Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej
August 30th, 2024
Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.
Metody jednocząsteczkowe zostały wykorzystane do badania interakcji DNA białek telomerowych. Jednak przygotowanie konstruktów jednocząsteczkowych z powtarzalnym motywem telomerowym pozostaje trudnym zadaniem. W tym protokole przedstawiamy etapy ekspresji, a następnie oczyszczania białka TRF2, przygotowania telomerowego DNA, ustawiania testów mechanicznych pojedynczych cząsteczek i analizowania uzyskanych danych.
Narzędzia do badań nad pojedynczymi cząsteczkami to potężne techniki badania interakcji telomerowego białka DNA. Jednocząsteczkowe metody mechaniczne, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i AFM, zostały wykorzystane między innymi do zbadania zniekształceń DNA zależnych od TRF2, ujawnienia pożywki TRF2 do kolumnowego przechowywania ludzkiej chromatyny telomerowej i obserwacji obecności katalizy telomerazy. Badaliśmy oddziaływania białek telomerowego DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej, umożliwiając precyzyjne pomiary zmian wydłużenia w czasie trwania oddziaływań białkowego DNA pod wpływem przyłożonych sił.
Na podstawie tych pomiarów uzyskaliśmy kinetykę dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA. Ponadto ujawniono tworzenie się pętli w obrębie tych kompleksów. Liczne struktury białek wiążących telomery w kompleksie z DNA zostały rozwiązane za pomocą Cryo EM, krystalografii rentgenowskiej i NMR.
Te metody strukturalne poszerzyły naszą wiedzę na temat interakcji DNA białek telomerowych. Aby dokładniej zbadać dynamikę tych interakcji, opracowaliśmy jednocząsteczkową metodę mechaniczną specjalnie do rozpoczynania interakcji telomerowego białka DNA. Narzędzia jednocząsteczkowe są potężnymi technikami badania interakcji DNA białek w telomerazie, z metodami szczególnie przydatnymi do potwierdzania topologii białek i analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji DNA białek.
Aby rozpocząć transformację komórek Escherichia coli BL21 DE3, rozmrozić 50 mikrolitrów podwielokrotności właściwej zawiesiny komórkowej na lodzie. Dodaj jeden mikrolitr DNA plazmidu pET28a-SUMO TRF2 do właściwej zawiesiny komórkowej i delikatnie zakręć probówką, aby wymieszać zawiesinę. Po przemianie rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na płytce ślimakowej Luria-Bertani lub LB zawierającej 50 mikrogramów na mililitr kanamycyny.
Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia wybierz kolonię przekształconych komórek i hoduj ją w pięciu mililitrach pożywki LB uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
Po inkubacji indukować kulturę za pomocą jednego milimolowego IPTG jako stężenia końcowego. Inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 17 godzin, aby pobudzić ekspresję białka. Załaduj surowe ekstrakty białkowe wraz z buforem ładującym na żel SDS-PAGE.
Próbki należy początkowo badać pod napięciem 100 V przez 30 minut, a następnie pod napięciem 120 V przez 50 minut w buforze Tris-Glycine. Następnie zabarwij kolorem Coomassie na niebiesko, aby zobrazować ekspresję białka. W celu oczyszczenia białka odwirować surowy ekstrakt białkowy o stężeniu 38 000 g przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.
Załadować przefiltrowany supernatant na wstępnie zrównoważoną kolumnę niklu w buforze wiążącym. Przemyć kolumnę buforem wiążącym i rozcieńczyć białko przygotowanym gradientem imidazolu, zbierając 12 frakcji po jednym mililitrze każda. Dodaj glicerol do końcowego stężenia 50% do zagęszczonego i wymienionego buforowo białka do przechowywania.
Ekspresja TRF2 w Escherichia coli została pomyślnie wykazana, jak pokazano za pomocą SDS-PAGE, gdzie wyraźne prążki odpowiadające TRF2 pojawiły się przed i po indukcji. Na początek odwiruj jeden razy 10 do potęgi siedmiu linii komórkowych HeLa zawierających telomerowe fragmenty restrykcyjne DNA o masie 1000 G przez trzy minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS.
Po leczeniu SDS proteinazą K i chlorkiem sodu odwirować zawiesinę komórkową o sile 16 900 G przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej i dodać równą objętość izopropanolu, unikając pływających lipidów lub osadu. Odwirować z dużą prędkością i umyć granulat 500 mikrolitrami 70% etanolu.
Po wysuszeniu osadu DNA ostrożnie zawieś go ponownie w 475 mikrolitrach buforu TE i delikatnie wymieszaj, stukając w dno probówki. Teraz dodaj 25 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNazy A i postukaj w probówkę, aż granulka całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj 1/10 objętości trzech molowych octanu sodu i dwie objętości zimnego 100% etanolu i umieść probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin.
Po odwirowaniu i przepłukaniu 70% etanolem dodaj 100 mikrolitrów buforu TE do osadu DNA. Stuknij w probówkę, aby wymieszać i umieść ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza na dwie godziny, aby całkowicie się rozpuściła. Do trawienia DNA połącz cztery mikrogramy genomowego DNA z jednym mikrolitrem CVIA 2, dwoma mikrolitrami buforu do trawienia 10X i wodą, aby uzyskać całkowitą objętość 20 mikrolitrów.
Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 12 godzin. W termocyklerze podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie zmniejszaj temperaturę o 0,1 stopnia Celsjusza co 30 sekund, aż osiągniesz 25 stopni Celsjusza. Po oczyszczeniu i wysuszeniu pokryj szkiełka dolnej okładki 20 mikrolitrami 0,1% nitrocelulozy i dodaj koraliki referencyjne.
Piecz przykrywkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Zmontuj kanapkę z komórką przepływową, a po podgrzaniu jej do 85 stopni Celsjusza użyj dwóch wacików do masażu zespołu, aż parafilm uszczelni kanał. Umyj 10 mikrolitrów koralików M270 pięciokrotnie za pomocą magnesu o pojemności 50 mikrolitrów bufora roboczego.
Po umyciu dodaj kulki na wierzchu strawionego genomowego DNA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Delikatnie przesuń probówkę kilka razy, aby wymieszać kulki i próbkę DNA. Pozostaw mieszaninę na lodzie na godzinę.
Po inkubacji przemyć mieszaninę 500 mikrolitrami buforu roboczego trzykrotnie za pomocą magnesu w celu pociągnięcia kulek w dół, w 10-minutowych odstępach między myciami. Ponownie zawiesić próbkę w buforze roboczym i załadować 30 mikrolitrów mieszaniny do celi przepływowej. Po 30 minutach przepłucz niezwiązane kulki magnetyczne.
Po umieszczeniu celi przepływowej na soczewce obiektywu, wybierz parę pięciomilimetrowych magnesów sześciennych ułożonych w konfiguracji pionowej i ustaw uchwyt magnesu na osi X ścieżki światła pęsety magnetycznej w celu obrazowania. Uruchom graficzne oprogramowanie do programowania i podłącz kontrolery pęsety magnetycznej. Dostosuj pole widzenia, aby zlokalizować koralik odniesienia na dole komory przepływowej i nieznacznie wyreguluj soczewkę obiektywu tak, aby koralik odniesienia pokazywał wyraźne pierścienie dyfrakcyjne.
Napisz skrypt w MATLAB, aby kontrolować ruchy motoryczne do testów rampy siły. Zaimportuj skrypt do graficznego oprogramowania programistycznego, aby przetestować eksperymenty z pojedynczą cząsteczką. Przy wolnym natężeniu przepływu załaduj 200 mikrolitrów 10 nanomolowych TRF1 do komory przepływowej.
Po 30 minutach wiązania wybierz skrypt do eksperymentu z rampą siły ze współczynnikiem ładowania siły plus minus jeden pikonewton na sekundę. Nazwij pliki danych i uruchom eksperyment. Integralność genomowego DNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, przy czym powstałe TRF wykazywały stałą długość w różnych liniach komórek ludzkich.
Telomeryczne sekwencje powtórzeń w TRF wykryto za pomocą southern blot, wykazując wyraźne sygnały hybrydyzacji. Krzywe rozciągania sił z testu rampy siły wykazały zygzakowate wzory podczas rozciągania, co wskazuje na zerwanie oddziaływań DNA białek. Kinetyka dysocjacji telomerowych kompleksów białkowych DNA wykazała liniową zależność między siłą a szybkością dysocjacji.
Co więcej, niejednorodność długości telomerowego DNA z komórek ludzkich bada mechanizm tworzenia pętli w telomerach o różnej długości.
Przegląd
Ten protokół opisuje wykorzystanie pojedynczo-cząsteczkowych magnetycznych szczypiec do badania interakcji między białkami wiążącymi DNA telomerowe TRF1 i TRF2 oraz ludzkimi telomerami. Szczegółowo omawia przygotowanie telomerów i białek, przebieg eksperymentów oraz metody zbierania i analizy danych.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Biologia Molekularna
Wprowadzenie
- Metody pojedynczej cząsteczki są niezbędne do badania interakcji białko-DNA.
- Przygotowanie konstruktów z motywami telomerowymi powtarzającymi się jest trudne.
- TRF2 odgrywa kluczową rolę w strukturze chromatyny telomerowej.
- Szczypce magnetyczne umożliwiają precyzyjne pomiary interakcji molekularnych.
Cel Badań
- Zaprojektowanie wykorzystania szczypiec magnetycznych w badaniach interakcji białek telomerowych.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu przygotowania TRF2 i DNA telomerowego.
- Analiza właściwości mechanicznych DNA pod wpływem wiązania białek.
Wykorzystane Metody
- Ekspresja i oczyszczanie białka TRF2.
- Przygotowanie telomerowych konstruktów DNA.
- Konfiguracja pojedynczo-cząsteczkowych testów mechanicznych z wykorzystaniem szczypiec magnetycznych.
- Zbieranie i analiza danych dotyczących interakcji białko-DNA.
Główne Wyniki
- Pomyślne przygotowanie TRF2 i DNA telomerowego do eksperymentów.
- Wyjaśniono zniekształcenia DNA zależne od TRF2 pod wpływem sił mechanicznych.
- Ujawniono spostrzeżenia dotyczące aktywności telomerazy i struktury chromatyny.
- Dostarczono ramy dla przyszłych badań nad interakcjami telomerowymi.
Wnioski
- Techniki pojedynczej cząsteczki są potężne w badaniach białek telomerowych.
- Ten protokół ułatwia eksplorację interakcji DNA-białko.
- Odkrycia przyczyniają się do zrozumienia biologii telomerów.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-molecule magnetic tweezers enable precise, quantitative interrogation of telomeric protein-DNA interactions, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early-stage oncology drug discovery. By resolving dissociation kinetics and loop formation of TRF1/TRF2 on full-length human telomeric DNA, this approach enhances predictive confidence at the intersection of discovery biology and translational research. The method supports portfolio decisions by clarifying the functional impact of candidate modulators on telomere maintenance mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of TRF2 and TRF1 binding kinetics to telomeric DNA for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying protein-induced DNA distortion and loop formation.
- Provides predictive confidence for prioritizing telomere-associated targets in oncology pipelines.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated telomeric DNA constructs for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative force-extension and dissociation data for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-DNA interactions at the single-molecule level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant telomere biology by using full-length human telomeric DNA substrates.
- Supports translational biomarker development through kinetic and structural readouts of protein-DNA complexes.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular mechanism to functional telomere protection.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule mechanical assay bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling hypothesis-driven interrogation of telomeric protein-DNA interactions.
- Discovery Biology: Quantifies dissociation kinetics and loop formation to clarify TRF2/TRF1 function in telomere maintenance.
- Screening: Provides standardized, reproducible force-extension measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs—such as force-dependent dissociation rates—enabling robust comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular interaction data to disease-relevant telomere dynamics and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mechanistic studies of protein-DNA interactions in telomere biology and beyond.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in telomere-targeted drug discovery.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable single-molecule assays for cross-program deployment.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying target engagement and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of telomere-modulating agents in oncology and aging portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, DNA preparation, and single-molecule biophysics.
- Demands access to magnetic tweezers instrumentation and quantitative imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of construct preparation and data analysis protocols.
- May require adaptation for different telomeric sequence lengths or protein variants.
- Construct preparation with repetitive telomeric motifs remains technically challenging and may limit throughput.
