Name: Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metody optogenetyczne umożliwiające precyzyjną kontrolę aktywności białek za pomocą światła. Wykorzystaj narzędzie LightR do badania dynamiki sygnałowania komórkowego i migracji komórek HeLa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Markowi Shaaya za jego wkład w rozwój enzymów LightR i związanych z nimi protokołów. pCAG-iCre był prezentem od Wilsona Wonga (plazmid Addgene #89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry był prezentem od Mositoshi Sato (plazmid Addgene #122963), konstrukt bRaf-Venus z mutacją V600E był prezentem od Dr. Johna O'Bryana (MUSC); Gen ERK2 z pCEFL-ERK2 (prezent z laboratorium dr Channinga Dera, UNC) został sklonowany do szkieletu mCherry-C1 w celu uzyskania plazmidu mCherry-ERK2; a pmiRFP670-N1 był prezentem od Vladislava Verkhusha (plazmid Addgene # 79987). Prace były wspierane przez granty NIH R33CA258012, R35GM145318 i P01HL151327 dla AK. Prace te były dodatkowo wspierane przez stypendium szkoleniowe T32 VBST T32HL144459 dla Holandii.

Optogenetic Control of Enzyme Activity Using Light-Regulated Allosteric Switch

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasze badanie przedstawia optogenetyczne podejście do badania różnych szlaków sygnałowych i wykazuje jego szerokie zastosowanie w rozwiązywaniu różnych problemów biologicznych. System narzędzi LightR zapewnia kilka istotnych korzyści: (1) allosteryczna regulacja aktywności białek, (2) ścisła kontrola czasowa aktywności, którą można dostroić w celu uzyskania różnej kinetyki aktywacji i inaktywacji, (3) przestrzenna rozdzielczość aktywności na poziomie subkomórkowym, (4) specyficzność modulacji sygnalizacji i aktywności biologicznej oraz (5) szeroki zakres zastosowania do różnych białek docelowych. Warto zauważyć, że LightR w unikalny sposób integruje wszystkie te korzyści w jednym narzędziu, zapewniając w ten sposób znaczący krok naprzód.
Konstrukcja LightR jako przełącznika allosterycznego ma kilka zalet. Zdolność LightR do kontrolowania aktywności białek po umieszczeniu w małej, elastycznej pętli zapewnia znaczną wszechstronność w zastosowaniu do różnych białek o różnych strukturach i funkcjach. Będąc przełącznikiem allosterycznym, LightR reguluje tylko domenę docelową białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie wpływa na inne domeny białka. W związku z tym metoda ta pozwala na specyficzną regulację aktywności bez uszczerbku dla podstawowych funkcji białka, takich jak interakcje z jego partnerami wiążącymi lub natywna lokalizacja w komórkach. Dwuskładnikowe systemy optogenetyczne zostały z powodzeniem zastosowane do regulacji lokalizacji, interakcji lub innych podstawowych funkcji białek za pomocą kontroli homo- lub heterodimeryzacji za pośrednictwem światła 29,30,31,32,33,34,35. Jednak systemy te często wymagają zoptymalizowanej równomolowej ekspresji dwóch białek, co sprawia, że ich zastosowanie jest trudniejsze. Regulacja allosteryczna za pomocą systemu LightR jest osiągana w obrębie pojedynczego białka, a tym samym zapewnia znacznie bardziej wszechstronne podejście do badania sygnalizacji komórkowej.
Szeroki zakres zastosowań przełącznika LightR do różnych klas białek jest częściowo osiągnięty dzięki optymalizacji różnych modułów w domenie LightR. Łączniki łączące LightR z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania oraz łącznik łączący dwie domeny VVD w obrębie LightR (linker między VVD) mogą wpływać na skuteczność regulacji. Wybór elastycznego łącznika między VVD (GGS)4G(GGS)3 zapewnia wystarczającą elastyczność i długość, aby zapewnić asocjację i dysocjację monomerów VVD w domenie LightR. Ten łącznik zapewnił do tej pory skuteczną regulację wszystkich docelowych białek. Jednak w przypadkach, gdy domena LightR nie dezaktywuje wystarczająco białka w ciemności, można wprowadzić sztywniejszy łącznik, który utrzyma domeny VVD dalej od siebie, aby zwiększyć otwarcie zacisku LightR, utrzymując w ten sposób enzym nieaktywny. Łącznik powinien nadal zachowywać wystarczającą elastyczność, aby umożliwić dimeryzację VVD i aktywację docelowego białka. Aby połączyć LightR z interesującym nas białkiem, używamy krótkich elastycznych łączników, GPGGSGG i GSGGPG, dodanych do N- i C-końców domeny LightR. Zapewniają one wystarczającą elastyczność połączenia, zapobiegając w ten sposób nieodwracalnemu zakłóceniu docelowego białka. Są one jednak na tyle krótkie, że umożliwiają zniekształcenie docelowego białka w ciemności, jednocześnie ułatwiając przywrócenie funkcji białka w świetle. Te łączniki wspierają regulację przez LightR dla wielu zastosowań białkowych. Jednak w niektórych przypadkach, gdy te łączniki mogą nie zapewniać wystarczającej inaktywacji białka w ciemności, skrócenie łączników może być korzystne. Takie skrócenie łącznika może zmniejszyć elastyczność i zwiększyć zniekształcenia spowodowane przez otwarty zacisk LightR w ciemności, minimalizując w ten sposób wszelkie nieszczelności. Niemniej jednak ta regulacja może zagrozić maksymalnej aktywności enzymu ze względu na potencjalne zniekształcenia strukturalne w stanie zapalonym. Alternatywnie, zastąpienie wielu aminokwasów w pętli insercyjnej może zapewnić podobne korzyści w postaci zrównoważonej elastyczności w przypadkach, gdy niestabilność konformacyjna nie jest istotnym problemem.
Wiele krytycznych procesów sygnalizacyjnych jest aktywowanych przejściowo lub regulowanych w sposób oscylacyjny 36,37,38,39,40,41,42,43. Przestrajalność narzędzia LightR pozwala nam naśladować złożone wzorce sygnalizacji, a tym samym zapewnia potężne podejście do badania czasowo kontrolowanych procesów biologicznych. Osiągamy to poprzez modulację kinetyki wyłączenia LightR poprzez wprowadzenie mutacji I85V do obu domen VVD. Mutacja ta skraca okres półtrwania dimeru VVD w stanie ciemnym z 18 000 s do 780 s19, ułatwiając w ten sposób szybszą inaktywację enzymu FastLightR.
Kinetyka szybkiej inaktywacji umożliwia również regulację aktywności białek w rozdzielczości subkomórkowej. Enzymy LightR, o powolnej kinetyce, mogą utrudniać obserwację efektów aktywacji subkomórkowej z powodu wewnątrzkomórkowej dyfuzji aktywowanego konstruktu. Dzięki kinetyce fast-off każdy enzym FastLightR, który dyfunduje poza strefę lokalnego oświetlenia, zostanie szybko dezaktywowany. Poprzez selektywną aktywację określonych regionów subkomórkowych naukowcy mogą uzyskać wgląd w lokalne funkcje białek, aby lepiej zrozumieć ich udział w złożonych szlakach komórkowych i sieciach sygnałowych.
Chociaż FastLightR są nieocenione w ograniczonej przestrzennie i czasowo optycznej kontroli aktywności białek w komórkach, nadal istnieją zastosowania, w których pożądana może być kinetyka spowolnienia. LightR z kinetyką spowolnienia może zostać zastosowany w badaniach, w których wymagana jest trwała i zwiększona aktywność indukowana światłem niebieskim. Zastosowania te będą wymagały jedynie rzadkich impulsów świetlnych, aby utrzymać ciągłą aktywność optogenetyczną, minimalizując w ten sposób również problemy, takie jak fototoksyczność. Dla różnych scenariuszy szeroki zakres modyfikacji kinetycznych10,18 może być wdrażany samodzielnie lub w połączeniu ze sobą, aby zaoferować obiecujące rozwiązanie do dostrajania wydajności LightR w celu optymalizacji jego zastosowania dla konkretnego eksperymentu.
Możliwość zastosowania enzymów LightR zależy od ich zdolności do naśladowania funkcji biologicznych ich endogennych odpowiedników. W związku z tym bardzo ważne jest, aby ocenić ich specyficzność substratową, sygnalizację w dół i lokalizację subkomórkową. Specyficzność aktywności LightR-Src potwierdza się poprzez fosforylację substratów Src, w tym paxilliny i p130Cas22,23. FastLightR-Src przemieszcza się między obszarem okołojądrowym a ogniskowymi zrostami pod wpływem cyklicznego oświetlenia, powodując rozprzestrzenianie się komórek. Takie zjawisko z powodzeniem przypomina wcześniejsze obserwacje wykonane za pomocą natywnej kinazy Src i dodatkowo potwierdza skuteczność obecnego narzędzia w badaniu biologii Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf wykazuje również swoistość w celowaniu w kompleksy sygnałowe, takie jak kinazy MEK i ERK24,25. Dodatkowo, FastLightR-bRaf wykazuje cykliczne oscylacje wahadłowca jądrowego ERK w odpowiedzi na niebieskie światło, co jest znaną konsekwencją aktywacji bRaf28. Zdolność enzymów LightR do ścisłego naśladowania funkcji białek endogennych stanowi nieocenione narzędzie do badania ich funkcji.
Powyższa dyskusja przedstawia zdolność kinaz LightR do replikacji precyzyjnych szlaków sygnalizacji komórkowej w określonych przedziałach komórkowych. Zgodnie z takim sukcesem kinaz, LightR-Cre służy jako model ilustracyjny demonstrujący funkcjonalność oryginalnej rekombinazy Cre pochodzącej z bakteriofaga P1. Rekombinaza Cre należy do rodziny integraz rekombinaz specyficznych dla miejsca i działa poprzez ułatwianie rekombinacji między dwoma miejscami rozpoznawania zwanymi loxP na docelowym DNA. Taka rekombinacja powoduje rearanżację DNA poprzez zdarzenie crossover. W oparciu o kierunkową orientację miejsca loxP na docelowym DNA, zdarzenie skrzyżowania może prowadzić do delecji, duplikacji lub translokacji elementów chromosomowych48. Rekombinaza Cre jest szeroko stosowana do generowania modeli in vivo indukowalnej regulacji genów49,50. Jednak inne spontaniczne, chemicznie indukowane lub optogenetycznie indukowane systemy rekombinazy cre zapewniają ograniczoną kontrolę nad tym, kiedy i gdzie rekombinacja DNA jest indukowana w modelu zwierzęcym. LightR-Cre pokonuje te ograniczenia, umożliwiając ścisłą czasową i przestrzenną kontrolę rekombinacji DNA. Co więcej, możliwość przestrajania LightR pozwala nam wyeliminować niepożądaną nieszczelność i zapewnić regulację Cre z wysoką precyzją. Możliwości te otwierają nowe możliwości w zakresie modelowania patologii chorób i opracowywania nowych metod leczenia.
Precyzyjna regulacja LightR w kinazach i rekombinacji DNA stanowi kolejny dowód na to, że narzędzie to można zastosować do kilku białek przy użyciu tej samej strategii. Oprócz aktywacji różnych klas enzymów, LightR może być potencjalnie przyłączany do innych typów białek, gdzie modulacja allosteryczna może być wykorzystana do lokalizacji białek w określonych regionach subkomórkowych, indukowania interakcji białko-białko, inżynierii biosensorów indukowanych niebieskim światłem i nie tylko. Ze względu na allosteryczne zalety celowania w specyficzną domenę, LightRs można również łączyć z innymi podejściami chemogenetycznymi i optogenetycznymi w tym samym białku, aby osiągnąć wyższy stopień przestrajania do badania procesów biologicznych.
Z powodzeniem zastosowaliśmy LightR do wielu innych białek (manuskrypty w przygotowaniu). Pomimo tego sukcesu, opracowanie funkcjonalnego białka LightR może napotkać potencjalne wyzwania, szczególnie w zakresie wyboru odpowiedniego miejsca insercji i dokładnego naśladowania funkcji biologicznej białka docelowego. Gdy struktura krystaliczna jest niedostępna, naukowcy muszą polegać na przewidywanych strukturach lub informacjach o sekwencji aminokwasów, co wymaga dalszych działań związanych z rozwiązywaniem problemów w celu inżynierii białek z wieloma miejscami insercji lub podstawieniami aminokwasów. Ponadto zmodyfikowana aktywność białka musi być precyzyjnie dostrojona, aby dokładnie odtworzyć funkcję biologiczną w komórce. Powodzenie tych eksperymentów zależy od precyzyjnej funkcjonalnej mimikry zmodyfikowanego białka, z jego endogennym homologiem, który często wymaga rygorystycznego rozwiązywania problemów i może się różnić w zależności od typu komórki, klasy białka docelowego i typu, a także siły i czasu trwania aktywacji światła niebieskiego.
Podsumowując, system LightR stanowi potężne narzędzie do osiągnięcia precyzyjnej czasoprzestrzennej kontroli nad funkcją białek. Jego solidność, możliwość przestrajania i wszechstronność sprawiają, że jest nieoceniony w badaniu złożonych procesów komórkowych, odkrywaniu szlaków sygnałowych i wyjaśnianiu mechanizmów regulacji genów. Zapewniając naukowcom bezprecedensową kontrolę nad aktywnością białek, system LightR może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat podstawowych procesów biologicznych i utorowania drogi dla innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Zdolność komórki do interpretowania sygnałów zewnętrznych i przekształcania ich w określone reakcje w kontekstach fizjologicznych lub patologicznych jest kierowana przez dedykowane grupy białek. Udział dowolnego białka w takich złożonych reakcjach jest często definiowany przez jego subkomórkową lokalizację, poziom ekspresji i czas przejściowej, trwałej lub oscylacyjnej aktywacji. Analiza roli tych indywidualnych parametrów w regulacji sygnalizacji wymaga metod zdolnych do odtworzenia skomplikowanej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek na poziomie subkomórkowym. Tradycyjne techniki, takie jak manipulacje genetyczne i inhibitory małocząsteczkowe, nie spełniają oczekiwań pod tym względem. Natomiast techniki optogenetyczne obiecują potencjał w zakresie analizy procesów biologicznych poprzez manipulowanie lub naśladowanie procesów fizjologicznych i patologicznych. Jednak obecne narzędzia często nie mają szerokiego zastosowania ani kontroli subkomórkowej. Kilka istniejących strategii zapewnia ścisłą regulację lokalizacji i interakcji białek; ale nie mają bezpośredniej kontroli nad aktywnością enzymatyczną1,2,3,4. Inne umożliwiają regulację aktywności enzymatycznej, ale mogą nie mieć kontroli subkomórkowej lub mają ograniczoną przydatność w różnych klasach enzymów5,6,7,8,9. W tym dokumencie dotyczącym protokołu opisujemy nowatorską metodę inżynierii białek, która łączy zalety optogenetyki w jednym narzędziu: ścisłą regulację czasową, przestrajalną kinetykę, kontrolę subkomórkową i szerokie zastosowanie enzymów10. Zaprojektowaliśmy domenę regulowaną światłem (LightR), która działa jak przełącznik allosteryczny po wprowadzeniu do docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Strategia ta umożliwia ścisłą czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji i dezaktywacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w żywych komórkach.
Tutaj omówiono projekt i strategię zastosowania narzędzia optogenetycznego LightR w kilku klasach enzymów. Badanie to oferuje krok po kroku protokół opracowania, scharakteryzowania i zastosowania regulowanej światłem kinazy tyrozynowej Src (LightR-Src). Badanie dodatkowo demonstruje możliwość przestrajania kinetyki inaktywacji przełącznika LightR. Wolno dezaktywujący się przełącznik LightR może utrzymywać aktywność enzymów przy zmniejszonej częstotliwości oświetlenia, podczas gdy wersja z szybką jazdą na rowerze, FastLightR, wymaga częstszego podświetlania do aktywacji, ale wykazuje szybką dezaktywację, gdy oświetlenie jest wyłączone. Aktywacja/inaktywacja FastLightR-Src w żywych komórkach indukuje cykle rozprzestrzeniania się i wycofywania komórek. Rozprzestrzenianie się komórek indukowane przez FastLightR-Src zgadza się z fizjologiczną rolą kinazy Src11,12. Ze względu na szybką kinetykę inaktywacji, FastLightR-Src może być również regulowany na poziomie subkomórkowym, co powoduje stymulację lokalnych wypukłości i polaryzację komórek. Aby zademonstrować możliwość zastosowania narzędzia LightR do innych typów enzymów, pokrótce przeprowadzimy czytelników przez podobny sukces z zmodyfikowaną kinazą bRaf regulowaną światłem (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) i specyficzną dla miejsca rekombinazą DNA Cre (LightR-Cre). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat złożonych szlaków sygnałowych kształtujących patofizjologię różnych chorób.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Szkiełka nakrywkowe szklane 25 mm okrągłe</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml&nbsp;</td><td>Amerykański Naukowiec&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Bufor</td><td></td><td></td> Laemmli <td>Na 500 ml: 5,18 g&nbsp; Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Mikroskop Lampa pierścieniowa</td><td>Boli Optyka</td><td>ML46241324</td><td>Niebieska dioda LED, średnica 60 mm, 5 W</td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Erk 1/2</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>anty-MEK</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anty-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>anty-paksyliny</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anty-phospho-erk 1/2 T202 / Y204</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> przeciwciała <td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anty-fosfo-pY249 Sygnalizacja komórkowa p130Cas</td><td></td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anty-fosfo-Y118</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> Paxillin <td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Anto-phospho-S217/221 Komórka MEK</td><td> Sygnalizacja</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz kompatybilny z Arduino</td><td>Komputer korporacyjny</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3</td><td>Arduino</td><td>&lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Komora komórkowa Attofluor</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Wzorcowa płodowa surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Inaktywowany termicznie potrójny 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowane&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>Prezent od dr Johna O'Bryana, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Disodium)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Deep Red barwnik błony plazmatycznej</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentne komórki DH5a&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Drabina DNA&nbsp;</td><td>GoldBio&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Enzym DPN1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Odczynniki Clelanda&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Żel Zielony barwnik kwasu nukleinowego&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik w żelu fioletowy 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Ogniwa HEK 293T&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Przekaźnik IoT</td><td>Rejestratory cyfrowe</td><td>DLI 705020645490</td><td>Przekaźnik sterujący AC/DC do oświetlenia</td></tr><tr><td>Monosiarczan Kanamycyny Złoto</td><td>Biotechnologia</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED Grow Light System</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>System lamp panelowych LED&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>Oprogramowanie do uruchamiania skryptów CellGEO</td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td> do <td>analizy obrazowania</td>urządzeń <td>molekularnych</td><td>Metamorph</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Zestaw M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep&nbsp;</td><td>Wybór genów&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykowane żele Mini-PROTEAN TGX 12 dołków</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Klasa biologii molekularnej Woda&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wielopasmowe lustro polichroiczne</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS bez Ca i Mg&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Prezent od laboratorium dr Channinga Dera,</td></tr><tr><td>probówki UNC PCR&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski indywidualnie mocowane kołpaki kopułkowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus Polimeraza DNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Wielokąt 400 Wzorzysty oświetlacz</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady&nbsp;</td>Membrany <td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Filter Paper Kanapki&nbsp;</td></tr><tr><td>T0,25% Trypsyna, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] korzennik sodu</td><td>&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-octan-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Do elektroforezy&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x Mikroskop Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Box</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>Do interfejsu TTL</td></tr> <tr><td>i beta;-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Optogenetyka oferuje możliwość naśladowania złożonej czasoprzestrzennej kontroli aktywności enzymów aż do rozdzielczości subkomórkowej. Jednak większość podejść optogenetycznych często napotyka poważne wyzwania związane z integracją wielu możliwości w jednym narzędziu, które ma zastosowanie do szerokiego zakresu białek docelowych. Osiągnięcie precyzyjnej kontroli nad kinetyką włączania/wyłączania, zapewnienie minimalnej nieszczelności w ciemności i wykazanie wydajnej wydajności w komórkach ssaków z subkomórkową precyzją to tylko niektóre z najczęstszych wyzwań napotykanych w tej dziedzinie. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie racjonalnie zaprojektowanych domen światłoczułych do allosterycznej kontroli aktywności białek. Korzystając z tej strategii, opracowaliśmy metodę optogenetyczną łączącą wszystkie pożądane cechy. Podejście to polega na włączeniu regulowanego światłem modułu przełącznika allosterycznego (LightR) do białka docelowego w celu regulacji aktywności enzymu za pomocą światła niebieskiego (465 nm). Domena LightR jest generowana przez połączenie dwóch domen fotoreceptorów Vivid (VVD), tworząc światłoczuły zacisk, który można włączyć do małej elastycznej pętli w domenie katalitycznej enzymu. W stanie ciemnym zacisk LightR jest otwarty, zniekształcając w ten sposób domenę katalityczną enzymu i dezaktywując ją. Po wystawieniu na działanie światła niebieskiego domena LightR zamyka się i przywraca strukturę domeny katalitycznej oraz aktywność enzymatyczną. W tym manuskrypcie omawiamy strategie projektowania w celu wygenerowania kinazy białkowej regulowanej światłem i wykazania jej kontroli za pomocą światła niebieskiego, odwracalności, kinetyki i precyzyjnej regulacji na poziomie subkomórkowym, umożliwiając ścisłą precyzję czasoprzestrzenną. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, prezentujemy protokół skutecznej regulacji aktywności kinazy LightR-Src. Wykazaliśmy również możliwość zastosowania LightR w różnych klasach enzymów, zwiększając użyteczność systemu narzędzi w rozwiązywaniu mechanistycznych problemów szlaków sygnałowych w różnych chorobach.

LightR-Src został zaprojektowany i wytworzony zgodnie ze strategią opisaną na Ryc. 1A,B. Analiza biochemiczna LightR-Src obejmuje badanie fosforylacji znanych endogennych substratów Src, p130Cas (Y249)22 oraz paxylliny (Y118)23 w odpowiedzi na światło niebieskie przy 60 min ciągłego naświetlania (Ryc. 2B). Co istotne, nie obserwuje się tła aktywacji kinazy Src, gdy LightR-Src jest ekspresowany wyłącznie w ciemności przez 16-18 h po transfekcji. Ponadto katalitycznie nieaktywny mutant LightR-Src z mutacją D388R nie indukuje fosforylacji substratu Src, co dowodzi, że fosforylacja jest przeprowadzana przez aktywny LightR-Src, a nie jest spowodowana nieswoistym efektem naświetlania światłem niebieskim (Ryc. 2B). Uwzględniając doniesienia o oscylacyjnej aktywności kinazy Src27 w żywych komórkach, zbadaliśmy, czy LightR-Src można dostroić tak, aby wykazywał cykliczną aktywację. Pierwotny LightR-Src wykazywał wolną kinetykę dezaktywacji (Ryc. 2C), co skłoniło do stworzenia nowego wariantu, Fast-LightR-Src, posiadającego mutację I85V w obu domenach VVD. Ryc. 2D ilustruje, że Fast-LightR-Src wykazuje wyraźnie szybszą kinetykę dezaktywacji i ulega całkowitej inaktywacji w ciągu 10 min po wyłączeniu światła, w porównaniu do ponad godziny w przypadku LightR-Src. Dzięki zastosowaniu Fast-LightR-Src byliśmy również w stanie osiągnąć powtarzalne cykle aktywacji/inaktywacji (Ryc. 2E). Wyniki te wspólnie demonstrują zdolność narzędzia LightR do specyficznej i ściśle kontrolowanej regulacji aktywności Src w żywych komórkach.
Zastosowanie FastLightR-Src pozwala również na ocenę wpływu przejściowej aktywacji Src na morfodynamikę komórek. Aktywacja FastLightR-Src w komórkach HeLa indukuje rozprzestrzenianie się komórek, a proces ten ustaje natychmiast po dezaktywacji FastLightR-Src. Po aktywacji zaobserwowano translokację FastLightR-Src z obszaru okołojądrowego do adhezji ogniskowych i błony komórkowej, co jest zachowaniem charakterystycznym dla kinazy Src typu dzikiego11,12. Naświetlanie komórek wykazujących nieaktywny katalitycznie mutant D388RLightR-Src nie wywołuje takich efektów rozprzestrzeniania (Rycyna 3B,C). Potwierdza to ponadto, że FastLightR-Src funkcjonuje podobnie jak jego odpowiednik typu dzikiego. Lokalna iluminacja regionu komórki prowadzi do zlokalizowanej aktywacji FastLightR-Src, objawiającej się lokalną akumulacją LightR Src w adhezjach ogniskowych, której towarzyszy tworzenie lokalnych wypustek błony (Rycina 4B (i), (ii)) oraz przesunięcie centroidu komórki (Rycina 4C (i), (ii)), co skutkuje ruchem komórki w stronę światła. Po ustaleniu możliwości zastosowania narzędzia LightR do regulacji kinazy Src, prezentujemy szerokie zastosowanie LightR rozszerzone na regulację kinazy bRaf oraz rekombinazy DNA Cre. Analiza LightR-bRaf wykazuje indukowaną światłem fosforylację endogennego substratu bRaf, MEK1, oraz następczą fosforylację kinaz ERK1/224,25 na poziomach porównywalnych z poziomami konstytutywnie aktywnego mutanta bRaf (V600E) (Rycina 5A). Z kolei nieaktywny katalitycznie D575RLightR-bRaf nie wykazuje fosforylacji MEK1 i ERK1/2, co jest porównywalne z nieoświetlonymi próbkami LightR-bRaf, potwierdzając tym samym specyficzność regulacji LightR-bRaf. Obrazowanie żywych komórek wykazało, że powtarzające się cykle aktywacji/dezaktywacji FastLightR-bRaf indukują powtarzającą się translokację ERK2 do jądra i z jądra, co jest zgodne ze znanymi efektami aktywacji bRaf28 (Rycina 5B). Aktywacja LightR-Cre skutkuje pomyślną rekombinacją genu reporterowego mCherry, co demonstruje przydatność LightR w odniesieniu do różnych klas enzymów (Rycina 5C).
<img alt="Schematy oddziaływań białkowych i metoda syntezy megaprimerów w mutogenezie miejscowej DNA aktywowanej światłem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Strategia opracowania podejścia LightR. (A) Struktury krystaliczne dwóch monomerów Vivid w stanie ciemnym (PDB: 2PD7) oraz dimeru w stanie naświetlonym (PDB: 3RH8). (B) Schematyczne przedstawienie konstrukcji LightR. Dwa połączone tandemowo fotoreceptory VVD wstawione w domenę katalityczną zaburzają aktywność katalityczną białka w ciemności. Dimeryzacja VVD w odpowiedzi na światło niebieskie przywraca aktywność białka. (C) Struktury krystaliczne domen katalitycznych (i) Src (PDB 1Y57) oraz (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Struktura rekombinazy Cre (PDB 1MA7). Żółte strzałki wskazują miejsce wstawienia LightR oraz zastąpione aminokwasy. (D) Schemat strategii klonowania w celu wstawienia domeny LightR do sekwencji docelowego enzymu19. W kroku 1 specjalnie zaprojektowane primery są wykorzystywane do syntezy PCR fragmentu LightR flankowanego sekwencjami hybrydyzującymi z genem docelowym przed i po miejscu wstawienia. W kroku 2 tak otrzymany fragment LightR jest wykorzystywany jako „megaprimer” do wstawienia LightR do genu docelowego enzymu za pomocą ukierunkowanej mutogenezy miejscowej metodą Quick change. Panele A-C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya i wsp.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Optogenetyczna aktywacja i analiza Src; schemat, wyniki western blot; fosforylacja białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka biochemiczna zmodyfikowanych białek LightR. (A) Schematyczna reprezentacja protokołu eksperymentalnego dla charakterystyki biochemicznej LightR Src. (B) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne konstrukt LightR Src z mCherry i znacznikiem myc na C-końcu były naświetlane światłem niebieskim przez 60 min przy użyciu układu LED 465 nm. W lizatach komórkowych badano fosforylację substratów Src: paxylliny i p130Cas. Wyniki Western Blot wykazują fosforylację endogennej paxylliny i p130Cas w odpowiedzi na aktywację LightR-Src w żywych komórkach. (C,D) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne wskazanych konstruktów LightR-Src z tandemowym znacznikiem mCherry-myc na C-końcu były stale naświetlane światłem niebieskim przez określony czas (0 min i 30 min), a następnie pozostawione w ciemności na wskazane okresy. W lizatach komórkowych badano fosforylację substratów Src, co pokazuje porównanie kinetyki aktywacji i dezaktywacji pomiędzy (C) LightR-Src a (D) FastLightR-Src. (E) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne wskazanych konstruktów LightR-Src z tandemowym znacznikiem mCherry-myc na C-końcu były stale naświetlane światłem niebieskim przez 20 min, po czym następowała powtarzalna inkubacja w ciemności przez 10 min i w świetle przez 20 min. Zebrano lizaty komórkowe i zbadano fosforylację substratów Src, wykazując efektywność cyklowania kinazy Src pomiędzy stanami aktywacji i inaktywacji. Wszystkie eksperymenty powtórzono co najmniej trzy razy, uzyskując podobne wyniki. Liczby wyświetlane obok paneli western blot B-E reprezentują masy cząsteczkowe białek mierzone w kilodaltonach (kDa). Panele B-E zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zachowanie komórek pod wpływem niebieskiego światła; mikroskopia i wykresy statystyczne; konfiguracja analizy fotoaktywacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Globalna i czasowa kontrola oświetlenia oraz jej wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Schematyczna reprezentacja planu eksperymentalnego dotyczącego globalnego i czasowego cyklicznego oświetlania oraz późniejszych analiz danych. (B,C) Regulacja morfologii komórek i lokalizacji FastLightR-Src przez niebieskie światło przedstawiona jest na reprezentatywnych obrazach komórek HeLa uzyskanych z serii time-lapse przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki te przejściowo koeksprymowały FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 komórek) lub katalitycznie nieaktywny D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 komórek) wraz ze Stargazin-iRFP670 (marker błony plazmatycznej). Obrazowanie żywych komórek przeprowadzano w każdej minucie, podczas gdy komórki były globalnie oświetlane niebieskim światłem (niebieskie obramowania). (B) Żółte strzałki wskazują lokalizację FastLightR-Src w strukturach przypominających adhezje ogniskowe. Obrazy uzyskano z serii time-lapse komórek HeLa przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. (C) Ilościowa ocena zmian powierzchni komórek wywołanych aktywacją FastLightR-Src w porównaniu do D388RLightR-Src jest przedstawiona na każdym panelu. Okno oświetlenia zaznaczono niebieskimi prostokątami. Wykresy przedstawiają średnią ± 90% przedziały ufności. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda oświetlenia subkomórkowego przy użyciu światła niebieskiego w migracji komórek; schemat z wynikami analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Lokalna kontrola oświetlenia subkomórkowego i jej wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego lokalnej kontroli oświetlenia subkomórkowego. (B) (i) Sekwencja time-lapse ilustrująca komórkę HeLa wykazującą ekspresję FastLightR-Src-mCherry, lokalnie oświetloną światłem niebieskim (oznaczonym niebieskim okręgiem). Obrazy były rejestrowane w odstępach jednej minuty przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (obiektyw 60x). Obrazy przedstawiono jako obrazy o odwróconym kontraście, uzyskane w określonych odstępach czasu. (ii) Obrazy projekcyjne komórek wyświetlające wypustki utworzone w określonych odstępach czasu. Progowanie i maskowanie morfologii komórki w czasie trwania eksperymentu stanowi platformę do analizy rozprzestrzeniania się komórek i dynamiki ich krawędzi. Wyznaczony oświetlony obszar komórki jest obramowany niebieskim okręgiem. (C) (i) Wykres polarny dla komórek przedstawiający dystans migracji centroidu (d) oraz kąt odchylenia (θ) względem lokalnego oświetlenia światłem niebieskim. Czarne kropki reprezentują poszczególne komórki HeLa wykazujące ekspresję katalitycznie nieaktywnego D388RLightR-Src (N = 6 komórek) lub FastLightR-Src (N = 10 komórek). (ii) Schematyczne przedstawienie dystansu przesunięcia centroidu (d) przebytego przez centroid komórki od rozpoczęcia (1) do zakończenia (2) lokalnej stymulacji światłem niebieskim. Kąt odchylenia (θ) wskazuje stopień dywergencji ruchu centroidu komórki od miejsca naświetlania światłem niebieskim. Jasnoszare cieniowanie wskazuje obszar wypustki utworzonej przez komórkę w odpowiedzi na lokalną stymulację FastLightR-Src. Wyznaczony oświetlony obszar komórki jest wskazany pełnym niebieskim okręgiem. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane na podstawie pracy Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Aktywacja mCherry-ERK2 indukowana światłem niebieskim; Western blot, mikroskopia, odpowiedź komórkowa w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Szerokie zastosowanie podejścia LightR. (A) Regulacja LightR-bRaf. Komórki LinXE przejściowo wyrażające LightR-bRaf-Venus, katalitycznie nieaktywny D575R LightR-bRaf Venus lub konstytutywnie aktywny bRaf (V600E)-Venus poddano ciągłemu naświetlaniu światłem niebieskim przez określony czas. W lizatach komórkowych badano fosforylację wskazanych białek. (B) Reprezentatywne obrazy uzyskane z serii time-lapse obrazowania żywych komórek z użyciem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej ilustrują regulację globalnej odpowiedzi na światło niebieskie w komórkach LinXE przejściowo ko-ekspresujących FastLightR-bRaf-Venus i mCherry-ERK2. Komórki te naświetlano globalnie światłem niebieskim (impulsy 50 ms co sekundę, 50 impulsów na minutę) przez określone przedziały czasu zaznaczone na niebiesko. Obrazowanie żywych komórek dla mCherry-ERK2 przeprowadzano co minutę. Żółte strzałki wskazują etapy lokalizacji jądrowej ERK2 indukowanej aktywacją zmodyfikowanego bRaf światłem niebieskim. (C) Komórki LinXE poddano przejściowej ko-transfekcji reporterem Floxed-stop-mCherry oraz LightR-Cre-iRFP670. Komórki utrzymywano w ciemności lub poddawano impulsowemu naświetlaniu światłem niebieskim (2 s włączone, 10 s wyłączone) przez maksymalnie 8 h. Obrazy dla wszystkich punktów czasowych każdego kanału pozyskano za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 10x) przy identycznych ustawieniach i dostosowano do spójnych poziomów jasności i kontrastu, aby ułatwić porównanie poziomów ekspresji białek między próbkami. Eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy, uzyskując podobne wyniki. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Opis miejsc insercji LightR oraz lista kontrolna projektowania białek LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Primery do klonowania LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Warunki transfekcji dla analizy biochemicznej aktywności białek LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 5: Warunki transfekcji dla analizy aktywności białek LightR w oparciu o obrazowanie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Oświetlenie impulsowe z wykorzystaniem zintegrowanego środowiska programistycznego (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Ustawienia oświetlenia mikroskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

Nasze ogólne badania koncentrują się na opracowaniu metod optogenetycznych, które zapewniają precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywności białek przez światło. Projektujemy regulowane światłem domeny zwane lightR do regulacji allosterycznej, co pozwala nam badać, w jaki sposób czasowo kontrolowana aktywność białek wpływa na sygnalizację komórkową i funkcje, pomagając w przedklinicznym modelowaniu chorób i opracowywaniu terapii. Optogenetyka stoi przed kilkoma wyzwaniami, w tym osiągnięciem precyzyjnej i odwracalnej kontroli aktywności białka docelowego oraz dokładnym naśladowaniem endogennej kinetyki sygnalizacji.Kluczowymi kwestiami są zapobieganie niepożądanej aktywacji, umożliwienie ukierunkowanej aktywacji subkomórkowej i zarządzanie fototoksycznością w celu zachowania żywotności komórek. Ponadto opracowanie uniwersalnie kompatybilnych i wytrzymałych narzędzi ma kluczowe znaczenie dla poprawy wszechstronności i powtarzalności w zastosowaniach. Nasz protokół do inżynierii narzędzi lightR w unikalny sposób łączy wiele zaawansowanych funkcji w jeden system, w tym regulację allosteryczną, wysoką czułość, rozdzielczość przestrzenną, ścisłą kontrolę czasową i precyzyjną specyfikę sygnalizacji.Ta integracja pozwala na przestrajanie różnych białek docelowych, wypełniając luki w innych metodach, które mogą nie mieć jednej lub więcej z tych krytycznych zdolności. Jesteśmy zainteresowani zdefiniowaniem kluczowych procesów sygnalizacyjnych i strukturalnych regulujących migrację komórek. Naszym celem jest wykorzystanie naszej technologii optogenetycznej do analizy regulacji migracji i interakcji komórek śródbłonka.Zrozumienie, w jaki sposób komórki śródbłonka pośredniczą w przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej i określenie, w jaki sposób rozregulowanie tych procesów przyczynia się do rozwoju choroby. Do analizy biochemicznej kinaz lightR płytka jeden razy 10 do mocy sześciu komórek lin XE na 3,5-centymetrową miskę do hodowli komórek dla każdej grupy eksperymentalnej, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 16 do 18 godzin. Następnego dnia należy przetransfekować komórki wybranym konstruktem DNA za pomocą odpowiedniego odczynnika do transfekcji.Przykryj naczynie folią aluminiową i włóż je z powrotem do inkubatora. Po 16 do 18 godzinach transfekcji umieść system lamp panelowych LED o długości 465 nanometrów w inkubatorze do hodowli tkankowych. Umieść perforowany panel z pleksiglasu 10 centymetrów nad lampą, aby uzyskać oświetlenie o mocy trzech miliwatów na centymetr kwadratowy.Użyj ciągłego oświetlenia w komórkach wyrażających LightR-Src i D388 R-LightR-Src. Włączaj i wyłączaj panel LED ręcznie, aby sterować oświetleniem. Pod koniec eksperymentalnych punktów czasowych zbierz komórki pod bezpiecznym czerwonym światłem, odessaj pożywkę i umyj komórki zimnym PBS.Globalne oświetlenie komórek lin XE za pomocą zmodyfikowanego LightR-Src przez 60 minut wykazało fosforylację substratów Src, endogennej paxilliny i komórek p130Cas eksprymujących katalitycznie nieaktywny mutant D388 RLightR-Src nie wykazuje fosforylacji substratów Src przy globalnym oświetleniu. Na początek podaj dwa razy 10 do potęgi pięciu komórek hela na 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej w pożywce do hodowli komórkowych. Inkubuj komórki przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Gdy komórki połączą się i osiągną 60 do 70% zbieżności, należy przetransfekować komórki hella za pomocą podanej mieszanki. Przykryj naczynie folią aluminiową, aby zapobiec przypadkowemu oświetleniu komórek. Następnie inkubuj komórki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnie umieść zakryte szklanki o średnicy 25 milimetrów i grubości 0,17 milimetra w komorze z sześciodołkową płytką. Pokryj trzy okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe pięcioma miligramami fibronektyny na litr w PBS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnie spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 16 do 18 godzin po transfekcji.Zbierz transfekowane komórki hela w bezpiecznym, czerwonym świetle, a następnie zagraj około 1 razy 10 do potęgi pięciu transfekowanych komórek hela na każdym szkiełku nakrywkowym w bezpiecznym, czerwonym świetle. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w pożywce do hodowli komórkowych przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie należy podgrzać przygotowane podłoża obrazowe i olej mineralny do temperatury 37 stopni Celsjusza.Następnie dwukrotnie umyj szkiełka nakrywkowe zawierające komórki PBS. Po wybarwieniu i umyciu komórek ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania żywych komórek. Dodaj jeden mililitr pożywki obrazowej L15 do komory.Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do podłoża, aby zapobiec parowaniu podczas obrazowania. Trzymaj komorę przed światłem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do obrazowania. Umieść komorę na stoliku mikroskopowym nagrzanym do 37 stopni Celsjusza.Wybierz pojedynczą komórkę wyrażającą zarówno szybką wiśnię LightR-Src, jak i Src IRFP. Zaznacz określone obszary zainteresowania w komórce, które chcesz oświetlić. Do tego badania wybierz mały obszar na obrzeżach wybranej komórki.Obrazuj wybraną komórkę co minutę przez 20 minut w stanie podstawowym przed oświetleniem. Kontynuuj obrazowanie przez 50 minut, oświetlając miejscowo, a następnie 20 minut po aktywacji, co daje łącznie 90 minut. Po zobrazowaniu zapisz filmy w formacie pliku stosu tif do analizy.Globalne oświetlenie komórek hela doprowadziło do lokalizacji szybkiego LightR-Src do zrostów ogniskowych, które uległy odwróceniu po wyłączeniu niebieskiego światła. To oświetlenie spowodowało również znaczny wzrost rozprzestrzeniania się komórek, które ustało po wyłączeniu niebieskiego światła. Katalitycznie nieaktywny mutant D388 R-LightR-Src nie wykazywał rozsiewu komórek.Miejscowe oświetlenie komórek hela wykazujących szybką ekspresję LightR-Src spowodowało akumulację konstruktu w zrostach ogniskowych, co doprowadziło do miejscowych wypukłości błony przy 50-minutowym naświetleniu. Nie zaobserwowano dalszego przyrostu obszaru w ciemnościach po 20 minutach po oświetleniu. Fast LightR-Src stopniowo znikał z zrostów ogniskowych w ciemnej fazie.Środek ciężkości komórki przesunął się w kierunku oświetlonego obszaru. Po szybkiej aktywacji LightR-Src, wskazującej na ukierunkowany ruch komórki.

spatiotemporal-control-protein-activity-through-optogenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół przedstawia kroki do wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do przeprowadzenia wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych u drożdży.

Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro

W niniejszym filmie zaprezentowano technikę wycięcia i usunięcia grasicy płodowej, a także przygotowanie kultur ex vivo grasicy traktowanej 2-dGuo. <br...

Przygotowanie hodowli organowych grasicy traktowanych 2-dGuo

Poznaj metody optogenetyczne umożliwiające precyzyjną kontrolę aktywności białek za pomocą światła. Wykorzystaj narzędzie LightR do badania dynamiki sygnałowania komórkowego i migracji komórek HeLa.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Przeglądaj więcej filmów