Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Rola poszczególnych genów w wystąpieniu i rozwoju zakrzepicy, w tym przypadku badamy śródbłonkową ekspresję PAR1 na uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Staramy się określić wpływ śródbłonka na odpowiedź, zarówno po niedokrwieniu, jak i w trakcie reperfuzji. Naprawdę ważnym aspektem, który do tej pory był niedostatecznie zbadany, jest określenie roli komensalów jelitowych w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki.

Aby zbadać tę kwestię, nasza grupa połączyła mikroskopię przyżyciową z modelem uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki, a następnie połączyliśmy to z wolnymi od zarazków modelami myszy. Zastosowanie modeli zakrzepicy u myszy transgenicznych w połączeniu z mikroskopią przyżyciową, takie technologie umożliwiają obserwację in vivo zachowań komórkowych podczas wystąpienia choroby. Wykonywanie modeli eksperymentalnych na organizmach żywych jest zawsze wyzwaniem, ponieważ na eksperyment wpływa wiele czynników, w tym płeć, wiek, znieczulenie, leczenie, zmiany w przepisach dotyczących dobrostanu zwierząt i tak dalej.

Również badania nad zakrzepicą rozpoczęły się w ubiegłym wieku. Wiele czynników, które się do tego przyczyniły, pozostaje nadal nierozwiązanych. Moja grupa bada rolę mikrobioty jelitowej w zakrzepicy, miażdżycy, funkcji płytek krwi i unaczynieniu.

Na początek umieść znieczuloną, ogoloną mysz w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce grzewczej. Podłącz mysz do systemu tlenowego za pomocą stożka nosowego. Przymocuj kończyny myszy do podgrzewanej podkładki za pomocą taśmy chirurgicznej.

W celu implantacji cewnika w żyle szyjnej należy wykonać poprzeczne nacięcie nad tchawicą. Usuń skórę pokrywającą szyję i odizoluj prawą żyłę szyjną. Następnie za pomocą pięciocentymetrowej jedwabnej nici zamknij dystalny koniec żyły i przymocuj go kleszczami chirurgicznymi.

Umieść trzy jedwabne nici około dwóch centymetrów poniżej żyły, jedną w pobliżu dystalnego końca i dwie w pobliżu bliższego końca żyły szyjnej. Zawiąż węzeł chirurgiczny, ale nie zamykaj naczynia. Napełnij cewnik polietylenowy 0,9% chlorkiem sodu.

Usuń pęcherzyki powietrza i podłącz go do jednomililitrowej strzykawki. Za pomocą nożyczek wytnij otwór między drugim a trzecim węzłem i wszczepij cewnik do żyły szyjnej. Odessać strzykawkę, aby upewnić się, że w cewniku znajduje się krew.

Zawiąż jedwabną nić, aby zabezpieczyć cewnik w żyle. Następnie należy użyć taśmy medycznej, aby zabezpieczyć strzykawkę. Napełnij jedną mililitrową strzykawkę pomarańczą akrydynową o końcowym stężeniu 0,5 miligrama na mililitr i barwnikiem kwasu nukleinowego o stężeniu pięciu mikromolów.

Wstrzyknij 50 mikrolitrów SYTOX Orange na zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET. Zdezynfekuj skórę brzucha myszy za pomocą naprzemiennych rund peelingów na bazie jodu i alkoholu. Następnie za pomocą skalpela wykonaj laparotomię o długości od trzech do pięciu centymetrów wzdłuż liniowej alba.

Delikatnie wysuń jelito z jamy brzusznej za pomocą dwóch bawełnianych końcówek nasączonych solą fizjologiczną i zidentyfikuj miejsce z minimalnym pokryciem tłuszczem. Umieść małe gałęzie jelita na czarnym cieście, aby zmniejszyć sygnał tła. Wstrzyknij 50 mikrolitrów pomarańczy akrydynowej przez cewnik żyły szyjnej, aby uwidocznić wybarwione leukocyty.

Uzyskaj wideo jelita przed reperfuzją niedokrwienną. Przygotuj kompres zwilżony chlorkiem sodu i umieść w nim jelito. Zatkaj tętnicę krezkową górną za pomocą małego zacisku naczyniowego.

Delikatnie wepchnij jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną. Użyj szwu 7-0, aby zamknąć ścianę brzucha i zapobiec utracie wilgoci i temperatury. Po godzinie zdejmij szew.

Po okresie niedokrwienia nałóż kilka kropli soli fizjologicznej na przycięty obszar. Następnie delikatnie usuń klipsy mikronaczyniowe za pomocą aplikatora do klipsów. Za pomocą bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie ponownie wysuń jelito z jamy brzusznej i ułóż małe gałązki żyły na czarnym cieście.

Wstrzyknij 50 mikrolitrów pomarańczy akrydynowej i uchwyć wideo żyły po niedokrwieniu. Włącz szybki, szerokokątny mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kondensor dalekiego zasięgu, monochromator, obiektyw z 10-krotnym zanurzeniem w wodzie i kamerę urządzenia sprzężonego z ładunkiem. Ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i wybierz kanał 5B z zainstalowanymi filtrami Alexa Fluor 488 i Rhodamine Red, aby uwidocznić leukocyty i NET.

Określ ilościowo rekrutację komórek w obszarze zainteresowania o powierzchni 0,06 milimetra kwadratowego. Następnie określ ilościowo przylegające leukocyty, licząc komórki, które pozostały nieruchome lub przyczepione do wyściółki śródbłonka podczas 20-sekundowego okresu obserwacji. Zidentyfikuj NET znakowane zarówno leukocytami, jak i barwnikami fluorescencyjnymi kwasu nukleinowego.

Adhezja leukocytów do niedokrwiennego śródbłonka krezki zwiększyła się zarówno w grupach typu dzikiego, jak i F2r delta EC po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym, przy czym w grupie F2r delta EC zaobserwowano znacznie niższą adhezję, co sugeruje rolę śródbłonka PAR1 w rekrutacji leukocytów. Po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym NET obserwowano tylko w grupie typu dzikiego, w której wyrażano normalne poziomy PAR1 na komórkach śródbłonka, co wskazuje na regulacyjną rolę PAR1 w NETosis.