Name: Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj analizę oddziaływań białko-DNA w telomerach za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej. Metoda ta pozwala badać dynamikę kompleksów TRF2 z DNA ludzkich telomerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [Grant 32071227 dla Z.Y.], Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 do Z.Y.) oraz State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Uniwersytet w Tianjin) [Grant pilab2210 dla Z.Y.].

Studying TRF1/2 Interactions with Telomeric DNA Using Single-Molecule Assay

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Protokół ten wykorzystuje pęsetę magnetyczną do manipulacji TRF na poziomie pojedynczej cząsteczki 57,58,59. Wykorzystujemy kulki magnetyczne do oddzielania TRF od fragmentów genomowego DNA. Po trawieniu restrykcyjnym TRF wiążą się z kulkami magnetycznymi, umożliwiając ich łatwe oddzielenie od fragmentów genomowego DNA. Takie podejście pozwala na manipulację za pomocą pęsety magnetycznej, która może skutecznie zatrzymywać kulki magnetyczne, w przeciwieństwie do pęsety optycznej, która jest ograniczona przez problemy z przezroczystością. Co więcej, chociaż AFM może być używany do manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, wymagane są dodatkowe kroki, aby oddzielić TRF od kulek magnetycznych i unieruchomić je między powierzchnią miki a końcówką wspornikową. W przeciwieństwie do tego, pęseta magnetyczna oferuje prostszą i wydajniejszą metodę manipulacji pojedynczymi cząsteczkami TRF, eliminując potrzebę wykonywania tych dodatkowych kroków41.
Utrzymanie integralności genomowego DNA i TRF ma kluczowe znaczenie, ponieważ manipulacja pojedynczymi cząsteczkami zależy od nienaruszonych TRF. Za pomocą pęsety magnetycznej rozciągamy i rozluźniamy TRF, przytrzymując ich dwa końce, aby zbadać interakcje białko-DNA. Dokładny pomiar siły na kulkach magnetycznych ma fundamentalne znaczenie dla testów mechanicznych pojedynczych cząsteczek54. W związku z tym magnesy w kształcie sześciennym powinny być ustawione równolegle lub prostopadle do ścieżki światła kamery w pęsetach magnetycznych (UWAGA poniżej kroku 4.3.3), zapewniając precyzyjny trójwymiarowy zapis pozycji koralików zgodnie z ustalonymi równaniami54,60. Przesunięcie magnesu ma kluczowe znaczenie dla określenia ich położenia i wynikających z nich sił działających na kulki magnetyczne. Używamy szkła nakrywkowego #2 o grubości około 0,2 mm w celu uzyskania spójności lub dostosowujemy przesunięcie w równaniu dla różnych szkieł nakrywkowych54. Liczba klatek na sekundę ma kluczowe znaczenie dla uchwycenia dynamiki interakcji białko-DNA, co wymaga zerowego czasu martwego migawki dla pełnych danych o ruchu kulek. Ruchy motoryczne, kodowane przez skrypt, mają kluczowe znaczenie dla projektowania jednocząsteczkowych testów mechanicznych. Parametry krytyczne, takie jak szybkość obciążenia siłą, siły i czas trwania, powinny być ustawiane i optymalizowane iteracyjnie. Stężenia białek stosowane w testach jednocząsteczkowych wymagają intensywnego miareczkowania w celu określenia optymalnego poziomu do badania interakcji białko-DNA. Początkowe testy siły można przeprowadzić za pomocą testów narastania siły ze spektroskopią sił, podczas gdy testy skoku siły oceniają siły będące przedmiotem zainteresowania na stałym poziomie.
Podczas adaptacji tego protokołu można napotkać kilka wyzwań. Jeśli TRF1 lub TRF2 nie ulega ekspresji w E. coli, zacznij od badania na małą skalę, lizy komórek i analizuj białka za pomocą SDS-PAGE i barwienia, potwierdzając Western Blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla tagu. Należy zweryfikować konstrukt i plazmid, aby zapewnić prawidłowe klonowanie bez mutacji, przesunięć ramki odczytu lub przedwczesnych kodonów stop, a także sprawdzić przydatność promotora dla E. coli. Ekspresja powinna być zoptymalizowana poprzez testowanie różnych szczepów E. coli (np. BL21(DE3), Rosetta), dostosowanie temperatury wzrostu (15-25 °C), czasu indukcji (2-16 godzin) i stężenia IPTG (0,1-1 mM). Ciałami inkluzyjnymi należy się zająć, analizując osady komórkowe przed i po sonikacji. Należy zająć się stronniczością kodonów ze szczepami dostarczającymi rzadkie tRNA lub optymalizacją kodonów. Wypróbuj różne podłoża wzrostowe (LB, TB, autoindukcja) i popraw napowietrzenie, dostosowując prędkość wytrząsania i objętość hodowli. W przypadku problemów z toksycznością należy użyć ściśle regulowanych promotorów lub wektorów o niższej liczbie kopii i dodać glukozę (0,2%), aby stłumić nieszczelną ekspresję promotora lac. Utrzymuj integralność plazmidu dzięki odpowiedniemu doborowi antybiotyków i zapewnij całkowite uwalnianie białka poprzez optymalizację metody lizy komórek61,62.
Jeśli w testach jednocząsteczkowych nie zostaną znalezione uwięzi TRF, jedną z możliwości jest to, że nie użyto wystarczającej ilości początkowego genomowego DNA. Spróbuj użyć 500 ng odpowiednika TRF genomowego DNA, aby skonfigurować test mechaniczny pojedynczej cząsteczki. Uporczywe problemy ze znalezieniem uwięzi TRF w pęsetach magnetycznych mogą wynikać ze zbyt długiego czasu trawienia genomowego DNA. Utrzymuj procedurę trawienia poniżej 12 godzin, aby uniknąć aktywności gwiazdy. Dodatkowo, tworzenie G-kwadrupleksów na jednoniciowym zwisie telomerowego DNA może hamować wyżarzanie oligonukleotydów znakowanych biotyną w celu wiązania się z kulkami magnetycznymi. Aby temu zapobiec, utrzymuj stężenie jonów potasu lub sodu poniżej 1 mM, aby uniknąć tworzenia się G-quadruplex i zwiększyć prawdopodobieństwo tworzenia się uwięzi TRF w układzie jednocząsteczkowym. Dodatkowo, zwiększenie temperatury ogrzewania na etapie wyżarzania (krok 3.2.5) pomaga destabilizować G-kwadrupleksy i ułatwia wiązanie oligonukleotydów znakowanych biotyną z TRF.
W obecności białek TRF1 lub TRF2 uwięzi DNA TRF mogą stać się mocno zagęszczone i zbyt trudne do rozciągnięcia w pęsetach magnetycznych ze względu na obfitość miejsc wiązania tych białek na telomerach. Miareczkowanie stężeń białek może pomóc w określeniu optymalnych poziomów dla jednocząsteczkowych testów mechanicznych. Powinowactwo wiązania białko-DNA można ocenić za pomocą testów EMSA lub SPR w celu określenia stałej dysocjacji (Kd), która może następnie informować o odpowiednich stężeniach do testów jednocząsteczkowych.
Ograniczona ilość TRF generowanych z genomowego DNA może ograniczać skuteczność testów jednocząsteczkowych. W związku z tym zbieranie danych o pojedynczych cząsteczkach może zająć więcej czasu w porównaniu z użyciem sztucznie zsyntetyzowanych konstruktów telomerowego DNA. Jednak stosowanie telomerów pochodzących bezpośrednio z ludzkiego genomu zapewnia kilka korzyści, których sztuczne telomerowe DNA, powszechnie wytwarzane przez plazmid w bakteriach lub metodach PCR, nie może zaoferować. Jedną z zalet jest to, że ludzkie TRF są niejednorodne pod względem długości, co pozwala na badanie zależności długości telomerów w interakcjach białko-DNA. W przeciwieństwie do tego, sztuczne telomeryczne DNA ma zwykle jednolitą długość, a generowanie sztucznego telomerycznego DNA o różnych długościach byłoby czasochłonne i pracochłonne. Ponadto ludzkie TRF zawierają oryginalne sekwencje komórek, w tym naturalne markery, takie jak modyfikacje, mutacje i uszkodzenia. Pozwala to na badanie oddziaływań białko-DNA w warunkach fizjologicznych lub patologicznych, co nie jest możliwe w przypadku sztucznego telomerowego DNA.
Protokół ten jest niezbędny do badań w dziedzinie biologii telomerów na poziomie pojedynczej cząsteczki i może potencjalnie przynieść korzyści w odkrywaniu leków ukierunkowanych na telomery.

Telomery to struktury ochronne na końcach chromosomów1,2,3. Erozja telomerów podczas podziału komórki prowadzi do starzenia się i starzenia komórek, podczas gdy nieprawidłowe wydłużanie telomerów przyczynia się do raka4,5. Aby telomery działały prawidłowo, ich replikacja, wydłużanie i reakcje na uszkodzenia muszą być ściśle regulowane6,7,8. Shelterin, składający się z sześciu podjednostek, odgrywa kluczową rolę w ochronie telomerów9,10,11. Głębsze zrozumienie telomerów dostarczy cennych informacji na temat biologii telomerów.
TRF1 i TRF2, podstawowe podjednostki shelteryny, są telomerowymi białkami wiążącymi12,13. Zarówno TRF1, jak i TRF2 wiążą się z powtarzającym się motywem DNA TTAGGG w telomerach za pośrednictwem swoich domen Myb14. Tworzą dimery poprzez wspólne domeny TRFH, które pozwalają im otaczać telomerowe dwuniciowe DNA i rekrutować białka telomeryczne15,16,17,18,19. TRF2 jest szczególnie ważny dla tworzenia telomerowych pętli D i pętli T20,21. Ze względu na ich kluczową rolę w ochronie telomerów, TRF1 i TRF2 stały się potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych22,23,24,25.
Podjęto znaczące wysiłki w celu zbadania interakcji białko-DNA w telomerach. Metody biochemiczne, takie jak test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR), zostały wykorzystane do zbadania powinowactwa wiązań20,26. Liczne struktury białek wiążących telomery skompleksowane z DNA zostały wyjaśnione za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), krystalografii rentgenowskiej i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)27,28,29. Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), ujawniły zależne od TRF2 tworzenie pętli T21. Ostatnio opracowano sekwencjonowanie nanoporowe w celu profilowania sekwencji telomerowych4,30,31. Te strukturalne spostrzeżenia znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat telomerowych interakcji białko-DNA. Aby dokładniej zbadać dynamikę telomerowych interakcji białko-DNA, niezbędne jest opracowanie nowych technologii.
Narzędzia do jednocząsteczkowych to potężne techniki badania interakcji białko-DNA w telomerze32,33,34. Jednocząsteczkowe metody mechaniczne, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i AFM, zostały wykorzystane między innymi do zbadania zniekształceń DNA zależnych od TRF2, ujawnienia kolumnowego układania ludzkiej chromatyny telomerowej za pośrednictwem TRF2 i obserwacji procesyjnej katalizy telomerazy35,36,37,38,39,40. Metody te są szczególnie przydatne do badania konformacji topologicznych oraz kinetyki asocjacji i dysocjacji białko-DNA.
Jednak przygotowanie jednocząsteczkowych konstruktów z telomerowymi powtarzającymi się motywami nadal stanowi wyzwanie, co ogranicza badania przy użyciu jednocząsteczkowych metod mechanicznych. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy jednocząsteczkową metodę mechaniczną do badania globalnych interakcji białko-DNA na pełnowymiarowych ludzkich telomerach41. Metoda ta bezpośrednio ekstrahuje telomeryczne DNA z komórek ludzkich, omijając pracochłonne przygotowanie sztucznego telomerycznego DNA. Ułatwia badanie procesów kinetycznych zachodzących na długich natywnych telomerach o długości kilku kilozasad.
W tym protokole podajemy szczegółowy opis kroków do badania telomerowych interakcji białko-DNA za pomocą pęsety magnetycznej, popularnego mechanicznego narzędzia do pojedynczych cząsteczek42,43,44. Pokazujemy, jak wyrażać i oczyszczać białka telomeryczne, na przykładzie TRF2, oraz jak przygotować telomerowe DNA z komórek ludzkich. Dodatkowo pokazujemy, jak skonfigurować test pojedynczej cząsteczki na pęsetach magnetycznych w celu zbadania interakcji telomerowych białko-DNA, a także omówimy późniejszą analizę danych z eksperymentów jednocząsteczkowych. Protokół ten przyniesie korzyści naukowcom zajmującym się biologią telomerów i odkrywaniem leków ukierunkowanych na telomery.

<table><tbody><tr><td>Anty-digoxigeninin</td><td>Roche</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>BfaI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0568S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>kamera CMOS&nbsp;</td><td>Mikrotron</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>CviAII</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0640S</td><td></td></tr><tr><td>DIG-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do ekstrakcji DNA</td><td>G-CLONE</td><td>EX0108</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I, bez rnazy, Hc Ea</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>mieszanina dNTP</td><td>Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)</td><td>P032-02</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Solarbio</td><td>D1070</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Dynabeads M-270&nbsp; koraliki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65305</td><td>Koraliki Streptawidyny</td></tr><tr><td>Koraliki Dynabeads MyOne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65001</td><td>Koraliki Streptawidyny</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Tianjin No.6 Fabryka odczynników chemicznych</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Pekin Hwrkchemical Współ. Ltd</td><td>SMG66258-1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Solarbio</td><td>II0070</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Solarbio</td><td>I8070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Tianjin No.6 Fabryka odczynników chemicznych</td><td>A1079</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0523</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3&prime;-5&prime; exo-)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html</td><td>Oprogramowanie do programowania graficznego&nbsp;</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)</td><td>BD136449</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Solarbio</td><td>L8120-5</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Shanghai Aladdin</td><td>C111533</td><td></td></tr><tr><td>Naukowy</td><td></td><td>spektrofotometr</td><td>NanoDrop Thermo Fisher</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Ni NTA Koraliki 6FF</td><td>Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd</td><td>SA005025</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>ABklonalna</td><td>RM02801</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Solarbio</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>ST535-500mg</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>2124902</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza Sumo</td><td>Beyotime Biotech Inc (beyotime)</td><td>P2312M</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza telomerowych oddziaływań białko-dna za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Analyzing Telomeric Protein-DNA Interactions Using Single-Molecule Magnetic Tweezers

Telomery, struktury ochronne na końcach chromosomów, są kluczowe dla utrzymania długowieczności komórek i stabilności genomu. Ich prawidłowe funkcjonowanie zależy od ściśle regulowanych procesów replikacji, wydłużania i odpowiedzi na uszkodzenia. Kompleks schroniny, zwłaszcza czynnik wiążący telomery 1 (TRF1) i TRF2, odgrywają kluczową rolę w ochronie telomerów i stały się potencjalnym celem badań przeciwnowotworowych nad lekami. Białka te wiążą się z powtarzającym się telomerowym motywem DNA TTAGGG, ułatwiając tworzenie struktur ochronnych i rekrutację innych białek telomerowych. Metody strukturalne i zaawansowane techniki obrazowania dostarczyły informacji na temat interakcji białko-DNA telomerowe, ale badanie dynamicznych procesów wymaga podejścia opartego na pojedynczych cząsteczkach. Narzędzia takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i mikroskopia sił atomowych (AFM) zostały wykorzystane do zbadania interakcji telomerowych białko-DNA, ujawniając ważne szczegóły, takie jak zniekształcenie DNA zależne od TRF2 i kataliza telomerazy. Jednak przygotowanie konstruktów jednocząsteczkowych z powtarzalnymi motywami telomerowymi nadal stanowi trudne zadanie, potencjalnie ograniczając zakres badań wykorzystujących jednocząsteczkowe metody mechaniczne. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę badania interakcji przy użyciu pełnowymiarowego ludzkiego telomerowego DNA za pomocą pęsety magnetycznej. Protokół ten opisuje, jak wyrażać i oczyszczać TRF2, przygotowywać telomerowe DNA, konfigurować testy mechaniczne pojedynczych cząsteczek i analizować dane. Ten szczegółowy przewodnik przyniesie korzyści naukowcom zajmującym się biologią telomerów i odkrywaniem leków ukierunkowanych na telomery.

Rysunek 1A przedstawia schemat domen i struktur TRF1 oraz TRF2, składających się odpowiednio z 439 i 542 aminokwasów, które mogą być eksprymowane w komórkach prokariotycznych. Sposób przygotowania TRF1 został wcześniej opisany w literaturze41. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy opis oraz reprezentatywne wyniki przygotowania TRF2. Rysunek 1B przedstawia mapę plazmidu wykorzystanego do ekspresji TRF2 w E. coli. Przeanalizowano ekspresję TRF2 przed i po indukcji w E. coli, co przedstawiono na Rysunku 1B. Procesy oczyszczania i odcinania znacznika przeanalizowano również za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 1C). Zgodnie z niniejszym protokołem, oba białka wiążące telomery, TRF1 i TRF2, zostały pomyślnie wyeksprymowane w E. coli.
Telomeryczny DNA, w formie terminalnych fragmentów restrykcyjnych (TRFs), jest generowany z ludzkich genomów przy użyciu kombinacji czterech enzymów restrykcyjnych. Postępując zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 2A, wyekstrahowaliśmy genomy z ludzkich komórek. Enzymy selektywnie trawią DNA genomiczny, pozostawiając nienaruszone pełnowymiarowe telomeryczne DNA, co dostarcza materiału do analiz pojedynczych cząsteczek. Przeprowadziliśmy szeroko zakrojone testy preparacji DNA TRF z wykorzystaniem różnych ludzkich linii komórkowych. Integralność DNA genomicznego zbadano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak pokazano na Rysunku 2B. Następnie TRFs analizowano metodą Southern blotting, stosując oligonukleotydy znakowane fluorescencyjnie, komplementarne do telomerycznej sekwencji powtórzeń TTAGGG (Rysunek 2C), zgodnie z metodą opisaną w innym opracowaniu41,56. Średnia długość ludzkich TRFs wynosi kilka kilobaz.
Analizy pojedynczych cząsteczek odbywają się w celi przepływowej zmontowanej zgodnie z opisem na Rysunku 3A. Powłoka z nitrocelulozy pokrywa ujemnie naładowaną powierzchnię szklaną, zapewniając hydrofilową matrycę do adsorpcji przeciwciał. Pasywacja BSA blokuje obszary matrycy nitrocelulozowej, które nie są związane z przeciwciałami przeciwko digoksigeninie. Koraliki polistyrenowe, które nie zawierają nanocząsteczek żelaza, służą jako koraliki referencyjne. Kotwice TRF powstają w wyniku oddziaływań powinowactwa między digoksigeniną a przeciwciałem na matrycy nitrocelulozowej a biotyną i streptawidyną na powierzchni koralika magnetycznego (Rysunek 3B). Do celi przepływowej wprowadza się TRF1 lub TRF2, które wiążą się z kotwicami DNA TRF poprzez dyfuzję swobodną. Pincety magnetyczne są wykorzystywane do modulowania pola magnetycznego, generując siły działające na koraliki magnetyczne w celu rozciągania i rozluźniania kotwic TRF, co umożliwia badanie oddziaływań białko-DNA.
Analizę mechaniczną pojedynczych cząsteczek projektuje się poprzez opracowanie skryptu sterującego ruchami silników pęsety magnetycznej. Schemat blokowy przedstawia ustrukturyzowane podejście do tworzenia takiego skryptu w programie MatLab dla analizy pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem pęsety magnetycznej (Rysunek 4A). Magnesy poruszają się wzdłuż osi z w zakresie 0-25 mm. Siły są obliczane na podstawie pozycji magnesów, zgodnie z konfiguracją magnesów, przy użyciu równań opisanych w literaturze54. Dla konkretnej szybkości przykładania siły, pozycje magnesów i prędkości ich ruchu są projektowane i programowane w MatLab, aby uzyskać pożądany profil manipulacji siłą, co zaprezentowano na przykładzie analizy rampy siły (Rysunek 4B-D).
Wykorzystując TRF1 jako przykład, zbadaliśmy oddziaływania telomerowego DNA z białkami za pomocą jednocząsteczkowych pęset magnetycznych. Układ doświadczalny może zostać skonfigurowany jako test rampy siły, jak pokazano na Rysunku 5A, w którym krzywe siła-wydłużenie wykazują zygzakowate cechy podczas rozciągania z powodu zrywania oddziaływań białko-DNA oraz gładkie ślady podczas relaksacji, odzwierciedlające włókno DNA pozbawione pętli pośredniczonych przez białka. Układ może być również skonfigurowany jako test skoku siły, jak pokazano na Rysunku 5B,C, co pozwala nam mierzyć zmiany wydłużenia oraz czas trwania oddziaływań białko-DNA przy określonych siłach. Kinetykę dysocjacji kompleksów telomerowego DNA z białkami można wyprowadzić z tych pomiarów (Rysunek 5D). Dodatkowo, tworzenie pętli w kompleksach DNA-białko może zostać ujawnione poprzez zmiany wydłużenia (Rysunek 5E). Ponadto, w tym układzie doświadczalnym z telomerowym DNA można przeprowadzić miareczkowanie stężenia białka. Co więcej, heterogeniczność długości telomerowego DNA z komórek ludzkich pozwala nam badać mechanizm tworzenia pętli w telomerach o różnych długościach (Rysunek 6).
<img alt="Analiza białek TRF; schemat mapy plazmidu; elektroforeza białek w żelu SDS-PAGE dla ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ekspresja i oczyszczanie TRF1/2. (A) Architektura domen TRF1 i TRF2. (B) Mapa plazmidu pET28a-SUMO-TRF2 do ekspresji TRF2 w E. coli. (C) Analiza SDS-PAGE próbek pobranych na różnych etapach ekspresji i oczyszczania. Ścieżka 1: Brak indukcji IPTG. Ścieżka 2: Osad po indukcji IPTG uzyskany w wyniku lizy komórek. Ścieżka 3: Nadsącz po indukcji IPTG uzyskany po lizie komórek. Ścieżka 4: Frkcja przepływowa z kolumny Ni. Ścieżka 5: Płukanie buforem z niskim stężeniem imidazolu w celu usunięcia białek zanieczyszczających. Ścieżka 6: Elucja 6xHis-SUMO-TRF2 buforem zawierającym 300 mM imidazolu. Ścieżka 7: Trawienie znaczników SUMO za pomocą proteazy SUMO. Ścieżka 8: Ponowne oczyszczanie na kolumnie Ni i elucja TRF2 (po usunięciu znaczników 6xHis i SUMO) buforem zawierającym 20 mM imidazolu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza telomerów: trawienie DNA, znakowanie sondy; wyniki elektroforezy w żelu; badanie sekwencji telomerowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie terminalnych fragmentów restrykcyjnych (TRF). (A) Schemat blokowy przygotowania TRF z ludzkich komórek. (B) Badanie integralności genomowego DNA przy użyciu 1% żelu agarozy dla 5 ludzkich linii komórkowych. (C) Analiza TRF wykonana metodą Southern blotting dla 5 ludzkich linii komórkowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat eksperymentu z mikro sferami polistyrenowymi; układ kulek magnetycznych do analizy pomiaru siły." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przygotowanie analiz mechanicznych pojedynczych cząsteczek. (A) Schemat blokowy przedstawiający przygotowanie komory przepływowej do analiz mechanicznych pojedynczych cząsteczek. (B) Schematyczne przedstawienie analiz mechanicznych pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem pęset magnetycznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces magnetometrii z wykresami siła-pozycja; obliczanie siły działającej na koraliki magnetyczne, zawiera skrypt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Projekt mechanicznego testu pojedynczych cząsteczek. (A) Schemat blokowy generowania skryptu do wykonania testu z rampą siły. (B) Profil ruchu magnesów wzdłuż osi z. (C) Profil siły odpowiadający ruchowi magnesów. (D) Korelacja między pozycjami magnesów a wynikającymi z nich siłami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza siła-wydłużenie, wykresy i dane, układ eksperymentalny w biofizyce, Ftest, Fmax, wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Oddziaływania DNA telomerowe-białkowe badane za pomocą jednocząsteczkowych pęset magnetycznych. (A) Oddziaływania TRF1-telomer badano w testach z rampą siły (N = 10) w buforze zawierającym 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA oraz 100 mM NaCl w temperaturze 23 °C. Stężenie TRF1 wynosiło 10 nM, przy szybkości przyłożenia siły ±1 pN/s. (B) Tether TRF rozciągano i rozluźniano w testach ze skokiem siły. Zastosowany protokół siły to Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN oraz Fmax = 20 pN. Warunki buforowe i temperaturowe były takie same jak w (A). Częstotliwość odświeżania ramek = 200 Hz. (C) Oddziaływania TRF1-telomer badano w testach ze skokiem siły przy stężeniu TRF1 wynoszącym 10 nM. (D) Kinetyka dysocjacji kompleksów TRF1-telomer. Logarytm szybkości dysocjacji przy badanych siłach (średnia ± SD, n = 206) odpowiada modelowi Kramera-Bella-Evansa (czerwona krzywa i równanie w legendzie). Wstawka przedstawia średni czas dysocjacji (&lt;τ&gt;) przy Ftest. (E) Rozkład zmian wydłużenia (ΔL) podczas zdarzeń zerwania kompleksów TRF1-telomer. Czarne i czerwone krzywe przedstawiają dopasowania Gaussa. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Li i wsp.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza telomerów: wykresy ΔL w funkcji TRF1 i zdarzeń pękania DNA telomerowego; schemat struktury telomeru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67251/67251fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Liczba i rozmiary pętli DNA tworzonych przez TRF1 w telomerze. (A) Zależność rozmiarów pętli DNA (ΔL) od długości telomeru przy [TRF1] = 20 nM. Krzywe przedstawiają dopasowania Gaussa. (B) Zależność ΔL od długości telomeru przy [TRF1] = 40 nM. (C) Korelacja między ΔL a liczbą zdarzeń pękania na telomer, N. Korelacja rzędu zerowego wynosi r = -0,20 przy p &lt; 0,001 (wielkość próby = 1496). (D) Schemat ilustrujący możliwy mechanizm wyjaśniający ujemną korelację między ΔL a N, sugerujący, że TRF1 może zagęścić pojedynczy telomer z pierwotnymi domenami pętli w topologię wyższego rzędu. Rysunek zmodyfikowany za zgodą Li et al.41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/67251fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Kod MatLab do generowania skryptów scripts.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-MatLab%20code%20for%20generating%20scripts.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Script for constant force assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20constant%20force%20assay.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 3: Script for force ramp assay.txt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/JoVE67251-coding%20files-Script%20for%20force%20ramp%20assay.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Przepisy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67251/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Telomeres, the protective structures at the ends of chromosomes, are crucial for maintaining cellular longevity and genome stability. Their proper ...

Metody jednocząsteczkowe zostały wykorzystane do badania interakcji DNA białek telomerowych. Jednak przygotowanie konstruktów jednocząsteczkowych z powtarzalnym motywem telomerowym pozostaje trudnym zadaniem. W tym protokole przedstawiamy etapy ekspresji, a następnie oczyszczania białka TRF2, przygotowania telomerowego DNA, ustawiania testów mechanicznych pojedynczych cząsteczek i analizowania uzyskanych danych.Narzędzia do badań nad pojedynczymi cząsteczkami to potężne techniki badania interakcji telomerowego białka DNA. Jednocząsteczkowe metody mechaniczne, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i AFM, zostały wykorzystane między innymi do zbadania zniekształceń DNA zależnych od TRF2, ujawnienia pożywki TRF2 do kolumnowego przechowywania ludzkiej chromatyny telomerowej i obserwacji obecności katalizy telomerazy. Badaliśmy oddziaływania białek telomerowego DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej, umożliwiając precyzyjne pomiary zmian wydłużenia w czasie trwania oddziaływań białkowego DNA pod wpływem przyłożonych sił.Na podstawie tych pomiarów uzyskaliśmy kinetykę dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA. Ponadto ujawniono tworzenie się pętli w obrębie tych kompleksów. Liczne struktury białek wiążących telomery w kompleksie z DNA zostały rozwiązane za pomocą Cryo EM, krystalografii rentgenowskiej i NMR.Te metody strukturalne poszerzyły naszą wiedzę na temat interakcji DNA białek telomerowych. Aby dokładniej zbadać dynamikę tych interakcji, opracowaliśmy jednocząsteczkową metodę mechaniczną specjalnie do rozpoczynania interakcji telomerowego białka DNA. Narzędzia jednocząsteczkowe są potężnymi technikami badania interakcji DNA białek w telomerazie, z metodami szczególnie przydatnymi do potwierdzania topologii białek i analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji DNA białek.Aby rozpocząć transformację komórek Escherichia coli BL21 DE3, rozmrozić 50 mikrolitrów podwielokrotności właściwej zawiesiny komórkowej na lodzie. Dodaj jeden mikrolitr DNA plazmidu pET28a-SUMO TRF2 do właściwej zawiesiny komórkowej i delikatnie zakręć probówką, aby wymieszać zawiesinę. Po przemianie rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytce ślimakowej Luria-Bertani lub LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz kolonię przekształconych komórek i hoduj ją w pięciu mililitrach pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min.Po inkubacji indukować kulturę za pomocą jednego milimolowego IPTG jako stężenia końcowego. Inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 17 godzin, aby pobudzić ekspresję białka. Załaduj surowe ekstrakty białkowe wraz z buforem ładującym na żel SDS-PAGE.Próbki należy początkowo badać pod napięciem 100 V przez 30 minut, a następnie pod napięciem 120 V przez 50 minut w buforze Tris-Glycine. Następnie zabarwij kolorem Coomassie na niebiesko, aby zobrazować ekspresję białka. W celu oczyszczenia białka odwirować surowy ekstrakt białkowy o stężeniu 38 000 g przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.Załadować przefiltrowany supernatant na wstępnie zrównoważoną kolumnę niklu w buforze wiążącym. Przemyć kolumnę buforem wiążącym i rozcieńczyć białko przygotowanym gradientem imidazolu, zbierając 12 frakcji po jednym mililitrze każda. Dodaj glicerol do końcowego stężenia 50% do zagęszczonego i wymienionego buforowo białka do przechowywania.Ekspresja TRF2 w Escherichia coli została pomyślnie wykazana, jak pokazano za pomocą SDS-PAGE, gdzie wyraźne prążki odpowiadające TRF2 pojawiły się przed i po indukcji. Na początek odwiruj jeden razy 10 do potęgi siedmiu linii komórkowych HeLa zawierających telomerowe fragmenty restrykcyjne DNA o masie 1000 G przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS.Po leczeniu SDS proteinazą K i chlorkiem sodu odwirować zawiesinę komórkową o sile 16 900 G przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej i dodać równą objętość izopropanolu, unikając pływających lipidów lub osadu. Odwirować z dużą prędkością i umyć granulat 500 mikrolitrami 70% etanolu.Po wysuszeniu osadu DNA ostrożnie zawieś go ponownie w 475 mikrolitrach buforu TE i delikatnie wymieszaj, stukając w dno probówki. Teraz dodaj 25 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNazy A i postukaj w probówkę, aż granulka całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu i dwie objętości zimnego 100% etanolu i umieść probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin.Po odwirowaniu i przepłukaniu 70% etanolem dodaj 100 mikrolitrów buforu TE do osadu DNA. Stuknij w probówkę, aby wymieszać i umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny, aby całkowicie się rozpuściła. Do trawienia DNA połącz cztery mikrogramy genomowego DNA z jednym mikrolitrem CVIA 2, dwoma mikrolitrami buforu do trawienia 10X i wodą, aby uzyskać całkowitą objętość 20 mikrolitrów.Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W termocyklerze podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie zmniejszaj temperaturę o 0,1 stopnia Celsjusza co 30 sekund, aż osiągniesz 25 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu i wysuszeniu pokryj szkiełka dolnej okładki 20 mikrolitrami 0,1% nitrocelulozy i dodaj koraliki referencyjne.Piecz przykrywkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Zmontuj kanapkę z komórką przepływową, a po podgrzaniu jej do 85 stopni Celsjusza użyj dwóch wacików do masażu zespołu, aż parafilm uszczelni kanał. Umyj 10 mikrolitrów koralików M270 pięciokrotnie za pomocą magnesu o pojemności 50 mikrolitrów bufora roboczego.Po umyciu dodaj kulki na wierzchu strawionego genomowego DNA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Delikatnie przesuń probówkę kilka razy, aby wymieszać kulki i próbkę DNA. Pozostaw mieszaninę na lodzie na godzinę.Po inkubacji przemyć mieszaninę 500 mikrolitrami buforu roboczego trzykrotnie za pomocą magnesu w celu pociągnięcia kulek w dół, w 10-minutowych odstępach między myciami. Ponownie zawiesić próbkę w buforze roboczym i załadować 30 mikrolitrów mieszaniny do celi przepływowej. Po 30 minutach przepłucz niezwiązane kulki magnetyczne.Po umieszczeniu celi przepływowej na soczewce obiektywu, wybierz parę pięciomilimetrowych magnesów sześciennych ułożonych w konfiguracji pionowej i ustaw uchwyt magnesu na osi X ścieżki światła pęsety magnetycznej w celu obrazowania. Uruchom graficzne oprogramowanie do programowania i podłącz kontrolery pęsety magnetycznej. Dostosuj pole widzenia, aby zlokalizować koralik odniesienia na dole komory przepływowej i nieznacznie wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby koralik odniesienia pokazywał wyraźne pierścienie dyfrakcyjne.Napisz skrypt w MATLAB, aby kontrolować ruchy motoryczne do testów rampy siły. Zaimportuj skrypt do graficznego oprogramowania programistycznego, aby przetestować eksperymenty z pojedynczą cząsteczką. Przy wolnym natężeniu przepływu załaduj 200 mikrolitrów 10 nanomolowych TRF1 do komory przepływowej.Po 30 minutach wiązania wybierz skrypt do eksperymentu z rampą siły ze współczynnikiem ładowania siły plus minus jeden pikonewton na sekundę. Nazwij pliki danych i uruchom eksperyment. Integralność genomowego DNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, przy czym powstałe TRF wykazywały stałą długość w różnych liniach komórek ludzkich.Telomeryczne sekwencje powtórzeń w TRF wykryto za pomocą southern blot, wykazując wyraźne sygnały hybrydyzacji. Krzywe rozciągania sił z testu rampy siły wykazały zygzakowate wzory podczas rozciągania, co wskazuje na zerwanie oddziaływań DNA białek. Kinetyka dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA wykazała liniową zależność między siłą a szybkością dysocjacji.Co więcej, niejednorodność długości telomerowego DNA z komórek ludzkich bada mechanizm tworzenia pętli w telomerach o różnej długości.

analyzing-telomeric-protein-dna-interactions-using-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Pęseta magnetyczna, potężna technika manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, może być dostosowana do bezpośrednich pomiarów skrętu (przy użyciu konfiguracji zwanej pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą) i momentu obrotowego (przy użyciu konfiguracji określanej jako pęseta magnetyczna) w makrocząsteczkach biologicznych. Podano wytyczne dotyczące wykonywania takich pomiarów, w tym zastosowania do badania DNA i związanych z nim włókien nukleotywo-białkowych.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Poznaj analizę oddziaływań białko-DNA w telomerach za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej. Metoda ta pozwala badać dynamikę kompleksów TRF2 z DNA ludzkich telomerów.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Przeglądaj więcej filmów