Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

dd_PCR jest szeroko stosowaną techniką określania miana genomu AAV, ale obecnie brakuje protokołu konsensusu. Nasz protokół jest sprawdzonym przewodnikiem krok po kroku, jak przygotować próbki i wykonać dd_PCR w celu dokładnego miareczkowania genomu. W porównaniu z qPCR, dd_PCR oferuje kilka zalet, w tym zwiększoną precyzję, większą wytrzymałość oraz bardziej absolutną i bezpośrednią kwantyfikację sekwencji docelowych bez konieczności stosowania standardowych krzywych.

Co więcej, dzięki dobrze zaprojektowanemu zestawowi sond starterowych, pozwala dd_PCR na specyficzną tragedię w wykrywaniu, w przeciwieństwie do innych technik, które wykrywają całe DNA. Opracowanie ustandaryzowanego protokołu konsensusu do kwantyfikacji genomu wektora poprawi niezawodność i jednolitość kontroli jakości rekombinowanych AAV w różnych laboratoriach. Ułatwi to szerszej społeczności zarówno badania, jak i zastosowania kliniczne rekombinowanych wektorów AAV.

Na początek należy wymieszać próbkę wirusa związanego z adenowirusem lub AAV i odwirować, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie probówki. Dodać 45 mikrolitrów roztworu zawierającego DNazę I do 0,2 mililitra 8-probówki z 8 probówkami do PCR. Przenieść pięć mikrolitrów próbki AAV do probówki zawierającej roztwór DNA.

Po wirowaniu należy krótko odwirować próbkę, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie. Za pomocą termocyklera inkubuj próbki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie schładzaj je do czterech stopni Celsjusza. Następnie należy przygotować odpowiednie rozcieńczenie próbki DNA poddanej działaniu substancji w buforze rozcieńczającym AAV w świeżym 0,2 mililitrowym pasku z 8 probówkami do PCR.

Po seryjnym rozcieńczeniu należy zwirować próbki i odwirować, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie. Połącz startery do przodu i do tyłu, sondę dd_PCR super mieszanką i wodą wolną od DNaz w wymaganych ilościach. Zmieszać mieszankę wzorcową i krótko odwirować probówkę.

Następnie przenieś 19,8 mikrolitra mieszanki głównej do każdej probówki na świeżym 0,2 mililitrowym pasku 8-probówkowym PCR. Na początek przygotuj próbkę AAV potraktowaną DNazą I i dd_PCR mieszankę główną. Dodać 2,2 mikrolitra rozcieńczonej próbki do 19,8 mikrolitra dd_PCR mieszanki głównej w każdej probówce 8-probówkowego paska do PCR i dobrze wymieszać.

Przenieść 20 mikrolitrów mieszaniny do studzienek znajdujących się w środkowym rzędzie próbek wkładu wytwarzającego kropelki. Następnie przenieś 60 mikrolitrów oleju wytwarzającego kropelki do studzienek znajdujących się w dolnym rzędzie oleju wkładu wytwarzającego kropelki. Umieść gumową uszczelkę na kartridżu generującym kropelki, a następnie umieść go w generatorze kropel.

Po wytworzeniu kropelek użyj ośmiokanałowej pipety, aby powoli przenieść 42,5 mikrolitra roztworu z wkładu do generowania kropel na wielodołkową płytkę do PCR. Uszczelnij płytkę PCR osłoną z folii aluminiowej za pomocą podgrzewacza sufitowego przez pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza. W celu amplifikacji umieść płytkę w termocyklerze z modułem reakcyjnym o głębokości 96 głębokości, zamknij ją bezpiecznie i uruchom program PCR.

Po zakończeniu załaduj płytkę do czytnika kropelkowego, wprowadź wymagane informacje do oprogramowania systemowego i rozpocznij odczyt. Na wykresie amplitudy 1D zaobserwowano wyraźną separację między dodatnimi i ujemnymi kroplami, co sugeruje udany pomiar. Drugi wykres amplitudy 1D pokazywał krople deszczu z kroplami rozproszonymi między chmurami dodatnimi i ujemnymi, co wskazuje na potencjalny problem z dokładnością pomiaru.

Dane wyjściowe z serii AAV wykazały spójne wyniki, gdy jedna próbka była mierzona w duplikatach w dwóch różnych rozcieńczeniach.