kropli fibronektyny wzdłuż układu naczyniowego PDMS za pomocą mikropipety. W razie potrzeby przechyl PDMS i użyj końcówki pipety, aby równomiernie pokryć powierzchnię.
Po 30-minutowej inkubacji odessać roztwór fibronektyny z PDMS. Następnie pozwól elementom wyschnąć na powietrzu wewnątrz szafki. Umieść wydrukowane w 3D zatyczki na każdym końcu połówek naczyń krwionośnych PDMS, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek, używając dwóch zatyczek na sztukę.
Za pomocą mikropipety wysiew 300 mikrolitrów zawiesiny komórek HLMVEC do każdego elementu PDMS i inkubuj. Następnie włóż połówki z powrotem do szafki i wyjmij cztery wtyczki. Dodaj pożywkę hodowlaną HLMVEC, aby zanurzyć połówki układu krwionośnego PDMS i ponownie inkubować przez sześć do 10 godzin.
Teraz odessać pożywkę HLMVEC z szalki Petriego zawierającej połówki naczyń krwionośnych. Umieść każdą połówkę PDMS w blokach poliwęglanu, zapewniając prawidłowe wyrównanie. Nałóż uszczelniacz silikonowy na końce układu naczyniowego PDMS.
Włóż rurkę o długości cala do obu końców dolnego elementu PDMS. Następnie odwróć górny blok akrylowy zawierający górną połowę PDMS na dolny blok akrylowy. Skręć ze sobą bloki akrylowe, upewniając się, że gwintowany blok znajduje się na dole.
Zatkaj wolne końce rurki za pomocą zatyczek wydrukowanych w 3D. Wyjmij jedną zatyczkę i delikatnie wstrzyknij 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej HLMVEC do układu krwionośnego za pomocą mikropipety. Przechyl, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie wymień wtyczkę.
Przenieś zmontowany chip i sterylne elementy do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Podłącz wszystkie rurki i zmontuj system przepływu, upewniając się, że rurka wlotowa łączy się z dnem zbiornika strzykawki, aby ułatwić przepływ grawitacyjny. Teraz delikatnie zalać układ przepływowy medium HLMVEC.
Użyj 50-mililitrowej pipety serologicznej. Wstrzyknąć 30 mililitrów pożywki do górnej części zbiornika strzykawki i uruchomić pompę perystaltyczną z niską prędkością, aby napełnić rurkę. Myj każdą połówkę układu krwionośnego PDMS w PBS przez pięć minut, dodając tyle roztworu, aby całkowicie zanurzyć odcinek naczyniowy.
Symulacja płynu wykazała znacznie podwyższone naprężenia ścinające przy rozwidleniach naczyń w modelu pneumonektomii w porównaniu z modelem kontrolnym. Mikroskopia w jasnym polu potwierdziła równomierne przyleganie komórek HLMVEC zarówno w warunkach statycznych, jak i przepływowych przy 93,1 mililitrach na minutę po 24 godzinach. Obrazowanie fluorescencyjne bifurkacji wlotu wykazało nienaruszone i dobrze rozmieszczone warstwy komórek zarówno w modelach kontrolnych, jak i pneumonektomii.
Obrazowanie bezpośrednio po drugim rozwidleniu wykazało znaczną utratę komórek zarówno w modelu kontrolnym, jak i w modelu pneumonektomii. Komórki pozostały przylegające i wykazywały spójne barwienie w regionie poniżej drugiego rozwidlenia w obu modelach. Jednolite jądra barwione DAPI w modelach naczyniowych wskazywały, że konfluencja utrzymywała się pomimo ekspozycji na przepływ.
Wczesna próba modelu kontrolnego wykazała nierównomierne rozmieszczenie komórek z powodu pęcherzyków powietrza wprowadzonych podczas zalewania systemu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół konstrukcji systemu organ-on-chip (OOC), który naśladuje pneumonektomię. System został zaprojektowany w celu zbadania korelacji między uszkodzeniem glikokaliksu a powikłaniami występującymi po pneumonektomii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania naczyniowe
- Glikokaliks śródbłonkowy
- Technologia organ-on-a-chip
Wstęp
- Laboratorium Mensah koncentruje się na badaniach naczyniowych oraz glikokaliksie śródbłonka.
- Obecne wyzwania obejmują niepełne modele in vitro oraz trudności z kwantyfikacją.
- Zrozumienie glikokaliksu jest kluczowe dla walki z chorobami naczyniowymi.
- Ostatnie postępy mają na celu udoskonalenie modeli in vitro do badań nad glikokaliksem.
Cel badania
- Zbadanie roli glikokaliksu w zdrowiu naczyniowym.
- Opracowanie dokładniejszego modelu organ-on-chip do badań nad pneumonektomią.
- Zbadanie strategii terapeutycznych ukierunkowanych na zachowanie zdrowia glikokaliksu.
Zastosowane metody
- Konstrukcja systemu organ-on-chip.
- Wykorzystanie elastomeru silikonowego do opracowania modelu.
- Badanie upośledzenia glikokaliksu.
- Eksperymentalna walidacja skuteczności modelu.
Główne wyniki
- Opracowany system OOC skutecznie naśladuje pneumonektomię.
- Wyniki sugerują korelację między uszkodzeniem glikokaliksu a powikłaniami chirurgicznymi.
- Model wykazuje lepszą reprezentację glikokaliksu w porównaniu z konwencjonalnymi technikami.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą być pomocne w opracowywaniu przyszłych podejść terapeutycznych.
Wnioski
- System organ-on-chip jest cennym narzędziem do badania reakcji naczyniowych.
- Zrozumienie dynamiki glikokaliksu może usprawnić strategie terapeutyczne.
- Niniejsze badanie wnosi wkład w szerszy zakres wiedzy na temat chorób naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie glikokaliksu śródbłonkowego po pneumonektomii w trójwymiarowym chipie mikroprzepływowym pozwala wypełnić krytyczną lukę w biologii naczyniowej, umożliwiając precyzyjne badanie wpływu naprężeń ścinających na funkcję naczyń. Ten system organ-on-chip zwiększa pewność predykcyjną w procesie wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego związanego z powikłaniami naczyniowymi po interwencjach chirurgicznych. Podejście to wspiera ciągłość translacyjną od modelowania obliczeniowego do walidacji eksperymentalnej, dostarczając danych dla decyzji portfelowych skorygowanych o ryzyko w obszarze badawczo-rozwojowym w zakresie naczyń i płuc.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną analizę odpowiedzi glikokaliksu śródbłonka na zmienione naprężenie ścinające.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie odpowiedzi szlaków naczyniowych po pneumonektomii.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla strategii naprawy naczyniowej i łagodzenia powikłań.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do późniejszych badań translacyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany trójwymiarowy system naczyniowy do powtarzalnego przesiewania odpowiedzi śródbłonka in vitro.
- Standaryzuje warunki analizy w celu kwantyfikacji stanu glikokaliksu w kontrolowanych reżimach przepływu.
- Umożliwia skalowalny ponowny wykorzystanie platformy do oceny związków ukierunkowanych na integralność naczyniową.
- Dostarcza wyników ilościowych i jakościowych dla rzetelnego opracowania analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki in vitro z modelami naczyniowymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu poszukiwania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od symulacji komputerowej do przedklinicznej walidacji interwencji naczyniowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju terapeutyków celowanych w naczynia krwionośne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku powikłań naczyniowych po zabiegach chirurgicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda organ-on-chip integruje etapy od wczesnego odkrywania, przez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, łącząc modelowanie obliczeniowe z walidacją eksperymentalną w biologii naczyniowej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu naprężeń ścinających na glikokaliks śródbłonka i funkcję naczyniową.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników w celu standaryzacji testów i przesiewania związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki immunobarwienia i obrazowania do porównania stanu GCX w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odpowiedzi naczyniowe in vitro z ryzykiem powikłań pozabiegowych w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę organ-on-chip dla różnorodnych zastosowań w badaniach naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów naczyniowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w procesach badawczo-rozwojowych w obszarze naczyniowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapie naczyniowe i płucne z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii naczyniowej, mikrofluidyki oraz modelowania komputerowego.
- Wymaga dostępu do druku 3D, formowania z PDMS oraz zaawansowanej infrastruktury obrazowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności analiz i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów modeli naczyniowych poprzez optymalizację protokołu.
- Ilościowa ocena stanu glikokaliksu może być ograniczona przez obecne techniki obrazowania i barwienia.
