Name: Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj wizualizację pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Ta metoda pozwala obserwować zachowania komórkowe in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.R. dziękuje za dofinansowanie ze strony Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz i ReALity (projekt MORE), BMBF Cluster4Future CurATime (projekt MicrobAIome; 03ZU1202CA), Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) oraz Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) Fundusz Innowacji "Microbiome" (81X2210129). C.R. jest naukowcem w Niemieckim Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK). C.R. jest członkiem Centrum Translacyjnej Biologii Naczyniowej (CTVB), Centrum Badawcze Immunoterapii (FZI) oraz Potentialbereich EXPOHEALTH na Uniwersytecie Johannesa Gutenberga w Moguncji. C.R. jest członkiem Jednostki Badawczej DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. otrzymał stypendium w Gutenberg Research College na Uniwersytecie Johannesa Gutenberga w Moguncji. K.K. jest wspierana w ramach Programu Doskonałości DZHK "Promocja Kobiet-Naukowców" i jest członkiem Młodej DZHK. Z.G i O.D. są doktorantami w Szkole Badawczej Biomedycyny Translacyjnej w Moguncji (TransMed).

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez lokalny komitet ds. ustawodawstwa dotyczącego zwierząt (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Niemcy; G21-1-041). 6-8 tygodniowy samiec i suczka B6. Do badania wykorzystano myszy FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc. Specyficzna dla komórek śródbłonka regulacja F2r (PAR1) zachodzi za pośrednictwem promotora VE-Cadherin Cre 28. W tym badaniu flox-F2r x VE-Cadherin Cre + (F2RΔEC) wykazywał zmniejszoną ekspresję F2r (PAR1) na komórkach śródbłonka, a flox-F2r x VE-Kadheryna Cre- (WT) wyrażają normalne poziomy F2r śródbłonka (PAR1). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie do zabiegu
<ol>
	<li>Wysterylizuj niezbędne narzędzia chirurgiczne (bardzo wąskie nożyczki proste, kleszcze, zacisk naczyniowy itp.).</li>
	<li>Przygotuj system znieczulenia na bazie tlenu i izofluranu ze stożkiem nosowym i płytą grzewczą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zważ zwierzę.</li>
	<li>Wykonaj znieczulenie: Znieczulij myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) roztworu zawierającego midazolam (5 mg / kg), medetomidynę (0,5 mg / ml) i fentanyl (0,5 mg / kg) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
	<li>Usuń sierść z obszaru operacji szyi i brzucha za pomocą golarki elektrycznej dla małych zwierząt.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji grzbietowej na poduszce grzewczej i podłącz ją do systemu tlenowego za pomocą stożka nosowego. Przymocuj kończyny myszy do podgrzewanej podkładki za pomocą taśmy chirurgicznej. Upewnij się, że lateksowa membrana stożka nosa dobrze przylega do głowy myszy. Monitoruj temperaturę ciała zwierzęcia doodbytniczo za pomocą termometru specyficznego dla gryzoni</li>.
	<li>Nałóż krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy z obszaru chirurgicznego szyi i przetrzyj skórę obszaru operacyjnego 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj test szczypania palców u nóg (odruch pedałowania), aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Implantacja cewnika w żyle szyjnej
	<ol>
		<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie (~0,5 cm) nad tchawicą, usuń skórę pokrywającą szyję i odizoluj prawą żyłę szyjną.</li>
		<li>Użyj jedwabnej nici o długości około 5 cm, zamknij dystalny koniec żyły i przymocuj ją kleszczami chirurgicznymi. Umieść trzy jedwabne nici około 2 cm poniżej żyły: jedną blisko dystalnego końca i dwie blisko bliższego końca żyły szyjnej. Zawiąż węzeł chirurgiczny, ale nie zamykaj naczynia.</li>
		<li>Przygotować cewnik polietylenowy (0,28 mm ID, 0,61 mm OD) wypełniony 0,9% NaCl i zatkany strzykawką o pojemności 1 ml. Za pomocą nożyczek wytnij otwór między drugim a trzecim węzłem i wszczepij cewnik do żyły szyjnej. Odessać strzykawkę, aby upewnić się, że w cewniku znajduje się krew.</li>
		<li>Zamocuj cewnik w żyle, zawiązując jedwabną nić, upewniając się, że jest dobrze zamocowana. Użyj taśmy medycznej, aby zabezpieczyć strzykawkę.</li>
		<li>Przygotuj oranżę akrydynową: rozcieńczyć w stosunku 1:4 roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,5 mg/ml stężenie końcowe) w strzykawce o pojemności 1 ml. Trzymać strzykawkę w ciemności i wstrzyknąć 50 μl do myszy.</li>
		<li>Przygotować barwnik kwasu nukleinowego: rozcieńczyć w stosunku 1:1000 5 mM roztworu podstawowego sterylnym roztworem soli fizjologicznej (5 μM stężenie końcowe) w strzykawce o pojemności 1 ml. Trzymać strzykawkę w ciemności i wstrzyknąć 50 μl do myszy.</li>
		<li>Wstrzyknąć in vivo oranż akrydynowy (50 μg/μl, 50 μl na mysz) przez cewnik do żyły szyjnej, aby uwidocznić barwione leukocyty i zewnątrzkomórkowy barwnik fluorescencyjny DNA, podobnie jak w przypadku barwnikowych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) (5 μM, 50 μl na mysz). NET i leukocyty są obrazowane jednocześnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Model urazu krezki I/R
	<ol>
		<li>Zdezynfekuj skórę brzucha 70% etanolem.</li>
		<li>Wykonaj laparotomię 3-5 cm wzdłuż kresy białej za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Za pomocą dwóch bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie usuń jelito i zidentyfikuj miejsce o minimalnym pokryciu tłuszczem. Umieść gałęzie jelita cienkiego na czarnym cieście, aby zmniejszyć sygnał tła.</li>
		<li>Zdobądź filmy przed I/R (stan przed niedokrwieniem).</li>
		<li>Zrób kompres wilgoci za pomocą NaCl i umieść w nim jelito. Upewnij się, że jelito jest otoczone kompresem i utrzymuje wilgoć podczas kroku 5.6.</li>
		<li>Zatkaj tętnicę krezkową górną za pomocą małego zacisku naczyniowego.</li>
		<li>Delikatnie wepchnij jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną i użyj szwu 7-0, aby zamknąć ścianę brzucha, aby zapobiec utracie wilgoci i temperatury. Utrzymuj niedokrwienie przez 60 minut, sprawdzając znieczulenie co najmniej co 20 minut.</li>
		<li>Po 1 godzinie rozpocząć reperfuzję, zdejmując zacisk. 
		UWAGA: Prawidłowe wykonanie zabiegu niedokrwienia skutkuje widoczną zmianą. Początkowo dotknięty obszar będzie wyglądał na blady lub biały z powodu braku przepływu krwi. Po zdjęciu zacisku przepływ krwi będzie stopniowo wracał do obszaru niedokrwiennego, który odzyska swój normalny kolor, co oznacza udaną okluzję. Konieczne jest uważne obserwowanie myszy w sposób ciągły przez cały etap niedokrwienia.</li>
		<li>Po okresie niedokrwienia nałóż kilka kropli soli fizjologicznej na strzyżony obszar, a następnie delikatnie usuń klipsy mikronaczyniowe za pomocą aplikatora do klipsów.</li>
		<li>Za pomocą bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie usuń jelito, umieść małe gałęzie żyły na czarnym cieście, ponownie wstrzyknij 50 μl pomarańczy akrydynowej i uchwyć filmy z tą samą żyłą w tym samym miejscu (po niedokrwieniu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przywnętrzna, szybka mikroskopia epifluorescencyjna wideo
<ol>
	<li>Wizualizuj leukocyty i NET za pomocą szybkiego, szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kondensor dalekiego zasięgu, monochromator, 10-krotny obiektyw zanurzeniowy w wodzie i kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym. Akwizycja obrazu została zrealizowana przy czasie naświetlania 30 ms i filtrach Alexa Fluor 488(495/519) i Rhodamine Red (570/590).</li>
	<li>Używaj oprogramowania do obrazowania do pozyskiwania i analizy obrazów.</li>
	<li>Określ ilościowo rekrutację komórek w obszarze zainteresowania o powierzchni 0,06 mm².</li>
	<li>Określ ilościowo przylegające leukocyty jako komórki pozostające nieruchome lub przyczepione do wyściółki śródbłonka przez 20-sekundowy okres obserwacji.</li>
	<li>Zidentyfikuj NET jako struktury zewnątrzkomórkowe znakowane zarówno leukocytami, jak i zewnątrzkomórkowymi barwnikami fluorescencyjnymi kwasu nukleinowego.</li>
	<li>Eutanazja zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy pod koniec eksperymentu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
</ol>
5. Izolacja komórek śródbłonka wątroby (LEC) i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Izolowanie LEC za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS)29.</li>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA.</li>
	<li>Przeprowadź komplementarną syntezę DNA (cDNA) 27, mieszając 2 μg całkowitego RNA z 2 μl buforu RT, 0,8 μl mieszanki dNTP, 2 μl losowych starterów RT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4,2 μl sterylnie destylowanegoH2O.</li>
	<li>Transkrypcję cDNA przeprowadzono w następujących warunkach: 25 °C przez 10 min, 37 °C przez 120 min, 85 °C przez 5 min.</li>
	<li>Użyj 20 ng cDNA do qPCR.</li>
	<li>Użyj następujących starterów: F2r (do przodu): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (do tyłu): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (do przodu): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (do tyłu): TCTGGGTTTCCGCCAGTTTTT. Stosować następujące warunki: 95 °C 30 s, 45 cykli (95 °C przez 10 s, 60 °C przez 25 s), 60 °C do 95 °C przez 6 s przy ΔΤ 1 °C.</li>
</ol>

Endothelial PAR1 Role in Leukocyte Adhesion and NET Formation During I/R Injury

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Uszkodzenie I/R krezki w połączeniu z mikroskopią przyżyciową zastosowano do genetycznego mysiego modelu niedoboru F2r (PAR1) w komórkach śródbłonka do analizy in vivo leukocytów i NET po 1 godzinie niedokrwienia. Model uszkodzenia krezki I/R jest często stosowany u gryzoni, u których czas zarówno niedokrwienia, jak i reperfuzji waha się od minut do kilku godzin23,31, wpływając na wynik stanu zapalnego32 i śmiertelność33. Model zależy również od kilku czynników, w tym mikrobioty19,34, receptorów immunologicznych 10,35,36,37, płci38,39 i wieku35 lat. Oprócz różnych czasów I/R, kolejną zmienną w tym modelu jest zróżnicowana reakcja różnych części jelita na uraz, przy czym jelito cienkie wykazuje większe uszkodzenie błony śluzowej niż okrężnica40. Umiejscowienie klipsa mikronaczyniowego wpływającego na obszar niedokrwienny ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności metody32,33. Co ważne, doskonała niedrożność tętnicy krezkowej w połączeniu z przerwaniem przepływu pobocznego daje wskaźniki śmiertelności, które są konsekwentnie związane z czasem trwania niedokrwienia41.
W tym badaniu myszy poddano 1-godzinnemu niedokrwieniu, a adhezję leukocytów in vivo i tworzenie NET uwidoczniono natychmiast po reperfuzji w celu zbadania wczesnej odpowiedzi zapalnej wywołanej stanem niedokrwiennym przy braku śródbłonkowej ekspresji F2r . Zastosowanie tych metod do genetycznych modeli myszy pozwala na zbadanie, w jaki sposób niektóre cząsteczki docelowe wpływają na zachowanie komórek i odpowiedź zapalną zarówno po niedokrwieniu, jak i podczas reperfuzji.
W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, w tym utrzymanie integralności jelit. Obchodzenie się z jelitem musi być delikatne, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. W tym celu odpowiednie narzędzie do czasowego odłączenia jelita od jamy brzusznej są wilgotne waciki. Bardzo ważne jest, aby jelito pozostało wilgotne, dopóki nie zostanie ponownie umieszczone w jamie brzusznej. Drobne urazy związane z przenoszeniem mogą wywołać aktywację różnych typów komórek, takich jak płytki krwi i komórki śródbłonka, co może wpływać na wyniki.
Aby zachować spójność, ważne jest, aby uwidocznić to samo miejsce segmentów jelita przed i po niedokrwieniu. Może to być trudne, ponieważ po niedokrwieniu jelito jest przestawiane w jamie brzusznej. Aby rozwiązać ten problem, jednym ze sposobów jest umieszczenie małego kawałka wilgotnego kompresu na części jelita, która została uwidoczniona przed niedokrwieniem.
Aby uwidocznić zwijanie i adhezję leukocytów, a także tworzenie NET in vivo, myszom wstrzyknięto zarówno leukocyt, jak i barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego przez żyłę szyjną. Barwnik leukocytów (patrz tabela materiałów) jest przepuszczalnym dla komórek metachromatycznym barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże się z białymi krwinkami, ale nie z czerwonymi krwinkami i jest szeroko stosowany do barwienia leukocytów in vivo 17,42. Barwnik nakłada się dożylnie i zapewnia silne barwienie leukocytów w ciągu kilku sekund. Jednak swoistość może być ograniczeniem, ponieważ barwi również inne komórki jądrzaste, takie jak komórki śródbłonka. Niemniej jednak komórki krążące dłużej utrzymują zabarwienie ze względu na efekt wypłukiwania43. Barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego (patrz tabela materiałów) jest nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem kwasu nukleinowego, powszechnie stosowanym do wizualizacji tworzenia NET 30,44,45. Może być również stosowany dożylnie, wiąże się z dużym powinowactwem, jest szybki i łatwy w użyciu. Ponownie, specyficzność jest wadą, ponieważ barwnik zwiąże się z każdą komórką z nienaruszoną błoną. Najlepiej połączyć go z markerem neutrofili (np. CD15, CD11b) lub markerem NETosis (np. przeciwciałami anty-citH3) w celu zwiększenia swoistości. Barwniki te umożliwiają obrazowanie in vivo leukocytów w żyłkach krezkowych zwierząt laboratoryjnych.
Głównym ograniczeniem tej techniki jest obecność tłuszczu trzewnego, który ogranicza wizualizację naczyń włosowatych jelit i znacznie utrudnia pozyskiwanie obrazu. Aby uniknąć tego powikłania, konieczne jest wykorzystanie młodych zwierząt doświadczalnych (w wieku 6-8 tygodni), które mają zmniejszone tworzenie się tłuszczu trzewnego. Dodatkowo analiza histologiczna ex vivo jest utrudniona przez stosowanie barwienia in vivo . Kolejnym ograniczeniem jest wpływ mikrobioty jelitowej i diety na ten model, który może się znacznie różnić w zależności od hodowli myszy46. Aby rozwiązać to ograniczenie, można rozważyć badanie gnotobiotycznych modeli myszy10.
W tym badaniu badano natychmiastową odpowiedź komórkową po niedokrwieniu i obserwowano zmniejszone odkładanie leukocytów do aktywowanego śródbłonka krezki i tworzenie NET in vivo. Degradacja NET przez dożylne podanie DNazy 1 godzinę po niedokrwieniu zmniejsza wczesną odpowiedź prozapalną i łagodzi przerwanie bariery jelitowej47. Warto zauważyć, że leczenie trombomoduliną, transbłonową glikoproteiną, która hamuje aktywność trombiny48, poprawiło przeżywalność myszy z ciężkim uszkodzeniem I/R jelit, osłabiając odpowiedź zapalną dysfunkcji śródbłonka i zmniejszając intensywną akumulację histonów w odległych narządach49. W tym przypadku wykazano, że śródbłonkowy receptor trombiny wpływa na wynik I/R, podkreślając znaczenie połączenia modelu uszkodzenia I/R jelit z mikroskopią przyżyteczną u genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu zbadania ważnych mediatorów patologii choroby.

Ostre niedokrwienie krezki (AMI) jest rzadką patologią1 o wysokim ryzyku śmiertelności2, charakteryzujący się zmniejszonym przepływem krwi w krezce z powodu skrzeplin w osi trzewki, czyli tętnicy krezkowej górnej lub dolnej. W 60%-70% przypadków ostre niedrożności tętnicy krezkowej górnej spowodowane zakrzepicą lub embolizacją są odpowiedzialne za ostre niedokrwienie jelit3. Natomiast w 5-15% przypadków zakrzepica żył krezkowych odpowiada za niedokrwienie krezki obejmujące żyłę krezkową górną i, rzadziej, żyłę krezkową dolną4. Niedotlenienie i niedożywienie wynikające z niedokrwienia prowadzą do zaburzeń metabolizmu energetycznego na poziomie komórkowym5. Na przykład upośledzona funkcja mitochondriów aktywuje wiele szlaków sygnałowych, inicjując mechanizmy śmierci komórkowej6. Chociaż szybka reperfuzja umożliwia przywrócenie metabolizmu tlenowego, przywrócenie przepływu krwi do obszaru niedokrwionego często powoduje rozległe uszkodzenia tkanek z powodu produkcji reaktywnych form tlenu (ROS)7, przeciążenie wapniem8, dysfunkcja śródbłonka9 i reakcje zapalne10.
Wiele eksperymentalnych modeli zwierzęcych wykorzystujących tymczasową niedrożność naczyń tętnicy krezkowej górnej zostało stworzonych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (I/R)11. Stosowanie takich modeli w połączeniu z mikroskopią przyżyciową (IVM) ma fundamentalne znaczenie dla uzyskania wglądu w podstawowe interakcje komórkowe i postęp choroby11. Dysfunkcję bariery jelitowej obserwuje się wkrótce po niedokrwieniu12, przy czym nabłonek traci swoją integralność13, co skutkuje translokacją bakteryjną do miejsc pozajelitowych, takich jak krezkowe węzły chłonne, śledziona, wątroba i nerki12,14. Reperfuzja dodatkowo pogarsza uraz błony śluzowej15. Reakcja zapalna w tętniczkach objawia się zwijającym się i mocnym przyleganiem leukocytów do warstwy komórek śródbłonka, co jest zależne od cząsteczek takich jak L-selektyna16, P-selektyna (CD62P)17, płytki krwi GPIIb/IIIa i fibrinogen18. Co ciekawe, na adhezję leukocytów do żyłek krezkowych wpływa obecność mikrobioty jelitowej19 oraz sygnalizacji receptora Toll-like 410. Uszkodzenie I/R wyzwala również tworzenie się pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET)10. Terapeutyczne ukierunkowanie na zewnątrzkomórkowe DNA, pochodzące z aktywowanych leukocytów, takich jak neutrofile, poprawia wyniki uszkodzenia I/R jelit20. W wątrobie uszkodzenie I/R jest inicjowane przez rezydentne mikrofagi21, a hamowanie mikroRNA znacznie osłabia apoptozę22. Warto zauważyć, że uraz I/R w krezce powoduje dysbiozę jelitową, która jest odwracalna i ustępuje po rewaskularyzacji23.
Na śródbłonek wpływają również szkodliwe skutki uszkodzenia I/R, przy czym ROS odgrywa kluczową rolę w tym procesie24. Obserwuje się adhezję leukocytów do warstwy komórek śródbłonka, uszkodzenie śródbłonka i zmiany w metabolizmie tlenku azotu (NO)9. Jednak zaangażowane szlaki molekularne nie zostały jeszcze w pełni zbadane.
Receptor aktywowany proteazą 1 (PAR1, F2r), jest receptorem błonowym wyrażanym przez różne komórki, w tym komórki śródbłonka, i jest aktywowany podczas stanów zapalnych25. Jego aktywacja następuje, gdy proteazy serynowe rozszczepiają receptor na N-końcu, odsłaniając uwięziony ligand, który z kolei aktywuje receptor poprzez wiązanie się z drugą pętlą zewnątrzkomórkową cząsteczki26. Szlak sygnałowy receptora białka C śródbłonka (EPCR)-PAR1 wpływa na homeostazę NO śródbłonka i ułatwia przywrócenie przepływu krwi w niedokrwieniu obwodowym27.
W tym badaniu, uszkodzenie I/R zostało zastosowane do genetycznego modelu myszy charakteryzującego się niedoborem PAR1 specyficznym dla komórek śródbłonka, aby uwidocznić zwijanie leukocytów, adhezję i tworzenie NET. Połączenie mysiego modelu genetycznego i mikroskopii przyżyciowej po mikrochirurgii I/R dostarcza cennych informacji, podkreślając konkretne typy komórek zaangażowanych w postęp choroby. Zastosowanie uszkodzeń I/R do genetycznych modeli myszy ma zasadnicze znaczenie w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych, które można wykorzystać do poprawy przebiegu choroby. Ponadto wykazano znaczenie śródbłonka PAR1 w NETozie.

<table><tbody><tr><td>Pomarańcza akrydynowa</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa Multiply PCR-Platten&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Systemy anestezjologiczne dla gryzoni</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>plastelina</td><td>Staedtler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD146 Mikrogranulki, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td>Olympus cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>urządzenie ze sprzężeniem ładowanym aparat</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>waciki bawełniane B</td><td>&ouml; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony Hemostat 125mm/5"</td><td>Instrumenty indygo&nbsp;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Balea</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Etanol rocznie 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo wąskie nożyczki &ndash; Prosty/Ostry-Ostry/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze "Dumont #5" (Inox, końcówka 0,1 mm, długość 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Rurki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>izofluranowe&nbsp;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Taśma medyczna Leukofix</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji wątroby, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne LS MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentne sitko MACS 100 &mikro; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Niewchłanialny pleciony jedwabny szew, Rozmiar: 7/0, 91 metrów&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Olympus BX51WI</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR do pasków probówek</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki probówek do PCR</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik do pliyetylenu</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), Polipropylen 6-0, Nahtmaterial&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH&nbsp;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwróconego tanskryptyzacji (cDNA o dużej pojemności)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Waga szkolna&nbsp;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td> Nożyczki sprężynowe <td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>- kątowe na bok</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Proste hemostatyki 135mm/5.5"</td><td>Instrumenty indygo&nbsp;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX</td><td>Orange Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury TC-1000</td><td>FMI F&ouml; hr Medical Instruments GmbH</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek - 1x2 zęby</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>zacisk naczyniowy</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) jelit jest ostrym stanem charakteryzującym się uszkodzeniem tkanek wynikającym z ograniczonego przepływu krwi do naczyń krezkowych, co prowadzi do patologii zarówno miejscowych, jak i ogólnoustrojowych o złym rokowaniu. Zarówno niedokrwienie, jak i reperfuzja wywołują szereg odpowiedzi komórkowych i molekularnych, przy czym komórki zapalne służą jako kluczowe regulatory patologii. W tych interakcjach ze śródbłonkiem niedokrwiennym pośredniczą liczne receptory adhezyjne. Stworzono kilka modeli zwierzęcych, aby naśladować tę patologię i badać zaangażowane szlaki molekularne. W tym badaniu mikrochirurgiczny model uszkodzenia I/R jest łączony z mikroskopią przyżyciową w celu wizualizacji zwijania leukocytów, adhezji i tworzenia pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET). Model ten stosuje się do myszy transgenicznych z niedoborem śródbłonkowego PAR1 (F2r) w celu oceny wpływu PAR1 na toczenie leukocytów i tworzenie NET 1 godzinę po niedokrwieniu i bezpośrednio po reperfuzji. In vivo zastosowano barwienie leukocytów pomarańczą akrydynową, a NET zwizualizowano za pomocą barwienia kwasem nukleinowym. Co ciekawe, u myszy pozbawionych śródbłonka receptora PAR1 zaobserwowano zmniejszoną adhezję leukocytów i tworzenie NET. Model ten umożliwia analizę in vivo kluczowych regulatorów zaangażowanych w uszkodzenia I/R.

Aby zbadać zależne od komórek śródbłonka efekty wpływające na toczenie i adhezję leukocytów, a także na tworzenie NET, w pierwszej kolejności sprawdzono skuteczność indukowanego przez VE-Cadherin Cre niedoboru F2r w komórkach śródbłonka. Do wyizolowania komórek śródbłonka wątroby zastosowano magnetyczną separację komórek. Następnie wyizolowano RNA, po czym przeprowadzono ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Myszy F2rΔEC, w których brakuje rekombinazy Cre eksprymowanej pod kontrolą promotora VE-Cadherin, wykazały znacznie obniżony poziom mRNA F2r (PAR1) (o około jedną trzecią) w porównaniu z kontrolą WT (Rysunek 1).
Po potwierdzeniu niedoboru w linii mysiej, przeprowadzono indukcję niedokrwienia i reperfuzji (I/R) krezki w celu zbadania wpływu PAR1 ekspresowanego przez komórki śródbłonka naczyniowego na toczenie i adhezję leukocytów, co zwizualizowano za pomocą mikroskopii wewnątrzoperacyjnej (Rysunek 2A,B). Po 1 h niedokrwienia usunięto zacisk, umożliwiając reperfuzję naczynia. Obserwowano i rejestrowano toczenie oraz adhezję leukocytów (zbarwione na zielono, wskazane białymi strzałkami). Choć w obu grupach odnotowano zwiększoną liczbę adherentnych leukocytów po urazie I/R, niedobór śródbłonkowego F2r (PAR1) skutkował wyraźnym, choć nieistotnym statystycznie, zmniejszeniem adhezji leukocytów do aktywowanego przez I/R śródbłonka krezki, co sugeruje aktywną rolę aktywacji śródbłonkowego PAR1 w rekrutacji leukocytów do niedokrwionych żył krezkowych (Rysunek 2C).
Kolejnym celem było sprawdzenie, czy ekspresja PAR1 w śródbłonku reguluje powstawanie NET w wyniku urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego (I/R). W związku z tym kwasy nukleinowe zewnątrzkomórkowe barwiono barwnikiem nieprzenikającym do wnętrza komórek30, a powstałe NETy wizualizowano za pomocą mikroskopii przyżyciowej (oznaczone czarnymi strzałkami) (Rysunek 2A,B). Po urazie I/R NETy zaobserwowano wyłącznie w grupie WT wykazującej prawidłowy poziom PAR1 na komórkach śródbłonka, co wskazuje na regulacyjną rolę PAR1 w procesie NETozy (Rysunek 2C,D). Co istotne, po stłumieniu ekspresji F2r w śródbłonku, w żylkach krezkowych poddanych urazowi I/R nie stwierdzono obecności NETów.
<img alt="Wykres ekspresji mRNA F2r; WT vs F2rΔEC, w stosunku do L32; zaznaczono istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ekspresja mRNA F2r (PAR1). F2r ekspresja w komórkach śródbłonka wątroby myszy WT (n = 6) i F2rΔEC (n = 9) w stosunku do genu referencyjnego L32. Dane przedstawiono jako medianę z 95% przedziałem ufności. Do porównania dwóch niezależnych grup wykorzystano test Mann-Whitney, *p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Adhezja leukocytów, wyniki NETozy na obrazie mikroskopowym i wykresie słupkowym dla myszy WT i F2rΔEC przed i po ekspozycji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Endotelialny PAR1 wpływa na adhezję leukocytów i tworzenie NET w żylkach krezkowych po urazie I/R. Reprezentatywne obrazy z mikroskopii intravitalnej przedstawiające przylegające leukocyty barwione pomarańczową akrydyną (białe strzałki) oraz NET barwione Sytox Orange (czarne strzałki) u myszy WT oraz F2rΔEC  przed (pre) i po (post) urazie I/R przy powiększeniu (A) 10x oraz (B) 20x. Paski skali: A, 50 µm; B, 20 µm. (C) Adhezja leukocytów oraz (D) liczba NET na mm2 u myszy WT (n = 7) i F2rΔEC (n = 4) przed (pre) i po (post) urazie I/R. Wszystkie dane przedstawiono jako medianę z 95% przedziałem ufności. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą testu ANOVA dwuczynnikowej, **p&lt; 0.01, oraz testów porównań wielokrotnych Sídáka w celu porównania średnich różnych genotypów w każdym punkcie czasowym (przed i po niedokrwieniu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

Rola poszczególnych genów w wystąpieniu i rozwoju zakrzepicy, w tym przypadku badamy śródbłonkową ekspresję PAR1 na uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Staramy się określić wpływ śródbłonka na odpowiedź, zarówno po niedokrwieniu, jak i w trakcie reperfuzji. Naprawdę ważnym aspektem, który do tej pory był niedostatecznie zbadany, jest określenie roli komensalów jelitowych w uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki.Aby zbadać tę kwestię, nasza grupa połączyła mikroskopię przyżyciową z modelem uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki, a następnie połączyliśmy to z wolnymi od zarazków modelami myszy. Zastosowanie modeli zakrzepicy u myszy transgenicznych w połączeniu z mikroskopią przyżyciową, takie technologie umożliwiają obserwację in vivo zachowań komórkowych podczas wystąpienia choroby. Wykonywanie modeli eksperymentalnych na organizmach żywych jest zawsze wyzwaniem, ponieważ na eksperyment wpływa wiele czynników, w tym płeć, wiek, znieczulenie, leczenie, zmiany w przepisach dotyczących dobrostanu zwierząt i tak dalej.Również badania nad zakrzepicą rozpoczęły się w ubiegłym wieku. Wiele czynników, które się do tego przyczyniły, pozostaje nadal nierozwiązanych. Moja grupa bada rolę mikrobioty jelitowej w zakrzepicy, miażdżycy, funkcji płytek krwi i unaczynieniu.Na początek umieść znieczuloną, ogoloną mysz w pozycji leżącej grzbietowej na poduszce grzewczej. Podłącz mysz do systemu tlenowego za pomocą stożka nosowego. Przymocuj kończyny myszy do podgrzewanej podkładki za pomocą taśmy chirurgicznej.W celu implantacji cewnika w żyle szyjnej należy wykonać poprzeczne nacięcie nad tchawicą. Usuń skórę pokrywającą szyję i odizoluj prawą żyłę szyjną. Następnie za pomocą pięciocentymetrowej jedwabnej nici zamknij dystalny koniec żyły i przymocuj go kleszczami chirurgicznymi.Umieść trzy jedwabne nici około dwóch centymetrów poniżej żyły, jedną w pobliżu dystalnego końca i dwie w pobliżu bliższego końca żyły szyjnej. Zawiąż węzeł chirurgiczny, ale nie zamykaj naczynia. Napełnij cewnik polietylenowy 0,9% chlorkiem sodu.Usuń pęcherzyki powietrza i podłącz go do jednomililitrowej strzykawki. Za pomocą nożyczek wytnij otwór między drugim a trzecim węzłem i wszczepij cewnik do żyły szyjnej. Odessać strzykawkę, aby upewnić się, że w cewniku znajduje się krew.Zawiąż jedwabną nić, aby zabezpieczyć cewnik w żyle. Następnie należy użyć taśmy medycznej, aby zabezpieczyć strzykawkę. Napełnij jedną mililitrową strzykawkę pomarańczą akrydynową o końcowym stężeniu 0,5 miligrama na mililitr i barwnikiem kwasu nukleinowego o stężeniu pięciu mikromolów.Wstrzyknij 50 mikrolitrów SYTOX Orange na zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili lub NET. Zdezynfekuj skórę brzucha myszy za pomocą naprzemiennych rund peelingów na bazie jodu i alkoholu. Następnie za pomocą skalpela wykonaj laparotomię o długości od trzech do pięciu centymetrów wzdłuż liniowej alba.Delikatnie wysuń jelito z jamy brzusznej za pomocą dwóch bawełnianych końcówek nasączonych solą fizjologiczną i zidentyfikuj miejsce z minimalnym pokryciem tłuszczem. Umieść małe gałęzie jelita na czarnym cieście, aby zmniejszyć sygnał tła. Wstrzyknij 50 mikrolitrów pomarańczy akrydynowej przez cewnik żyły szyjnej, aby uwidocznić wybarwione leukocyty.Uzyskaj wideo jelita przed reperfuzją niedokrwienną. Przygotuj kompres zwilżony chlorkiem sodu i umieść w nim jelito. Zatkaj tętnicę krezkową górną za pomocą małego zacisku naczyniowego.Delikatnie wepchnij jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną. Użyj szwu 7-0, aby zamknąć ścianę brzucha i zapobiec utracie wilgoci i temperatury. Po godzinie zdejmij szew.Po okresie niedokrwienia nałóż kilka kropli soli fizjologicznej na przycięty obszar. Następnie delikatnie usuń klipsy mikronaczyniowe za pomocą aplikatora do klipsów. Za pomocą bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie ponownie wysuń jelito z jamy brzusznej i ułóż małe gałązki żyły na czarnym cieście.Wstrzyknij 50 mikrolitrów pomarańczy akrydynowej i uchwyć wideo żyły po niedokrwieniu. Włącz szybki, szerokokątny mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kondensor dalekiego zasięgu, monochromator, obiektyw z 10-krotnym zanurzeniem w wodzie i kamerę urządzenia sprzężonego z ładunkiem. Ustaw czas ekspozycji na 30 milisekund i wybierz kanał 5B z zainstalowanymi filtrami Alexa Fluor 488 i Rhodamine Red, aby uwidocznić leukocyty i NET.Określ ilościowo rekrutację komórek w obszarze zainteresowania o powierzchni 0,06 milimetra kwadratowego. Następnie określ ilościowo przylegające leukocyty, licząc komórki, które pozostały nieruchome lub przyczepione do wyściółki śródbłonka podczas 20-sekundowego okresu obserwacji. Zidentyfikuj NET znakowane zarówno leukocytami, jak i barwnikami fluorescencyjnymi kwasu nukleinowego.Adhezja leukocytów do niedokrwiennego śródbłonka krezki zwiększyła się zarówno w grupach typu dzikiego, jak i F2r delta EC po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym, przy czym w grupie F2r delta EC zaobserwowano znacznie niższą adhezję, co sugeruje rolę śródbłonka PAR1 w rekrutacji leukocytów. Po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym NET obserwowano tylko w grupie typu dzikiego, w której wyrażano normalne poziomy PAR1 na komórkach śródbłonka, co wskazuje na regulacyjną rolę PAR1 w NETosis.

visualization-neutrophil-extracellular-traps-mesenteric-venules-after

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Opisujemy metodę identyfikacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w kardiogennych zakrzepach tętniczych kotów utrwalonych formaldehydem i parafinie, wykorzystując indukowane ciepłem pobieranie antygenu i protokół podwójnego znakowania immunologicznego.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Poznaj wizualizację pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Ta metoda pozwala obserwować zachowania komórkowe in vivo.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Przeglądaj więcej filmów