Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej
30 sierpnia 2024
Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.
Metody jednocząsteczkowe zostały wykorzystane do badania interakcji DNA białek telomerowych. Jednak przygotowanie konstruktów jednocząsteczkowych z powtarzalnym motywem telomerowym pozostaje trudnym zadaniem. W tym protokole przedstawiamy etapy ekspresji, a następnie oczyszczania białka TRF2, przygotowania telomerowego DNA, ustawiania testów mechanicznych pojedynczych cząsteczek i analizowania uzyskanych danych.
Narzędzia do badań nad pojedynczymi cząsteczkami to potężne techniki badania interakcji telomerowego białka DNA. Jednocząsteczkowe metody mechaniczne, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i AFM, zostały wykorzystane między innymi do zbadania zniekształceń DNA zależnych od TRF2, ujawnienia pożywki TRF2 do kolumnowego przechowywania ludzkiej chromatyny telomerowej i obserwacji obecności katalizy telomerazy. Badaliśmy oddziaływania białek telomerowego DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej, umożliwiając precyzyjne pomiary zmian wydłużenia w czasie trwania oddziaływań białkowego DNA pod wpływem przyłożonych sił.
Na podstawie tych pomiarów uzyskaliśmy kinetykę dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA. Ponadto ujawniono tworzenie się pętli w obrębie tych kompleksów. Liczne struktury białek wiążących telomery w kompleksie z DNA zostały rozwiązane za pomocą Cryo EM, krystalografii rentgenowskiej i NMR.
Te metody strukturalne poszerzyły naszą wiedzę na temat interakcji DNA białek telomerowych. Aby dokładniej zbadać dynamikę tych interakcji, opracowaliśmy jednocząsteczkową metodę mechaniczną specjalnie do rozpoczynania interakcji telomerowego białka DNA. Narzędzia jednocząsteczkowe są potężnymi technikami badania interakcji DNA białek w telomerazie, z metodami szczególnie przydatnymi do potwierdzania topologii białek i analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji DNA białek.
Aby rozpocząć transformację komórek Escherichia coli BL21 DE3, rozmrozić 50 mikrolitrów podwielokrotności właściwej zawiesiny komórkowej na lodzie. Dodaj jeden mikrolitr DNA plazmidu pET28a-SUMO TRF2 do właściwej zawiesiny komórkowej i delikatnie zakręć probówką, aby wymieszać zawiesinę. Po przemianie rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytce ślimakowej Luria-Bertani lub LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz kolonię przekształconych komórek i hoduj ją w pięciu mililitrach pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
Po inkubacji indukować kulturę za pomocą jednego milimolowego IPTG jako stężenia końcowego. Inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 17 godzin, aby pobudzić ekspresję białka. Załaduj surowe ekstrakty białkowe wraz z buforem ładującym na żel SDS-PAGE.
Próbki należy początkowo badać pod napięciem 100 V przez 30 minut, a następnie pod napięciem 120 V przez 50 minut w buforze Tris-Glycine. Następnie zabarwij kolorem Coomassie na niebiesko, aby zobrazować ekspresję białka. W celu oczyszczenia białka odwirować surowy ekstrakt białkowy o stężeniu 38 000 g przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.
Załadować przefiltrowany supernatant na wstępnie zrównoważoną kolumnę niklu w buforze wiążącym. Przemyć kolumnę buforem wiążącym i rozcieńczyć białko przygotowanym gradientem imidazolu, zbierając 12 frakcji po jednym mililitrze każda. Dodaj glicerol do końcowego stężenia 50% do zagęszczonego i wymienionego buforowo białka do przechowywania.
Ekspresja TRF2 w Escherichia coli została pomyślnie wykazana, jak pokazano za pomocą SDS-PAGE, gdzie wyraźne prążki odpowiadające TRF2 pojawiły się przed i po indukcji. Na początek odwiruj jeden razy 10 do potęgi siedmiu linii komórkowych HeLa zawierających telomerowe fragmenty restrykcyjne DNA o masie 1000 G przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS.
Po leczeniu SDS proteinazą K i chlorkiem sodu odwirować zawiesinę komórkową o sile 16 900 G przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej i dodać równą objętość izopropanolu, unikając pływających lipidów lub osadu. Odwirować z dużą prędkością i umyć granulat 500 mikrolitrami 70% etanolu.
Po wysuszeniu osadu DNA ostrożnie zawieś go ponownie w 475 mikrolitrach buforu TE i delikatnie wymieszaj, stukając w dno probówki. Teraz dodaj 25 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNazy A i postukaj w probówkę, aż granulka całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu i dwie objętości zimnego 100% etanolu i umieść probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin.
Po odwirowaniu i przepłukaniu 70% etanolem dodaj 100 mikrolitrów buforu TE do osadu DNA. Stuknij w probówkę, aby wymieszać i umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny, aby całkowicie się rozpuściła. Do trawienia DNA połącz cztery mikrogramy genomowego DNA z jednym mikrolitrem CVIA 2, dwoma mikrolitrami buforu do trawienia 10X i wodą, aby uzyskać całkowitą objętość 20 mikrolitrów.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W termocyklerze podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie zmniejszaj temperaturę o 0,1 stopnia Celsjusza co 30 sekund, aż osiągniesz 25 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu i wysuszeniu pokryj szkiełka dolnej okładki 20 mikrolitrami 0,1% nitrocelulozy i dodaj koraliki referencyjne.
Piecz przykrywkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Zmontuj kanapkę z komórką przepływową, a po podgrzaniu jej do 85 stopni Celsjusza użyj dwóch wacików do masażu zespołu, aż parafilm uszczelni kanał. Umyj 10 mikrolitrów koralików M270 pięciokrotnie za pomocą magnesu o pojemności 50 mikrolitrów bufora roboczego.
Po umyciu dodaj kulki na wierzchu strawionego genomowego DNA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Delikatnie przesuń probówkę kilka razy, aby wymieszać kulki i próbkę DNA. Pozostaw mieszaninę na lodzie na godzinę.
Po inkubacji przemyć mieszaninę 500 mikrolitrami buforu roboczego trzykrotnie za pomocą magnesu w celu pociągnięcia kulek w dół, w 10-minutowych odstępach między myciami. Ponownie zawiesić próbkę w buforze roboczym i załadować 30 mikrolitrów mieszaniny do celi przepływowej. Po 30 minutach przepłucz niezwiązane kulki magnetyczne.
Po umieszczeniu celi przepływowej na soczewce obiektywu, wybierz parę pięciomilimetrowych magnesów sześciennych ułożonych w konfiguracji pionowej i ustaw uchwyt magnesu na osi X ścieżki światła pęsety magnetycznej w celu obrazowania. Uruchom graficzne oprogramowanie do programowania i podłącz kontrolery pęsety magnetycznej. Dostosuj pole widzenia, aby zlokalizować koralik odniesienia na dole komory przepływowej i nieznacznie wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby koralik odniesienia pokazywał wyraźne pierścienie dyfrakcyjne.
Napisz skrypt w MATLAB, aby kontrolować ruchy motoryczne do testów rampy siły. Zaimportuj skrypt do graficznego oprogramowania programistycznego, aby przetestować eksperymenty z pojedynczą cząsteczką. Przy wolnym natężeniu przepływu załaduj 200 mikrolitrów 10 nanomolowych TRF1 do komory przepływowej.
Po 30 minutach wiązania wybierz skrypt do eksperymentu z rampą siły ze współczynnikiem ładowania siły plus minus jeden pikonewton na sekundę. Nazwij pliki danych i uruchom eksperyment. Integralność genomowego DNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, przy czym powstałe TRF wykazywały stałą długość w różnych liniach komórek ludzkich.
Telomeryczne sekwencje powtórzeń w TRF wykryto za pomocą southern blot, wykazując wyraźne sygnały hybrydyzacji. Krzywe rozciągania sił z testu rampy siły wykazały zygzakowate wzory podczas rozciągania, co wskazuje na zerwanie oddziaływań DNA białek. Kinetyka dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA wykazała liniową zależność między siłą a szybkością dysocjacji.
Co więcej, niejednorodność długości telomerowego DNA z komórek ludzkich bada mechanizm tworzenia pętli w telomerach o różnej długości.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie jednocząsteczkowych pęset magnetycznych do badania oddziaływań między telomerami ludzkimi a wiążącymi DNA białkami telomerycznymi TRF1 i TRF2. Szczegółowo przedstawiono przygotowanie telomerów i białek, przebieg eksperymentów oraz metody gromadzenia i analizy danych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biologia molekularna
Wstęp
- Metody pojedynczych cząsteczek są niezbędne do badania oddziaływań białko-DNA.
- Przygotowanie konstruktów z telomerycznymi motywami repetytywnymi jest trudne.
- TRF2 odgrywa kluczową rolę w strukturze chromatyny telomerowej.
- Pęsety magnetyczne umożliwiają precyzyjne pomiary oddziaływań molekularnych.
Cel badania
- Zademonstrowanie zastosowania pęset magnetycznych w badaniu oddziaływań białek telomerowych.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu przygotowania białka TRF2 oraz telomerowego DNA.
- Analiza właściwości mechanicznych DNA podczas wiązania białek.
Zastosowane metody
- Ekspresja i oczyszczanie białka TRF2.
- Przygotowanie konstruktów telomerowego DNA.
- Konfiguracja pojedynczocząsteczkowych testów mechanicznych z użyciem pęset magnetycznych.
- Gromadzenie danych i analiza oddziaływań białko-DNA.
Główne wyniki
- Pomyślne przygotowanie TRF2 oraz DNA telomerowego do eksperymentów.
- Wykazanie zależnej od TRF2 deformacji DNA pod wpływem sił mechanicznych.
- Ujawnienie nowych informacji na temat aktywności telomerazy i struktury chromatyny.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań nad oddziaływaniami telomerowymi.
Wnioski
- Techniki jednocząsteczkowe są potężnym narzędziem w badaniu białek telomerowych.
- Niniejszy protokół ułatwia badanie oddziaływań białko-DNA.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia biologii telomerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Magnetyczne pęsety jednocząsteczkowe umożliwiają precyzyjne i ilościowe badanie oddziaływań białko-DNA w telomerach, co bezpośrednio wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków onkologicznych. Poprzez rozstrzyganie kinetyki dysocjacji i tworzenia pętli przez TRF1/TRF2 na pełnowymiarowym ludzkim DNA telomerycznym, podejście to zwiększa pewność predykcyjną na styku biologii odkrywczej i badań translacyjnych. Metoda ta wspomaga decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wyjaśnienie funkcjonalnego wpływu kandydackich modulatorów na mechanizmy utrzymania telomerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar kinetyki wiązania TRF2 i TRF1 do DNA telomerowego w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację indukowanego przez białko zniekształcenia DNA i tworzenia pętli.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów związanych z telomerami w projektach onkologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych konstruktów telomerowego DNA do dalszych etapów przepływu pracy w badaniach przesiewowych.
- Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących rozciągania (siła-wydłużenie) i dysocjacji w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na oddziaływania białko-DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biologią telomerów istotną dla przebiegu chorób dzięki zastosowaniu pełnowymiarowych ludzkich substratów DNA telomerowego.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów poprzez analizę kinetyczną i strukturalną kompleksów białko-DNA.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, łącząc mechanizm molekularny z funkcjonalną ochroną telomerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten jednocząsteczkowy test mechaniczny łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację wiodących związków oraz badania translacyjne, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących oddziaływań białko-DNA w telomerach.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określenie kinetyki dysocjacji i tworzenia pętli w celu wyjaśnienia funkcji TRF2/TRF1 w utrzymaniu telomerów.
- Przesiewanie: Zapewnienie zestandaryzowanych, powtarzalnych pomiarów siły rozciągania do oceny związków.
- Analityka: Generowanie wyników ilościowych — takich jak zależne od siły szybkości dysocjacji — umożliwiających rzetelne porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Powiązanie danych o oddziaływaniach molekularnych z dynamiką telomerów istotną w kontekście chorób oraz strategiami poszukiwania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Stworzenie platformy możliwej do ponownego wykorzystania w badaniach mechanistycznych oddziaływań białko-DNA w biologii telomerów i innych obszarach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie odkrywania leków celujących w telomery.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, skalowalne testy pojedynczych cząsteczek do wdrożenia w wielu programach badawczych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz alokację kapitału poprzez wyjaśnienie stopnia zaangażowania celu i wyników funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację środków modyfikujących telomery w portfolio onkologicznym i gerontologicznym, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie ekspresji białek, przygotowania DNA oraz biofizyki pojedynczych cząsteczek.
- Wymaga dostępu do aparatury pęset magnetycznych oraz infrastruktury do obrazowania ilościowego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów przygotowania konstruktów i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych długości sekwencji telomerowych lub wariantów białek.
- Przygotowanie konstruktów z powtarzalnymi motywami telomerowymi pozostaje wyzwaniem technicznym i może ograniczać wydajność.
