Name: Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Poznaj nieenzymatyczną metodę eksplantatów dla długoterminowej hodowli glejaków z mutacją IDH1. Protokół zachowuje ekspresję białka i umożliwia badanie plastyczności komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Użyte tutaj fragmenty guza są częścią kolekcji NEUROLOGY świeżych próbek tkanek utrzymywanej przez Centrum Zasobów Biologicznych w Szpitalu Uniwersyteckim w Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Badania przeprowadzono w ramach projektu pt. "Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas" kierowanego przez prof. J. P. Hugnota (nr projektu J. P. Hugnot. RECH/P722/1-5). Prace te były wspierane przez La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C jest wspierany przez Krajową Radę Nauk Humanistycznych i Technologii (CONAHCYT) w Meksyku oraz Stowarzyszenie Badań nad Nowotworami Mózgu (ARTC) we Francji.

Fragmenty guza wykorzystane w tym protokole pochodziły z dobrze scharakteryzowanej i zatwierdzonej etycznie kolekcji, za zgodą pacjentów. Badania te zostały przeprowadzone w ramach projektu pt. Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Projekt nr RECH/P722/1-5) i zostały zatwierdzone przez radę naukową biobanku guzów w dniu 28 sierpnia 2023 r.
1. Przygotowanie płytek hodowlanych
UWAGA: Kroki te należy wykonywać w sterylnym dygestorium z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkankowych.
<ol>
	<li>Przynajmniej 1 h przed hodowlą przygotować płytki 24-dołkowe powlekane poli-D-lizyną (PDL) i lamininą.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 mg proszku PDL w 100 mL buforu boratowego (pH 8.4) do uzyskania stężenia końcowego 100 µg/mL. Po rozpuszczeniu przefiltrować roztwór (0.22 µm) w celu zapewnienia sterylności. PDL jest gotowy do użycia; przygotować alikwoty po 3 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Odmrozić probówkę z lamininą o stężeniu 1-2 mg/mL w temperaturze 4 °C, aby zapobiec żelowaniu. Przygotować alikwoty po 50 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Należy unikać wielokrotnego zamrażania i odmrażania.</li>
		<li>Powlekanie płytek
		<ol>
			<li>Krok opcjonalny: umieścić sterylne szkiełka przykrywowe Ø 13 mm, odpowiednie do naczyń do hodowli komórkowych, w płytce 24-dołkowej, jedno szkiełko na dołek. 
			UWAGA: Krok ten służy do późniejszego immunostainingu eksplantów glejaka.</li>
			<li>W celu powleczenia dołków zmieszać 3 mL roztworu PDL z 9 mL 1x PBS i dodać 50 µL lamininy. Dodać 500 µL tego roztworu do każdego dołka, aby uzyskać stężenie powłoki 1-2 µg/cm². Inkubować powlekłe płytki w temperaturze pokojowej, najlepiej z powolnym kołysaniem (15 RPM), przez co najmniej 1 h.</li>
			<li>Bezpośrednio przed hodowlą usunąć roztwór PDL-lamininy i przemyć dwukrotnie sterylnym 1x PBS. 
			UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia dołków.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pożywki
<ol>
	<li>Kultury eksplantów z mutacją IDH1 hoduj w zdefiniowanej pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o L-glutaminę oraz mieszankę zastępującą surowicę, składającą się z N2 i B27 bez witaminy A. Aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej, stosuj antybiotyki, w tym cyprofloksacynę, gentamycynę i funginę. Dodatkowo do pożywki dodaj czynniki wzrostu: heparynę, EGF oraz FGF2, przefiltruj ją (0.2 µm) i przechowuj przez maksymalnie 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące składników i przygotowania pożywek znajdują się w Tabeli 1 oraz w Tabeli Materiałów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie eksplantów
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do przetwarzania próbek należy przygotować stanowisko pracy i sterylne narzędzia, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1A. Wkład chłodzący należy zdezynfekować, spryskując go 70% etanolem. Nożyczki i pincetę należy wysterylizować poprzez zanurzenie w 70% etanolu, a następnie wypłukać w PBS.</li>
	<li>Wycięty guzer należy niezwłocznie przenieść na lód w celu hodowli, idealnie w ciągu 2 h od ekstrakcji chirurgicznej (Rysunek 1B). 
	UWAGA: Próbka guza powinna mieć średnicę minimum 9-10 mm, aby zapewnić lepsze wyniki. Tkankę transportuje się bez pożywki hodowlanej, ponieważ metoda ta jest preferowana w celach histologicznych. Brak cieczy zapobiega tworzeniu się kryształków lodu podczas szybkiego zamrażania, co pozwala zachować integralność tkanki do późniejszego badania histologicznego, jeśli będzie ono konieczne.</li>
	<li>Naczynie hodowlane z preparatem guza należy umieścić na wkładzie chłodzącym i delikatnie wypłukać 1X PBS w celu usunięcia nadmiaru krwi.</li>
	<li>Wycięty guz często charakteryzuje się znaczną wielkością i heterogenicznością, składając się z masy guza, tkanki naciekowej oraz komponentów pozaguzowych (Rysunek 1C). Do izolacji komórek nowotworowych należy wybrać fragmenty o szarym kolorze i miękkiej lub galaretowatej strukturze, ponieważ mają one tendencję do zawierania większej liczby komórek guza. Z kolei należy unikać obszarów twardych i białych, gdyż mogą one zawierać mniej komórek guza nadających się do hodowli (Rysunek 1D), a także obszarów zczerniałych, które prawdopodobnie są wynikiem elektrokoagulacji i mogą nie dostarczyć wiarygodnych wyników analizy.</li>
	<li>Wybrane próbki należy przenieść do probówki typu microtube 1,5 mL lub krioprobówki w celu rozdrobnienia. Do probówki 1,5 mL lub krioprobówki należy dodać 1 mL sterylnej pożywki i siekać próbkę sterylnymi nożyczkami, aż do uzyskania małych fragmentów (1-2 mm3). 
	UWAGA: Aby uzyskać drobne fragmenty, zazwyczaj o wielkości 1-2 mm3, konieczne jest około 1-2 min siekania (Rysunek 1E).</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek należy ostrożnie odciąć końcówkę niebieskiego tipa do pipety 1 000 µL, tworząc szeroki otwór o średnicy około 3-4 mm. Używając tak zmodyfikowanego tipa, należy nabrać 50-200 µL rozdrobnionych fragmentów tkanki i równomiernie rozdzielić je pomiędzy poszczególne studzienki. Ponieważ mniejsze fragmenty mają tendencję do szybkiego opadania, należy delikatnie rehomogenizować zawiesinę w każdej studzience, aby zapewnić jednorodny rozkład. 
	​UWAGA: Należy unikać przepełnienia i zachować równowagę, nie wprowadzając nadmiernej liczby fragmentów do każdej studzienki (Rysunek 1F).</li>
	<li>Fragmenty guza należy inkubować w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 i 100% wilgotnością. Pożywkę należy wymieniać codziennie, jeśli wymaga tego aktywność metaboliczna guza (wskaźnikiem jest szybkie żółknięcie pożywki) oraz liczba fragmentów w każdej studzience. Podczas wymiany pożywki należy zachować ostrożność, delikatnie aspirując pożywkę pipetą z tipem 200 µL, dbając o to, aby nie poruszyć przytwierdzonych fragmentów guza.</li>
</ol>
<img alt="Proces przygotowania tkanki guza; konfiguracja sprzętu; próbki tkanki; wyniki wirowania; wykres analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura hodowli eksplantów guza. Uzyskano wycinek z resekcji rozlanego glejaka niskiego stopnia od 44-letniego pacjenta zdiagnozowanego z astrocytoma stopnia II zgodnie z klasyfikacją WHO 2021. Guz wykazywał mutację IDH1 (Ekson 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) oraz mutację TP53 (Ekson 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), wraz z brakiem barwienia ATRX. Nie wykryto mutacji w miejscach wiązania Ets/TCF (C250T i C228T) genu TERT. (A) Powierzchnia robocza obejmuje wkład chłodzący, zapewniający środowisko minimalizujące degradację próbki i utrzymujące żywotność komponentów biologicznych. Środki ostrożności te są istotne dla zachowania jakości i integralności tkanki. (B) Transport próbki ze szpitala do laboratorium powinien odbywać się w lodzie. (C) Fragment resekcji guza. Strzałki wskazują części najbardziej odpowiednie do hodowli. (D) Przeprowadzono sekcję guza w celu wybrania najistotniejszej części do rozdrobnienia. W naszym doświadczeniu istota biała zazwyczaj z mniejszym prawdopodobieństwem generuje udane eksplanty. (E) Fragmenty guza o średnicy około 1-2 mm³ w probówce 15 mL po mechanicznym rozdrobnieniu nożyczkami. (F) Liczba kawałków guza wymagana do prawidłowego wysiewu przedstawiona dla studni na płytce 24-dołkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Kriokonserwacja i rozmrażanie rozdrobnionego guza
UWAGA: Kriokonserwacja zapewnia zabezpieczenie na wypadek kontaminacji i utraty kultur eksplantatów lub umożliwia późniejsze przetworzenie próbek guza.
<ol>
	<li>Kriokonserwacja: Przygotować medium do zamrażania (20% v/v roztwór DMSO), dodając 2 mL DMSO do 8 mL pożywki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Połączyć 1 objętość zawiesiny z rozdrobnionego guza z równą objętością 20% medium do zamrażania DMSO, aby uzyskać końcowe stężenie 10% DMSO. Ostrożnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie, a następnie rozdzielić około 1 mL do kriotubek.</li>
	<li>Szybko przenieść kriotubki do pojemnika kriogenicznego w celu stopniowego obniżania temperatury, a następnie inkubować przez noc w temperaturze -80 °C przed ostatecznym przechowywaniem w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Ten krok musi być wykonany natychmiast po umieszczeniu komórek w medium do zamrażania, ponieważ niektóre krioprotektory, takie jak DMSO, mogą być szkodliwe, jeśli komórki są im wystawione w temperaturze pokojowej dłużej niż to konieczne.</li>
	<li>Rozmrażanie: Wyjąć kriotubki z ciekłego azotu i natychmiast umieścić je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż rozmrozi się około 80% komórek.</li>
	<li>Aby usunąć DMSO, szybko przenieść zawiesinę pipetą do probówki do wirowania o pojemności 15 mL zawierającej 5 mL podgrzanego 1x PBS i wirować przy 300 × g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i powtórzyć płukanie w 1X PBS, a następnie wirowanie (krok 4.5). Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, i dodać odpowiednią ilość pożywki, aby przenieść komórki na powlekone PDL-Lamininą płytki 24-dołkowe i umieścić je w inkubatorze.</li>
	<li>Po 24 h sprawdzić, czy komórki przywarły. Po kilku dniach usunąć nieprzywarte fragmenty poprzez wymianę pożywki hodowlanej.</li>
</ol>
5. Pasażowanie hodowli
UWAGA: Po ustabilizowaniu eksplanty mogą być wykorzystane do wideomikroskopii lub immunubarwienia. Alternatywnie, jeśli komórki nowotworowe wywędrowały z eksplantu i wydają się zdrowe, eksplant można pasażować poprzez dysocjację enzymatyczną i ponownie wysiać w dołkach w celu dalszych eksperymentów. Należy jednak zauważyć, że niniejszy protokół nie jest przeznaczony do wielokrotnego pasażowania. Zazwyczaj można podjąć próbę tylko jednego pasażu, zanim komórki nowotworowe ulegną starzeniu lub obumrą. Nie wszystkie hodowle eksplantów zakończą się udanym pasażem.
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić pasaż, usunąć stare medium, przemyć 1X PBS, a następnie dodać do dołków (125 µL) 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 3-4 min w 37 °C, po czym dodać 6,5 µL inhibitora trypsyny, 12 µL 20 mM CaCl2 (rozcieńczenie końcowe do 2mM) oraz 1 µL DNAzy I. 
	UWAGA: Czas inkubacji niezbędny do dysocjacji może się różnić w zależności od hodowli. Należy sprawdzić, czy komórki oddzieliły się po co najmniej 3 min. Zazwyczaj eksplant może nie ulec pełnej dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek i często pozostają małe skupiska, z których mogą powstać nowe hodowle z eksplantów.</li>
	<li>Używając pipety p1000 ustawionej na 500-600 µL, delikatnie przepłukać zawartość, aby rozbić eksplanty. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dodać 5 mL 1x PBS i wirować przez 5 min przy 300 × g. Odessać nadsącz, resuspender osad w świeżym, uprzednio ogrzanym medium i policzyć komórki w celu zasiewu.</li>
	<li>Zidentyfikować hodowle z potencjałem do generowania linii komórkowych, obserwując dzielące się komórki pod mikroskopem fazokontrastowym. Komórki te zazwyczaj mają zaokrągloną morfologię i widoczne chromosomy, co przedstawiono na Rysunku 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+low-grade+glioma+-+changing+concepts+in+diagnosis+and+management%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review.</a> Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).</li>
<li>Louis, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of malignant gliomas.</a> Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).</li>
<li>Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiotherapy+on+diffuse+low-grade+gliomas+evolution%3A+Confronting+theory+with+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data.</a> J Pers Med. 11 (8), 818(2021).</li>
<li>Pirozzi, C. J., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+idh+mutations+for+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The implications of idh mutations for cancer development and therapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).</li>
<li>Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+infiltrating+oligodendroglioma+and+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma.</a> J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).</li>
<li>Suva, M. L., Tirosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glioma+stem+cell+model+in+the+era+of+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics.</a> Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).</li>
<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opracowanie modeli in vitro i przedklinicznych dla niskozłośliwych glejaków z mutacją IDH1 jest szczególnie trudne ze względu na powolny wzrost tych nowotworów oraz złożoność odtworzenia rozległych zmian genomicznych i epigenomicznych wywołanych mutacją IDH. Co więcej, te naciekające komórki nowotworowe aktywnie oddziałują z otaczającymi je komórkami, w tym komórkami odpornościowymi, śródbłonkowymi, glejowymi i neuronalnymi, potencjalnie polegając na nich w celu przetrwania. Ta złożona interakcja jest trudna do odtworzen...

Glejaki rozlane są najczęstszymi pierwotnymi nowotworami mózgu. Guzy te są obecnie nieuleczalne pomimo bardzo intensywnego leczenia (operacja, radioterapia i chemioterapia)1. Coraz więcej dowodów potwierdza hipotezę, że glejakowa geneza wywodzi się z dorosłych komórek macierzystych lub glejowych komórek progenitorowych rezydujących w mózgu2. Chociaż glejaki wielopostaciowe reprezentują najbardziej agresywny typ, rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości (DLGG, guzy stopnia 2) są również powszechne (15% rozlanych glejaków)1,3. DLGG rosną powoli i migrują wzdłuż dróg istoty białej, co jest cechą charakterystyczną tego "rozlanego" nowotworu4. Te DLGG bardzo często nawracają pomimo leczenia, ostatecznie postępując do nowotworów złośliwych o wysokim stopniu złośliwości (stopnie 3 i 4)5.
DLGG charakteryzują się mutacją typu missense w genie dehydrogenazy izocytrynianowej 1 lub 2 (IDH1 lub IDH2), co skutkuje nieprawidłową produkcją onkometabolitu 2-hydroksyglutaranu (2HG). Powoduje to zakłócenie różnicowania komórek poprzez dysregulacje epigenetyczne6. Glejaki z mutacją IDH1 są dalej klasyfikowane do podtypów: gwiaździaki zazwyczaj mają mutacje w ATRX i P53, podczas gdy skąpodrzewiaki charakteryzują się delecjami 1p19q7. Guzy te wykazują niejednorodność komórek nowotworowych. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i immunocharakterystyka ujawniły zróżnicowaną populację komórek nowotworowych, wykazujących fenotypy podobne do komórek macierzystych, astrocytów i oligodendrocytów w tych nowotworach8,9.
W przeciwieństwie do glejaka, który korzysta z łatwo dostępnych, długoterminowych hodowli i linii komórkowych, istnieje zauważalny niedobór narzędzi komórkowych dostosowanych do badania nowotworów z mutacją IDH11. Stanowi to poważną przeszkodę w postępie w rozwoju terapii i pogłębieniu naszej wiedzy na temat glejakogenezy i progresji choroby z mutacją IDH1. Tradycyjne linie komórkowe hodowane w surowicy, choć długo stosowane, nieodpowiednio replikują pierwotne nowotwory, wykazując zmienione profile transkrypcyjne. Alternatywnie, warunki hodowli bez surowicy, zarówno w modelach 2D, jak i 3D guzów, skuteczniej zachowują profile transkrypcyjne komórek nowotworowych i ich fenotypy in vivo, takie jak inwazja na normalną tkankę mózgową10,11.
Ponadto, krótkoterminowe hodowle komórek pochodzące z próbki chirurgicznej pacjenta zachowują profil molekularny i różnorodność komórkową guza, tym samym lepiej reprezentując biologiczne cechy nowotworów w porównaniu z liniami komórkowymi12. W niniejszym artykule wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę hodowli rozproszonych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 w postaci eksplantatów pochodzących ze świeżych lub mrożonych resekcji pacjentów, mając na celu zaspokojenie potrzeby ulepszonych modeli in vitro do badań nad glejakiem i rozwoju terapeutycznego. Oferują również potencjał do wyprowadzania linii komórkowych z mutacją IDH1.

<table><tbody><tr><td>Anty-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&handel;</td><td>556604</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anty-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA001906</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Anty-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Anty-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Dylituion 1:1000</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-IDH1 (R132H)</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen&handel;</td><td>556003</td><td>Napęd 1:1000</td></tr><tr><td>Anty-OLIG1</td><td>R& D Systems&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Anty-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Cyprofloksacyna HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Pojemnik do zamrażania komórek, do 12 x 1 ml lub 2 ml fiolki kriogeniczne</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Asystent i handel;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, bez glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning</td><td>&reg;</td><td>353047</td><td>Wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z powłoką TC, z pokrywką, sterylna&nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x )</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Serum acrodisc 37 mm z GF/0,2 i mikro; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Mikroskop Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3</td><td>Prosty szerokopolowy mikroskop epifluorescencyjny</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją idh1

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

Rozlane glejaki, najbardziej rozpowszechnione pierwotne guzy mózgu, są klasyfikowane na niskie i wysokie na podstawie kryteriów histopatologicznych i mutacji genetycznych. Rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości stanowią podgrupę, dotykającą głównie młodych dorosłych i predysponującą do glejaków o wysokim stopniu złośliwości. Istnieją dwa główne typy rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości: gwiaździaki i skąpodrzewiaki, z których każdy jest zdefiniowany przez odrębne cechy genetyczne i histologiczne. Guzy te charakteryzują się zmutowanym wariantem enzymu metabolicznego IDH1, zaburzając różnicowanie komórkowe. Są niejednorodne, zawierają zarówno proliferacyjne komórki macierzyste, jak i bardziej zróżnicowane, spokojne komórki glejowe. 
Specyficzne dla pacjenta, modele nowotworów in vitro mają znaczny potencjał do odkrywania mechanizmów onkogennych i dostosowywania wyboru leków do spersonalizowanej terapii. Jednak brak wiarygodnych modeli in vitro specyficznych dla glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 utrudnił badania podstawowe i translacyjne. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę hodowli guzów z mutacją IDH1 jako eksplantatów w określonych pożywkach bez konieczności dysocjacji enzymatycznej. Te eksplantaty mogą być utrzymywane przez dłuższy czas, utrzymując ekspresję białka z mutacją IDH1, a także markery komórek progenitorowych oligodendrocytów, takich jak ASCL1 (MASH1), OLIG1 i OLIG2 oraz astrocytów (GFAP, SOX9). Można je również ustalić z zamrożonych guzów w DMSO. Kultury te mogą służyć jako cenna platforma do badań przesiewowych leków, wideomikroskopii i badań genów, ułatwiając w ten sposób postęp w zrozumieniu i leczeniu tych trudnych nowotworów. Oferują również potencjał do wyprowadzania linii komórkowych z mutacją IDH1.

Po kilku dniach niektóre fragmenty guza przylegają do powierzchni dołków, inicjując wypływ komórek z eksplantatów. Czas pomiędzy początkowym wysiewem a pojawieniem się rosnących komórek nowotworowych różni się w zależności od próbki. Początkowe hodowle często zawierają znaczną ilość szczątków komórkowych, co utrudnia ocenę obecności żywych komórek. W związku z tym hodowla powinna być utrzymywana przez minimum 4 tygodnie. Gdy komórki zaczną rosnąć, obserwuje się wydłużone komórki o wyglądzie bipolarnej lub multipolarnej (...

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

W naszym laboratorium skupiamy się na rzadkim typie guzów mózgu, który nazywa się rozlanymi glejakami o niskim stopniu złośliwości. Glejaki te dotykają często młodych dorosłych i charakteryzują się mutacją w genie zwanym IDH-1. Głównym postępem w dziedzinie glejaków jest, po pierwsze, zastosowanie modeli 3D, takich jak guz lub organoid, po drugie, zastosowanie obrazowania bezpośrednio w mózgu myszy z przeszczepionymi glejakami, a po trzecie, zastosowanie specjalnego transkryptomicznego i jednokomórkowego RNA.Głównym wyzwaniem, przed którym stoimy, gdy pracujemy nad glejakami z mutacją IDH-1, jest niska proliferacja tych komórek i ich trudność do utrzymania w hodowli, dzięki czemu opracowaliśmy i zdefiniowaliśmy protokół utrzymania komórek przy życiu, a dla niektórych z nich byliśmy w stanie wyprowadzić linię komórkową. ale nie dla wszystkich pacjentów. Badając zmutowane komórki IDH-1 in vitro, ale także in vivo, odkryliśmy, że komórki te są dość plastyczne i mogą przyjąć los dwóch komórek, albo są podobne do astrocytów, albo do owalu, a także odkryliśmy, że szturchanie odgrywa główną rolę w tej plastyczności. Dzięki temu nowemu protokołowi eksplantacji byliśmy w stanie utrzymać zmutowane komórki IDH-1 in vitro przez tygodnie, ale nawet dłużej, przez miesiące, i wykazaliśmy, że istnieją różne typy komórek nowotworowych, jak odkryliśmy u pacjentów.Odkryliśmy również, że istnieją pewne komórki środowiska nowotworowego, takie jak komórki mikrogleju, które umożliwiają badanie interakcji między komórkami nowotworowymi a ich środowiskiem, więc modele te oferują dokładniejsze odwzorowanie różnorodności biologicznej występującej w guzach. Na początek przygotuj miejsce pracy i ułóż wszystkie wysterylizowane narzędzia. Przenieś resekcję guza na lód, aby zachować żywotność tkanki do hodowli.Zbadaj resekcję guza pod kątem wielkości i niejednorodności. Wybierz porcje o szarym kolorze z miękką lub galaretowatą teksturą, ponieważ obszary te są bogate w komórki nowotworowe. Przenieś wybrane próbki guza do 1,5 mililitrowej mikroprobówki lub kriowialu i dodaj jeden mililitr pożywki.Za pomocą sterylnych nożyczek posiekaj próbki na małe kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Następnie sterylnymi nożyczkami przytnij koniec końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby utworzyć szeroki otwór o średnicy około trzech do czterech milimetrów. Odpipetować od 100 do 200 mikrolitrów zmielonych fragmentów tkanek za pomocą wyciętej końcówki do dołków płytki.Delikatnie zhomogenizuj zawiesinę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, ponieważ mniejsze fragmenty mają tendencję do szybkiego osiadania. Umieść płytkę w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 100% wilgotnością. Pożywkę należy wymieniać codziennie, jeśli aktywność metaboliczna guza powoduje szybkie żółknięcie lub jeśli wymaga tego gęstość fragmentów.Aby rozpocząć, uzyskaj zawiesinę mielonej tkanki nowotworowej. Do przygotowania pożywki zamrażającej dodaj dwa mililitry DMSO do ośmiu mililitrów pożywki do hodowli komórkowych. Połącz jedną objętość mielonej zawiesiny guza z równą objętością przygotowanej 20% pożywki do zamrażania DMSO.Ostrożnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Szybko przenieś kriowiale do pojemnika kriogenicznego, aby ułatwić stopniowe obniżanie temperatury, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed przeniesieniem do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. W celu rozmrożenia usuń kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Podgrzej je, aż około 80% komórek się rozmrozi. Aby usunąć DMSO, szybko przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pięć mililitrów wstępnie podgrzanego 1X PBS i odwiruj probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut. Usunąć supernatant i powtórzyć płukanie PBS, a następnie odwirować.Odessać supernatant, upewniając się, że osad pozostaje nienaruszony. Zawiesić osad w odpowiedniej ilości podłoża i przenieść go do wstępnie powlekanej płytki PDL Laminin 24-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Zaobserwowano, że komórki wykazujące wydłużoną, dwubiegunową lub wielobiegunową morfologię rosną z eksplantatów guza przyczepionych do powierzchni studzienki po minimalnym czasie hodowli wynoszącym cztery tygodnie. Komórki pochodzące z guza wykazywały porównywalną morfologię między świeżymi i kriokonserwowanymi guzami w trzech przypadkach, o czym świadczą wydłużony i dwubiegunowy wygląd tworzący skomplikowane sieci. Wyraźnie zaobserwowano promieniową migrację komórki pochodzącej z nowotworu wzdłuż włókna.Nieudane hodowle eksplantatów wykazały nieprzylegające fragmenty i liczne komórki gittera, charakteryzujące się autofluorescencją i zawartością lipidów.

a-protocol-for-explant-cultures-idh1-mutant-diffuse-low-grade

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film pokazuje proces izolowania i hodowli glejowych komórek progenitorowych z rozlanego wewnętrznego glejaka mostu, czyli tkanki pnia mózgu dotkniętej DIPG. Komórki glejowe wyizolowane z tkanki nowotworowej poprzez trawienie enzymatyczne są hodowane w pożywce neurobazalnej, co sprzyja ich wzrostowi i rozwojowi swobodnie unoszących się neurosfer.

Izolowanie i hodowla komórek z rozlanego glejaka wewnętrznego mostu

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Tutaj prezentujemy system mieszanych hodowli jednowarstwowych ex-vivo do badania migracji ludzkich komórek glejaka (hGC) w czasie rzeczywistym. Model ten zapewnia możliwość obserwowania interakcji między hGC a aksonami mielinizowanymi i niemielinizowanymi w obrębie komory z przedziałami.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek ludzkiego glejaka w kokulturach aksonów i oligodendrocytów w zwoju korzenia grzbietowego

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Dysregulacja proteomiczna odgrywa ważną rolę w rozprzestrzenianiu się glejaków naciekających dynacyjnie, ale kilka istotnych białek pozostaje niezidentyfikowanych. Cyfrowe przetwarzanie przestrzenne (DSP) oferuje wydajne, wysokoprzepustowe podejście do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji białek kandydujących, które mogą przyczyniać się do inwazji i migracji glejaków naciekających.

Cyfrowe profilowanie przestrzenne w celu scharakteryzowania mikrośrodowiska w rozlanym glejaku naciekającym typu dorosłego

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Poznaj nieenzymatyczną metodę eksplantatów dla długoterminowej hodowli glejaków z mutacją IDH1. Protokół zachowuje ekspresję białka i umożliwia badanie plastyczności komórek nowotworowych.

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

Przeglądaj więcej filmów