Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Nasze badania koncentrują się na optymalizacji przygotowania antygenu do testów hamowania hemaglutynacji. Aby poprawić dokładność wykrywania przeciwciał NDV, udostępniamy metodę szybkiego i dokładnego przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Test HI pozostaje najpowszechniejszą metodą wykrywania przeciwciał NDV.

Jednak nowe technologie, w tym zautomatyzowane systemy obsługi cieczy, wysokowydajne platformy serologiczne i zaawansowane narzędzia do obrazowania, mogą być również zintegrowane z testem HI. Umożliwiają one szybszą i dokładniejszą analizę, zwłaszcza przy obsłudze dużych partii. Opracowaliśmy skuteczną metodę dokładniejszego wykrywania miana kwasu hialuronowego w roztworze podstawowym antygenu, w połączeniu z rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem adiustacji.

Takie podejście zapewnia dokładną metodę i minimalizuje zadania obliczeniowe, zwiększając wydajność i wiarygodność testów oraz przyczyniając się do poprawy nadzoru i kontroli chorób w populacjach drobiu. Zawiesina czerwonych krwinek kurcząt i wizualny odczyt wyników HA HI nadal przyczyniają się do zmienności. Nasze laboratorium skupi się na standaryzacji zawiesiny RBC i badaniu wizji komputerowej lub innych metod digitalizacji wyników testu HA HI, zmniejszając subiektywność i zwiększając spójność.

Na początek dodaj trzy mililitry roztworu Alserver do sterylnej, 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Zbierz jeden mililitr krwi z żyły skrzydłowej każdego z trzech nieodpornych kurczaków. Następnie natychmiast przenieś pobraną krew do probówki przeciwzakrzepowej i delikatnie wymieszaj zawartość przez odwrócenie.

Napełnij probówkę sterylnym PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 12 mililitrów. Delikatnie wymieszaj roztwór, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie składników. Następnie umieścić probówkę w wirówce wyposażonej w poziomy wirnik i wirować pod ciśnieniem 500 G przez 10 minut.

Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i warstwę białych krwinek z probówki. Za pomocą pipety odwróć pipetą jeden mililitr granulatu RBC do 99 mililitrów sterylnego roztworu PBS, aby przygotować 1% zawiesinę RBC. Aby rozpuścić liofilizowany antygen, dodaj dwa mililitry sterylnego PBS do ampułki zawierającej go.

Delikatnie wstrząśnij ampułką, aby całkowicie rozpuścić zawartość i odstaw na dwie do trzech minut, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków. Podwielokrotność rozpuszczonego roztworu rozlać do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych i przechowywać w zamrażarce ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Na początek dozuj odpowiednio 40, 80, 120 i 160 mikrolitrów PBS do czterech sąsiednich dołków jednorazowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V.

Dodaj 20 mikrolitrów odtworzonego antygenu do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby uzyskać rozcieńczenie. Następnie wyraźnie oznacz nową płytkę do mikromiareczkowania dla kolejnych kroków i dozuj 25 mikrolitrów PBS do każdej studzienki w rzędach od jednego do pięciu. Za pomocą pipety wielokanałowej umieść 25 mikrolitrów rozcieńczonych roztworów antygenu w pierwszych studzienkach rzędów od pierwszego do pięciu.

Odpipetować zawartość w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Następnie przenieś 25 mikrolitrów z pierwszego dołka każdego rzędu do drugiego dołka, dokładnie mieszając. Odrzucić 25 mikrolitrów końcowego roztworu po 11. kolumnie.

Następnie dodaj odpowiednio 25 mikrolitrów PBS i 1% zawiesiny RBC kurczaka do każdej studzienki, zaczynając od studzienek zawierających najniższe stężenie antygenu. Umieścić płytkę do mikromiareczkowania na wytrząsarce do mikropłytek, aby dokładnie wymieszać. Pozostawić płytkę w spokoju na blacie w temperaturze pokojowej na około 30 minut, aby umożliwić całkowite osadzenie się erytrocytów w 12. kolumnie.

Obliczyć współczynnik rozcieńczenia do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU, korzystając ze wzoru przedstawionego poniżej. Oznaczyć całkowitą objętość potrzebnego roztworu 4-HAU oraz wymagane objętości podstawowego roztworu antygenu i PBS przy użyciu podanego wzoru. Za pomocą pipety przenieś obliczoną objętość PBS do pojemnika.

Dodać odpowiednią objętość podstawowego roztworu antygenu i dokładnie wymieszać, aby przygotować roztwór antygenu 4-HAU. Następnie dozować 25, 50, 75, 100, 125 i 150 mikrolitrów PBS do sześciu sąsiednich dołków płytki do mikromiareczkowania. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu antygenu 4-HAU do każdego dołka i pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby zapewnić prawidłowe rozcieńczenie.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 25 mikrolitrów każdego rozcieńczonego roztworu antygenu z początkowego rzędu do studzienek innego rzędu. Następnie dodaj 25 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, a następnie 25 mikrolitrów 1% zawiesiny RBC kurczaka w każdym dołku. Umieść płytkę na wytrząsarce do mikropłytek na około 20 sekund, aby dokładnie wymieszać zawartość.

Uważnie obserwuj wzorce hemaglutynacji w studzienkach i zapisz wyniki.