Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

W naszym laboratorium skupiamy się na rzadkim typie guzów mózgu, który nazywa się rozlanymi glejakami o niskim stopniu złośliwości. Glejaki te dotykają często młodych dorosłych i charakteryzują się mutacją w genie zwanym IDH-1. Głównym postępem w dziedzinie glejaków jest, po pierwsze, zastosowanie modeli 3D, takich jak guz lub organoid, po drugie, zastosowanie obrazowania bezpośrednio w mózgu myszy z przeszczepionymi glejakami, a po trzecie, zastosowanie specjalnego transkryptomicznego i jednokomórkowego RNA.

Głównym wyzwaniem, przed którym stoimy, gdy pracujemy nad glejakami z mutacją IDH-1, jest niska proliferacja tych komórek i ich trudność do utrzymania w hodowli, dzięki czemu opracowaliśmy i zdefiniowaliśmy protokół utrzymania komórek przy życiu, a dla niektórych z nich byliśmy w stanie wyprowadzić linię komórkową. ale nie dla wszystkich pacjentów. Badając zmutowane komórki IDH-1 in vitro, ale także in vivo, odkryliśmy, że komórki te są dość plastyczne i mogą przyjąć los dwóch komórek, albo są podobne do astrocytów, albo do owalu, a także odkryliśmy, że szturchanie odgrywa główną rolę w tej plastyczności. Dzięki temu nowemu protokołowi eksplantacji byliśmy w stanie utrzymać zmutowane komórki IDH-1 in vitro przez tygodnie, ale nawet dłużej, przez miesiące, i wykazaliśmy, że istnieją różne typy komórek nowotworowych, jak odkryliśmy u pacjentów.

Odkryliśmy również, że istnieją pewne komórki środowiska nowotworowego, takie jak komórki mikrogleju, które umożliwiają badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a ich środowiskiem, więc modele te oferują dokładniejsze odwzorowanie różnorodności biologicznej występującej w guzach. Na początek przygotuj miejsce pracy i ułóż wszystkie wysterylizowane narzędzia. Przenieś resekcję guza na lód, aby zachować żywotność tkanki do hodowli.

Zbadaj resekcję guza pod kątem wielkości i niejednorodności. Wybierz porcje o szarym kolorze z miękką lub galaretowatą teksturą, ponieważ obszary te są bogate w komórki nowotworowe. Przenieś wybrane próbki guza do 1,5 mililitrowej mikroprobówki lub kriowialu i dodaj jeden mililitr pożywki.

Za pomocą sterylnych nożyczek posiekaj próbki na małe kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Następnie sterylnymi nożyczkami przytnij koniec końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby utworzyć szeroki otwór o średnicy około trzech do czterech milimetrów. Odpipetować od 100 do 200 mikrolitrów zmielonych fragmentów tkanek za pomocą wyciętej końcówki do dołków płytki.

Delikatnie zhomogenizuj zawiesinę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, ponieważ mniejsze fragmenty mają tendencję do szybkiego osiadania. Umieść płytkę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 100% wilgotnością. Pożywkę należy wymieniać codziennie, jeśli aktywność metaboliczna guza powoduje szybkie żółknięcie lub jeśli wymaga tego gęstość fragmentów.

Aby rozpocząć, uzyskaj zawiesinę mielonej tkanki nowotworowej. Do przygotowania pożywki zamrażającej dodaj dwa mililitry DMSO do ośmiu mililitrów pożywki do hodowli komórkowych. Połącz jedną objętość mielonej zawiesiny guza z równą objętością przygotowanej 20% pożywki do zamrażania DMSO.

Ostrożnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Szybko przenieś kriowiale do pojemnika kriogenicznego, aby ułatwić stopniowe obniżanie temperatury, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed przeniesieniem do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. W celu rozmrożenia usuń kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podgrzej je, aż około 80% komórek się rozmrozi. Aby usunąć DMSO, szybko przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów wstępnie podgrzanego 1X PBS i odwiruj probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i powtórzyć płukanie PBS, a następnie odwirować.

Odessać supernatant, upewniając się, że osad pozostaje nienaruszony. Zawiesić osad w odpowiedniej ilości podłoża i przenieść go do wstępnie powlekanej płytki PDL Laminin 24-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zaobserwowano, że komórki wykazujące wydłużoną, dwubiegunową lub wielobiegunową morfologię rosną z eksplantatów guza przyczepionych do powierzchni studzienki po minimalnym czasie hodowli wynoszącym cztery tygodnie. Komórki pochodzące z guza wykazywały porównywalną morfologię między świeżymi i kriokonserwowanymi guzami w trzech przypadkach, o czym świadczą wydłużony i dwubiegunowy wygląd tworzący skomplikowane sieci. Wyraźnie zaobserwowano promieniową migrację komórki pochodzącej z nowotworu wzdłuż włókna.

Nieudane hodowle eksplantatów wykazały nieprzylegające fragmenty i liczne komórki gittera, charakteryzujące się autofluorescencją i zawartością lipidów.