Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną
4 października 2024
Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.
Nasze ogólne badania koncentrują się na opracowaniu metod optogenetycznych, które zapewniają precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywności białek przez światło. Projektujemy regulowane światłem domeny zwane lightR do regulacji allosterycznej, co pozwala nam badać, w jaki sposób czasowo kontrolowana aktywność białek wpływa na sygnalizację komórkową i funkcje, pomagając w przedklinicznym modelowaniu chorób i opracowywaniu terapii. Optogenetyka stoi przed kilkoma wyzwaniami, w tym osiągnięciem precyzyjnej i odwracalnej kontroli aktywności białka docelowego oraz dokładnym naśladowaniem endogennej kinetyki sygnalizacji.
Kluczowymi kwestiami są zapobieganie niepożądanej aktywacji, umożliwienie ukierunkowanej aktywacji subkomórkowej i zarządzanie fototoksycznością w celu zachowania żywotności komórek. Ponadto opracowanie uniwersalnie kompatybilnych i wytrzymałych narzędzi ma kluczowe znaczenie dla poprawy wszechstronności i powtarzalności w zastosowaniach. Nasz protokół do inżynierii narzędzi lightR w unikalny sposób łączy wiele zaawansowanych funkcji w jeden system, w tym regulację allosteryczną, wysoką czułość, rozdzielczość przestrzenną, ścisłą kontrolę czasową i precyzyjną specyfikę sygnalizacji.
Ta integracja pozwala na przestrajanie różnych białek docelowych, wypełniając luki w innych metodach, które mogą nie mieć jednej lub więcej z tych krytycznych zdolności. Jesteśmy zainteresowani zdefiniowaniem kluczowych procesów sygnalizacyjnych i strukturalnych regulujących migrację komórek. Naszym celem jest wykorzystanie naszej technologii optogenetycznej do analizy regulacji migracji i interakcji komórek śródbłonka.
Zrozumienie, w jaki sposób komórki śródbłonka pośredniczą w przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej i określenie, w jaki sposób rozregulowanie tych procesów przyczynia się do rozwoju choroby. Do analizy biochemicznej kinaz lightR płytka jeden razy 10 do mocy sześciu komórek lin XE na 3,5-centymetrową miskę do hodowli komórek dla każdej grupy eksperymentalnej, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Następnego dnia należy przetransfekować komórki wybranym konstruktem DNA za pomocą odpowiedniego odczynnika do transfekcji.
Przykryj naczynie folią aluminiową i włóż je z powrotem do inkubatora. Po 16 do 18 godzinach transfekcji umieść system lamp panelowych LED o długości 465 nanometrów w inkubatorze do hodowli tkankowych. Umieść perforowany panel z pleksiglasu 10 centymetrów nad lampą, aby uzyskać oświetlenie o mocy trzech miliwatów na centymetr kwadratowy.
Użyj ciągłego oświetlenia w komórkach wyrażających LightR-Src i D388 R-LightR-Src. Włączaj i wyłączaj panel LED ręcznie, aby sterować oświetleniem. Pod koniec eksperymentalnych punktów czasowych zbierz komórki pod bezpiecznym czerwonym światłem, odessaj pożywkę i umyj komórki zimnym PBS.
Globalne oświetlenie komórek lin XE za pomocą zmodyfikowanego LightR-Src przez 60 minut wykazało fosforylację substratów Src, endogennej paxilliny i komórek p130Cas eksprymujących katalitycznie nieaktywny mutant D388 RLightR-Src nie wykazuje fosforylacji substratów Src przy globalnym oświetleniu. Na początek podaj dwa razy 10 do potęgi pięciu komórek hela na 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej w pożywce do hodowli komórkowych. Inkubuj komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Gdy komórki połączą się i osiągną 60 do 70% zbieżności, należy przetransfekować komórki hella za pomocą podanej mieszanki. Przykryj naczynie folią aluminiową, aby zapobiec przypadkowemu oświetleniu komórek. Następnie inkubuj komórki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Następnie umieść zakryte szklanki o średnicy 25 milimetrów i grubości 0,17 milimetra w komorze z sześciodołkową płytką. Pokryj trzy okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe pięcioma miligramami fibronektyny na litr w PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 16 do 18 godzin po transfekcji.
Zbierz transfekowane komórki hela w bezpiecznym, czerwonym świetle, a następnie zagraj około 1 razy 10 do potęgi pięciu transfekowanych komórek hela na każdym szkiełku nakrywkowym w bezpiecznym, czerwonym świetle. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w pożywce do hodowli komórkowych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie należy podgrzać przygotowane podłoża obrazowe i olej mineralny do temperatury 37 stopni Celsjusza.
Następnie dwukrotnie umyj szkiełka nakrywkowe zawierające komórki PBS. Po wybarwieniu i umyciu komórek ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania żywych komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki obrazowej L15 do komory.
Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do podłoża, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Trzymaj komorę przed światłem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do obrazowania. Umieść komorę na stoliku mikroskopowym nagrzanym do 37 stopni Celsjusza.
Wybierz pojedynczą komórkę wyrażającą zarówno szybką wiśnię LightR-Src, jak i Src IRFP. Zaznacz określone obszary zainteresowania w komórce, które chcesz oświetlić. Do tego badania wybierz mały obszar na obrzeżach wybranej komórki.
Obrazuj wybraną komórkę co minutę przez 20 minut w stanie podstawowym przed oświetleniem. Kontynuuj obrazowanie przez 50 minut, oświetlając miejscowo, a następnie 20 minut po aktywacji, co daje łącznie 90 minut. Po zobrazowaniu zapisz filmy w formacie pliku stosu tif do analizy.
Globalne oświetlenie komórek hela doprowadziło do lokalizacji szybkiego LightR-Src do zrostów ogniskowych, które uległy odwróceniu po wyłączeniu niebieskiego światła. To oświetlenie spowodowało również znaczny wzrost rozprzestrzeniania się komórek, które ustało po wyłączeniu niebieskiego światła. Katalitycznie nieaktywny mutant D388 R-LightR-Src nie wykazywał rozsiewu komórek.
Miejscowe oświetlenie komórek hela wykazujących szybką ekspresję LightR-Src spowodowało akumulację konstruktu w zrostach ogniskowych, co doprowadziło do miejscowych wypukłości błony przy 50-minutowym naświetleniu. Nie zaobserwowano dalszego przyrostu obszaru w ciemnościach po 20 minutach po oświetleniu. Fast LightR-Src stopniowo znikał z zrostów ogniskowych w ciemnej fazie.
Środek ciężkości komórki przesunął się w kierunku oświetlonego obszaru. Po szybkiej aktywacji LightR-Src, wskazującej na ukierunkowany ruch komórki.
Przegląd
To badanie koncentruje się na opracowaniu sterownika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) dla precyzyjnej kontroli przestrzenno-czasowej aktywności białka, z wykorzystaniem kinazy tyrozynowej Src jako modelu. Protokół umożliwia badaczom osiągnięcie odwracalnej, sterowanej światłem kontroli nad funkcjami białek, co ułatwia zrozumienie dynamiki sygnalizacji komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Optogenetyka
- Inżynieria białek
- Sygnalizacja i migracja komórkowa
Tło
- Wyzwania w optogenetyce obejmują osiągnięcie precyzyjnej kontroli aktywności białka i naśladowanie endogennej sygnalizacji.
- Rozwiązanie problemu fototoksyczności i niepożądanej aktywacji jest kluczowe dla zachowania żywotności komórek.
- Badanie wprowadza nowe narzędzie LightR, które integruje wysoką wrażliwość, rozdzielczość przestrzenną i specyficzne zdolności sygnalizacyjne.
Stosowane metody
- Inżynieria i charakterystyka domeny LightR dla kinazy Src
- Wykorzystanie komórek HeLa i lin XE do eksperymentów
- Asezy biochemiczne i techniki obrazowania komórek żywych
Główne wyniki
- LightR-Src umożliwia kontrolowane fosforylację substratów Src przy oświetleniu niebieskim światłem.
- Zlokalizowane oświetlenie indukuje rozprzestrzenianie się komórek i kierowany ruch w komórkach HeLa.
- Aktywacja i dezaktywacja LightR-Src wykazują odwracalność i specyficzność w funkcjach komórkowych.
Wnioski
- To badanie demonstruje innowacyjną metodę optogenetycznej kontroli aktywności białek, dostarczając cenny wgląd w zachowanie komórkowe.
- Wyniki mają zastosowanie w preklinicznych modelach badań nad chorobami i rozwoju terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise spatiotemporal control of protein activity is a critical challenge in early discovery and mechanistic de-risking for biopharma R&D. The LightR optogenetic system enables reversible, light-regulated allosteric modulation of target proteins, supporting high-confidence interrogation of signaling pathways and cellular behaviors. This capability enhances predictive confidence and translational continuity from discovery through preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of therapeutic hypotheses by temporally controlling protein function in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of specific protein activation or inactivation.
- Facilitates functional target validation through reversible ON/OFF modulation and minimal background activity.
- Improves predictive confidence in pathway analysis and target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides validated, light-responsive biological systems for quantitative readouts in cell-based assays.
- Enables reproducible and scalable screening of compounds affecting light-regulated protein activity.
- Supports assay standardization by minimizing leakiness and ensuring tight temporal control.
- Allows for platform reuse across diverse enzyme classes and target proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling subcellular and tissue-level control of signaling events.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by modeling dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, reversible modulation of disease pathways.
- Enables mechanistic studies of cell migration and extracellular matrix remodeling relevant to disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The LightR optogenetic system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven modulation of protein activity and quantitative analysis of downstream effects.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by isolating protein function with light.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in light-regulated assays.
- Analytics: Provides phosphorylation and cell migration readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical models by enabling disease-relevant, reversible protein control.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse target classes and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of optogenetic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, optogenetics, and live-cell imaging.
- Needs access to blue-light illumination systems and quantitative imaging platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducible light delivery and data analysis.
- Adaptable to various cell types and enzyme classes with appropriate construct design.
- Phototoxicity and off-target effects must be managed to preserve cell viability and data integrity.
