Name: Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj analizę transkryptomiki pojedynczych komórek gojenia ran skóry myszy przy użyciu R, Seurat i CellChat. Protokół obejmuje kontrolę jakości, wizualizację klastrów i identyfikację typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium M.S. Wietecha otrzymało dofinansowanie z grantu NIH/NIGMS R35-GM154921, Wound Healing Society Research Grant oraz Wydziału Biologii Jamy Ustnej w UIC College of Dentistry.

UWIEJ: W poniższych przepływach pracy szczegółowo opisano siedem metod bioinformatycznych, przy czym wszystkie kroki protokołów są dostępne jako odpowiednie fragmenty kodu, które powinny być uruchamiane bezpośrednio w interfejsie użytkownika RStudio w kolejności, w jakiej są wymienione. Aby uprościć ten protokół, dołączono plik skryptu R (Dodatkowy plik 1: JoVE_Rscript.R), który można załadować bezpośrednio do sesji użytkownika w RStudio, aby każdy wiersz kodu można było po prostu uruchomić. Dzięki temu użytkownik nie musi wpisywać ani kopiować i wklejać kodu z dokumentu protokołu, co mogłoby prowadzić do błędów. Wszystkie instrukcje protokołu są również zawarte w pliku skryptu R w postaci komentarzy, oznaczonych symbolem hashtagu '#' na początku każdego wiersza komentarza.
1. Instalowanie R, RStudio oraz wymaganych pakietów R dla pojedynczej analizy komórkowej
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj R (wersja 4.4.1) na komputerze. Użyj łącza odpowiadającego systemowi operacyjnemu komputera.
	<ol>
		<li>Jeśli korzystasz z komputera z systemem Microsoft Windows, użyj tego linku: <a href="https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/">https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/</a></li>
		<li>Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, użyj tego linku: <a href="https://cran.rstudio.com/bin/macosx/">https://cran.rstudio.com/bin/macosx/</a></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj najnowszą wersję RStudio na komputerze. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami: 
	<a href="https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download">https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download</a></li>
	<li>Zainstaluj Rtools (wersja 4.4), które pozwolą R na skompilowanie niektórych pakietów. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami:
	<ol>
		<li>Jeśli korzystasz z Windows, użyj tego linku: <a href="https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/">https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/</a></li>
		<li>Jeśli korzystasz z MacOS, użyj tego linku: 
		<a href="https://mac.r-project.org/tools/">https://mac.r-project.org/tools/</a></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw lokalny katalog roboczy; jest to folder na komputerze, z którego wszystkie pliki będą wczytywane i zapisywane. Ustaw katalog roboczy, wybierając Sesja w menu paska narzędzi RStudio i klikając Ustaw katalog roboczy > Wybierz katalog oraz wybierając żądany folder.
	<ol>
		<li>Jeśli korzystasz z komputera z systemem Windows, użyj następującego polecenia, aby ustawić katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/" 
		<code>setwd("C:/[Katalog]")</code></li>
		<li>Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, następujące polecenie również ustawia katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/" 
		<code>setwd("~/[Katalog]")</code></li>
		<li>W dowolnym momencie sesji R sprawdź katalog roboczy, używając następującego wiersza kodu: 
		<code>getwd()</code></li>
		<li>W RStudio wizualnie przeglądaj strukturę katalogu roboczego, w tym wszystkie zawarte w nim pliki i foldery, w prawym oknie w zakładce Pliki . Aby przejść do eksploratora plików RStudio do katalogu roboczego, kliknij ikonę koła zębatego -> Przejdź do katalogu roboczego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj następujące pakiety z repozytorium pakietów R CRAN, które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia. 
	<code>install.packages("devtools") 
	install.packages("readxl") 
	install.packages("openxlsx") 
	install.packages("tidyverse") 
	install.packages("scCustomize")</code> 
	UWAGA: Podczas instalacji pakietów R może się pojawić wiele okien, które znikają. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o skompilowanie pakietu, kliknij TAK. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o ponowne uruchomienie R przed zainstalowaniem pakietu, kliknij NIE.</li>
	<li>Zainstaluj następujące pakiety z kuratorskiej bazy pakietów R Bioconductor 
	(<a href="https://bioconductor.org/">https://bioconductor.org/</a>), które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia.  
	<code>if (! requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE) ) 
	  install.packages("BiocManager") 
	BiocManager::install("NMF", update=F) 
	BiocManager::install("ComplexHeatmap", update=F) 
	BiocManager::install("BiocNeighbors", update=F) 
	BiocManager::install("SingleCellExperiment", update=F) 
	BiocManager::install("circlize", update=F) 
	BiocManager::install("edgeR", update=

<ol><li>Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%3A+mechanisms%2C+signaling%2C+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation.</a> Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).</li>
<li>Wietecha, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-specific+signatures+of+wound+fibroblasts+and+matrix+patterns+define+cancer-associated+fibroblast+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes.</a> Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+a+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Wound healing: a cellular perspective.</a> Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> J Vis Exp. (162), e61616(2020).</li>
<li>Fischer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+splinted%2C+human-like+excisional+wound+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice.</a> Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+primes+human+oral+mucosa+for+rapid+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing.</a> Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).</li>
<li>Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+differences+in+the+wound+transcriptome+of+skin+and+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa.</a> BMC Genomics. 11, 471(2010).</li>
<li>Leonardo, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+human+palate+and+skin+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in human palate and skin healing.</a> Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).</li>
<li>Rognoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+state+switching+orchestrates+dermal+maturation+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing.</a> Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).</li>
<li>Bergmeier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myofibroblast-specific+expression+signature+in+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds.</a> Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+fat+cells+from+myofibroblasts+during+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing.</a> Science. 355 (6326), 748-752 (2017).</li>
<li>Shook, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+proliferation+and+heterogeneity+are+supported+by+macrophages+during+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair.</a> Science. 362 (6417), aar2971(2018).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+fibrosis.+Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), aaa2151(2015).</li>
<li>Guerrero-Juarez, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+fibroblast+heterogeneity+and+myeloid-derived+adipocyte+progenitors+in+murine+skin+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds.</a> Nat Commun. 10 (1), 650(2019).</li>
<li>Gay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+Wnt+inhibitor+SFRP4+by+late+wound+macrophages+drives+chronic+Wnt+activity+for+fibrotic+skin+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing.</a> Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).</li>
<li>Haensel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+epidermal+basal+cell+states+during+skin+homeostasis+and+wound+healing+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics.</a> Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).</li>
<li>Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+small+and+large+wounds+reveals+the+distinct+spatial+organization+of+regenerative+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts.</a> Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).</li>
<li>Hu, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+space-time+mapping+identifies+concerted+immune+and+stromal+cell+patterns+and+gene+programs+in+wound+healing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer.</a> Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictionary+learning+for+integrative%2C+multimodal+and+scalable+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis.</a> Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+and+analysis+of+cell-cell+communication+using+CellChat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat.</a> Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).</li>
<li>Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublet+identification+in+single-cell+sequencing+data+using+scDblFinder%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder.</a> F1000Research. 10, 979(2021).</li>
<li>Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellChat+for+systematic+analysis+of+cell-cell+communication+from+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics.</a> Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).</li>
<li>Luecken, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+atlas-level+data+integration+in+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics.</a> Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).</li>
<li>Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+workflow+for+low-level+analysis+of+single-cell+RNA-seq+data+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor.</a> F1000Research. 5, 2122(2016).</li>
<li>McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scater%3A+pre-processing%2C+quality+control%2C+normalization+and+visualization+of+single-cell+RNA-seq+data+in+R%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).</li>
<li>Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCANPY%3A+large-scale+single-cell+gene+expression+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis.</a> Genome Biol. 19 (1), 15(2018).</li>
<li>Aran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference-based+analysis+of+lung+single-cell+sequencing+reveals+a+transitional+profibrotic+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage.</a> Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).</li>
<li>Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scGate%3A+marker-based+purification+of+cell+types+from+heterogeneous+single-cell+RNA-seq+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets.</a> Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).</li>
<li>Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellPhoneDB%3A+inferring+cell-cell+communication+from+combined+expression+of+multi-subunit+ligand-receptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes.</a> Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).</li>
<li>Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoTalk%3A+de+novo+construction+of+signal+transduction+networks+using+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data.</a> Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+and+resources+for+cell-cell+communication+inference+from+single-cell+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data.</a> Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym protokole program RStudio służy do uruchamiania określonych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu usługi Seurat. Przedstawiono kilka metod, które są istotne dla badań nad gojeniem się ran, w tym instalację środowiska kodowania R, pobieranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych, wykonywanie krytycznych etapów kontroli jakości i standardowych przepływów pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje, adnotacje głównych typów komórek, analizy podtypów komórek i analizy integracyjne przy użyciu Seurat oraz wykonywanie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.
Metody przedstawione w niniejszym dokumencie są uproszczonymi winietami typowych przepływów pracy dla analizy pojedynczej komórki przy użyciu języka R i jego popularnych pakietów naukowych typu open source, Seurat21 i CellChat22. Rzeczywiście, przepływ pracy jest tylko jednym z przykładów rodzaju analizy, którą można przeprowadzić za pomocą złożonego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych. Możliwe modyfikacje tej metody są niemal nieograniczone, a jedynym ograniczeniem jest konkretne dociekania naukowe użytkownika. Na przykład użytkownik może zmienić niektóre z kluczowych parametrów, takich jak typy komórek i punkty czasowe, zgodnie z pytaniami badawczymi, które może chcieć zadać temu zestawowi danych. Autorzy mają również nadzieję, że użytkownik czuje się na tyle komfortowo, aby dostosować ten przepływ pracy do własnego zestawu danych jednokomórkowych, który go interesuje; Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z tego przepływu pracy do analizowania innych zestawów danych, ponieważ każdy eksperyment może powodować problemy techniczne i związane z przygotowaniem próbki na same dane. Dlatego konieczne jest, aby użytkownik przeczytał i zrozumiał wszystkie szczegóły eksperymentu przed interpretacją wyników wcześniej opublikowanych i ponownie przeanalizowanych zestawów danych jednokomórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że narzędzia bioinformatyczne są potężną metodą badania procesów biologicznych i generowania hipotez, a wszelkie krytyczne biologiczne interpretacje wyników muszą zostać zweryfikowane w dalszych eksperymentach.
W całym protokole należy pamiętać, że w niektórych obszarach przepływu pracy mogą zostać wprowadzone poważne modyfikacje w celu wykonania innych zadań. Jednak szczegóły dotyczące wszystkich możliwych kombinacji modyfikacji przepływu pracy wykraczają poza zakres tego manuskryptu. Na przykład rozdzielczość używana do grupowania komórek i wymiary używane do analizy UMAP są z konieczności subiektywne, a przedstawione tutaj narzędzia pozwalają zarówno na analizy na dużą skalę (jak wykazano tutaj dla szeroko zdefiniowanych głównych typów komórek), jak i bardzo szczegółowe analizy, które mogą pociągać za sobą subgrupowanie komórek w rzadsze subpopulacje w ramach większego zbioru danych. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego aspektu metody analizy pojedynczej komórki oraz szczegółowe informacje na temat wszystkich innych parametrów, które mogą zostać zmienione w potoku analizy pojedynczej komórki, autorzy odsyłają użytkownika do publikacji<a href="https://satijalab.org/seurat/"></a> Seurat21,26 i strony internetowej (https://satijalab.org/seurat/), gdzie autorzy tego rozwijającego się narzędzia udostępniają szczegółowe wyjaśnienia, winiety i samouczki.
Manuskrypt ten wprowadził niektóre z najczęściej cytowanych i używanych narzędzi w literaturze dotyczącej transkryptomiki pojedynczej komórki, a mianowicie Seurat21 i CellChat22, odpowiednio do analiz interakcji pojedynczych komórek i komórek-komórek. Istnieją jednak inne narzędzia, które wykonują podobne funkcje w nieco inny sposób. Do analizy zestawów danych w pojedynczej komórce dostępne są Scran27, Scater 28 i ScanPy29 oparty na języku Python, które wykorzystują różne metody integracji zestawu danych25. W tym protokole zademonstrowano ręczną adnotację typów komórek, która opiera się na ocenie użytkownika w celu interpretacji wzbogacenia markerów komórek klastrowych, ale obecnie istnieją różne narzędzia umożliwiające automatyczną klasyfikację typów komórek, takie jak między innymi SingleR30 i scGate31. W przypadku analiz komunikacji komórka-komórka, CellChat został zademonstrowany w tym protokole, ale istnieją inne narzędzia do szacowania komunikacji komórka-komórka, w tym CellPhoneDB32, Cytotalk33 i inne bazy danych ligand-receptor, które są zaimplementowane w ramach konsensusu LIANA (LIgand-receptor ANalysis framework)34. Wszystkie narzędzia bioinformatyczne są unikalne i mają swoje własne cechy charakterystyczne i modyfikowalne parametry. Dlatego ważne jest, aby użytkownik uważnie przeczytał powiązaną dokumentację każdego narzędzia, aby zrozumieć jego niuanse przed interpretacją jakichkolwiek danych wyjściowych wygenerowanych w wyniku ich użycia. Wreszcie, niezależnie od tego, jakich narzędzi bioinformatycznych się używa, ważne jest, aby pamiętać, że takie narzędzia stale ewoluują i że różne wersje pakietów mogą dawać różne wyniki.
W R składnia ma kluczowe znaczenie, a źle umieszczona interpunkcja, cudzysłów, nawias kwadratowy, a nawet nieprawidłowo wielka litera spowoduje błąd. Dlatego ważne jest, aby użytkownik zwracał uwagę na szczegóły podczas wpisywania kodu i był szczególnie uważny podczas kopiowania wierszy kodu, aby dostosować go do nowych pytań naukowych i zestawów danych. Aby rozwiązać konkretne błędy, które można napotkać, autorzy zalecają po prostu skopiowanie i wklejenie komunikatu o błędzie do ulubionej wyszukiwarki internetowej użytkownika i przejrzenie wyników z forów bioinformatycznych, takich jak GitHub i Stack Overflow, ponieważ najczęściej spotykane błędy prawdopodobnie zostały już rozwiązane przez doświadczonego zaawansowanego użytkownika. Na niektórych forach najbardziej udane odpowiedzi są "zagłosowane" przez innych użytkowników, którzy uznali rozwiązanie za najlepsze dla danego problemu. Użytkownik musi uważać, aby po prostu nie skopiować i nie wkleić wierszy kodu, które znalazł w Internecie, do własnego komputera (zwłaszcza jeśli rozwiązanie wymaga zmiany ustawień systemowych poza językiem programowania R), ponieważ istnieje ryzyko, że takie programy mogą być złośliwe. Ekscytującą pojawiającą się metodą rozwiązywania problemów z błędami w kodowaniu jest korzystanie z potężnych generatywnych modeli sztucznej inteligencji w dużym języku, takich jak ChatGPT firmy OpenAI, Copilot firmy Microsoft lub Gemini firmy Google. Modele te okazały się szczególnie przydatne w inżynierii oprogramowania w ogóle, a w szczególności w rozwiązywaniu problemów. W tym celu użytkownik może kopiować i wklejać całe wiersze swojego kodu po dostarczeniu prostego monitu do chatbota o zamiarze użytkownika dotyczącego kodu. Zwykle istnieje zastrzeżenie, że modele te nie są niezawodne, a użytkownik może być zmuszony do wypróbowania wielu podpowiedzi w celu wygenerowania odpowiedzi, która jest odpowiednia do rozwiązania problemu.

Gojenie się ran jest jednym z najbardziej złożonych procesów w biologii ssaków i obejmuje spektrum trzech faz gojenia: zapalnej, proliferacyjnej i rozdzielczości 1,2. Te fazy gojenia szeroko klasyfikują skoordynowane działania dziesiątek typów komórek i setek ich produktów molekularnych w przestrzeni i czasie gojenia się ran3. Kilka dekad badań histologicznych i molekularnych opartych na próbkach tkanek ran w całym okresie gojenia wyjaśniło nadrzędne wzorce komórkowe naprawy tkanek3, szczególnie w odtwarzalnych mysich modelach gojenia się ran skóry 4,5,6. Dopiero w ciągu ostatnich dwóch dekad możliwe stało się pełniejsze docenienie złożoności gojenia się ran, począwszy od pojawienia się wysokoprzepustowych analiz transkryptomicznych ran w skali tkanekmasowych 7,8,9 i komórek 10,11,12,13,14. Ostatnio w kilku badaniach sprofilowano transkrypcyjnie rany skóry na poziomie pojedynczych komórek, identyfikując nowe podtypy komórek rany i pokazując, w jaki sposób mogą one wchodzić ze sobą w interakcje podczas gojenia 15,16,17,18,19,20. Hu i in. wykorzystali innowacyjne podejście do sekwencjonowania przestrzennego jednokomórkowego RNA do profilowania ran skóry w czasie gojenia w kilku promieniowych odległościach od centrum rany, co ujawniło nowe "ruchy" międzykomórkowe i molekularne w przestrzeni i czasie20. Takie badania odkrywają złożoność gojenia się ran w niespotykanych dotąd szczegółach i zaczynają malować obraz ogromnej różnorodności komórkowej i molekularnej.
Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie metod analizy bioinformatycznej umożliwiają biologiczne zrozumienie złożonych multiomicznych zestawów danych generowanych w dziedzinie badań nad gojeniem się ran. Pakiety do analizy pojedynczych komórek, takie jak Seurat, zapewniają narzędzia do solidnej analizy i integracji zestawów danych, w tym klasyfikacji typów komórek w złożonych tkankach, takich jak rany21. Do dalszej interpretacji danych z pojedynczych komórek narzędzia takie jak CellChat są używane do identyfikacji przypuszczalnych programów interakcji komórka-komórka, które mogą wyjaśnić, w jaki sposób komórki koordynują się w celu naprawy ran22. Chociaż narzędzia te są dobrze udokumentowane i dobrze cytowane, muszą być uruchamiane w środowisku kodowania komputerowego, takim jak R, statystyczny i graficzny język programowania, który jest najczęściej używany w dziedzinach bioinformatyki genomiki i transkryptomiki. Podczas gdy biolodzy i klinicyści zajmujący się gojeniem ran coraz częściej stosują podejścia jednokomórkowe do badania naprawy tkanek, niewielu z nich ma wykształcenie bioinformatyczne wymagane do korzystania z narzędzi takich jak Seurat i CellChat bezpośrednio we własnych laboratoriach. Taka bariera w korzystaniu z tych narzędzi bioinformatycznych nie tylko uniemożliwia naukowcom głębszą analizę własnych zbiorów danych bez pomocy bioinformatyków, ale także uniemożliwia naukowcom wiarygodną ponowną analizę bogactwa danych z pojedynczych komórek, które zostały już opublikowane przez inne grupy.
W związku z tym przedstawiono tutaj przepływ pracy krok po kroku, aby umożliwić naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego analizę wcześniej opublikowanego i publicznie dostępnego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych20. Protokół korzysta z powszechnego i bezpłatnego graficznego środowiska kodowania języka R o nazwie RStudio i pokazuje, jak poruszać się po tym środowisku w celu uruchamiania zalecanych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu Seurat i CellChat. W ramach tego protokołu przedstawiono siedem głównych metod istotnych dla badań nad gojeniem się ran, w tym: 1) instalację środowiska kodowania, 2) pobieranie zestawu danych i krytycznych etapów kontroli jakości, 3) przepływy pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje i adnotacje typów komórek, 4) analizy podtypów komórek, 5) analizy punktacji modułów, 6) analizy interakcji komórka-komórka oraz 7) analizy integracyjne wielu zestawów danych. W ramach każdej metody dostarczany jest rzeczywisty kod, który użytkownik może uruchamiać równolegle z protokołem, a rzeczywiste wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są wyświetlane, aby poprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Głównym celem tego wizualnego wprowadzenia do RStudio i podstawowego przepływu pracy analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran bezpośredniego korzystania z tych potężnych narzędzi, aby umożliwić szybszy postęp w dziedzinie badań.

<table><tbody><tr><td>Laptop lub komputer stacjonarny</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Uruchamianie systemu Windows lub MacOS&nbsp;</td></tr><tr><td>R</td><td>N/A</td><td>Wersja 4.4.1</td><td>Do pobrania za darmo z https://cran.rstudio.com/</td></tr><tr><td>Rstudio (rstudio)</td><td>Oprogramowanie Posit, PBC</td><td>Wersja 2024.09.0</td><td>Do pobrania za darmo z https://posit.co/download/rstudio-desktop/</td></tr><tr><td>Office Excel</td><td>Firmy Microsoft</td><td>Dowolna wersja</td><td>Do analizy danych tabelarycznych</td></tr><tr><td>Przeglądarka internetowa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do przechodzenia do stron internetowych</td></tr><tr><td>R Pakiety</td><td>Repository</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia deweloperskie</td><td>CRAN</td><td>2.4.5</td><td></td></tr><tr><td>readxl (biblioteka readxl)</td><td>CRAN</td><td>1.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka Openxlsx</td><td>CRAN</td><td>4.2.7.1</td><td></td></tr><tr><td>tidyverse (Świat Tidy)</td><td>CRAN</td><td>2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>scDostosuj</td><td>CRAN</td><td>2.1.2</td><td></td></tr><tr><td>BiocManager</td><td>Bioprzewodnik</td><td>1.30.25</td><td></td></tr><tr><td>Sieć NMF</td><td>Bioprzewodnik</td><td>0.28</td><td></td></tr><tr><td>ZłożonaMapa ciepła</td><td>Bioprzewodnik</td><td>2.20.0</td><td></td></tr><tr><td>BiocSąsiedzi</td><td>Bioprzewodnik</td><td>1.22.0</td><td></td></tr><tr><td>Eksperyment z pojedynczą komórką</td><td>Bioprzewodnik</td><td>1.26.0</td><td></td></tr><tr><td>cyrkulacja</td><td>Bioprzewodnik</td><td>0.4.16</td><td></td></tr><tr><td>krawędź R</td><td>Bioprzewodnik</td><td>4.2.1</td><td></td></tr><tr><td>scDblFinder powiedział:</td><td>Bioprzewodnik</td><td>1.18.0</td><td></td></tr><tr><td>Seurat powiedział:</td><td>CRAN</td><td>5.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Czat komórkowy</td><td>Serwis Github</td><td>2.1.2</td><td></td></tr></tbody></table>

używanie r, seurat i cellchat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

Using R, Seurat, and CellChat to Analyze a Single-Cell Transcriptomics Dataset of Mouse Skin Wound Healing

Proces gojenia się ran jest regulowany przez złożone interakcje między różnymi typami komórek w przestrzeni i czasie. Poprzez profilowanie pojedynczych komórek w ich złożonym środowisku, metody transkryptomiki pojedynczej komórki umożliwiają badanie heterogeniczności komórkowej, sieci komunikacji komórkowej i interakcji komórka-komórka zaangażowanych w proces gojenia się ran. Jednak wiele narzędzi do analizy pojedynczych komórek jest uruchamianych w środowisku kodowania komputerowego, a ich szersze zastosowanie przez naukowców zajmujących się leczeniem ran jest udaremnione przez pozorny brak wiedzy bioinformatycznej. W związku z tym przedstawiono przepływ pracy krok po kroku pokazujący, jak używać graficznego środowiska kodowania o nazwie RStudio do wykonywania podstawowej analizy pojedynczej komórki zestawu danych czasowego gojenia ran skóry myszy wycinających. Ten wizualny i kierowany protokół umożliwi naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego pobranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran, wykonanie krytycznych kroków kontroli jakości, uruchomienie standardowego przepływu pracy analizy pojedynczej komórki, w tym wizualizacji zestawów danych i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat, przeprowadzenie analiz podtypów komórek, przeprowadzenie analiz punktacji modułów, przeprowadzenie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat oraz przeprowadzenie integracyjnych analiz wielu zestawów danych za pomocą Seurat. Wyjaśnienia narracyjne są dostarczane dla każdego kroku w protokole, a wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są prezentowane, aby bezpiecznie przeprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Celem tego wizualnego wprowadzenia do procesu analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran korzystania z narzędzi bioinformatycznych bezpośrednio w ich własnych laboratoriach, aby ułatwić głębsze analizy własnych zestawów danych jednokomórkowych, a także bardziej powszechne ponowne analizy wcześniej opublikowanych zestawów danych jednokomórkowych.

W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku, wizualny przepływ pracy do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczej komórki w czasie gojenia się ran skóry myszy przy użyciu R. Protokół obejmuje standardowy potok do pobierania zestawów danych, kontroli jakości, wizualizacji i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat oraz analizy interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.

Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

The process of wound healing is regulated by complex interactions between different cell types across space and time. Through the profiling of individual ...

W naszym laboratorium wykorzystujemy nowe narzędzia, takie jak transkryptomika jednokomórkowa i przestrzenna z biologią systemową i podejściami bioinformatycznymi, aby badać przestrzenną czasową dynamikę komórkową zróżnicowanych wyników leczenia. W ostatnich latach zaobserwowaliśmy szybkie zastosowanie transkryptomiki jednokomórkowej do badania gojenia się ran u ludzi i w organizmach modelowych, takich jak myszy. Pełna analiza zestawów danych z pojedynczych komórek jest niewystarczająca dla naukowców zajmujących się badaniami laboratoryjnymi, którzy mają niewielkie lub żadne doświadczenie w dziedzinie bioinformatyki. Oznacza to, że zbyt często zestawy danych z pojedynczych komórek są niedostatecznie wykorzystywane przez naukowców zajmujących się gojeniem się ran. Jest to pierwszy kompleksowy protokół, który zakłada brak wcześniejszego doświadczenia z bioinformatyką, który prowadzi użytkownika od pobrania zestawu danych do wyników odpowiednich analiz w kontekście badań nad gojeniem się ran. Nasz protokół powinien służyć jako szablon dla badaczy gojenia się ran, aby mogli pełniej analizować własne zestawy danych jednokomórkowych i być w stanie wydobyć nowe spostrzeżenia z publicznie dostępnych zestawów danych.[Szalyn] Aby rozpocząć, przejdź do plików zestawów danych z repozytorium omnibus ekspresji genów, używając numeru dostępu GSE204777. Kliknij pierwszy zestaw danych zatytułowany GSM6190913. Przewiń do dołu GSM6190913 strony i pobierz trzy wymienione pliki, korzystając z linków FTP lub HTML. Korzystając z eksploratora plików komputera, przenieś pobrane pliki do katalogu o nazwie b1, upewniając się, że znajduje się on w katalogu roboczym. Pobierz informacje o ścieżce katalogu dla pobranych plików sekwencjonowania pojedynczych komórek. Teraz załaduj pliki sekwencjonowania pojedynczych komórek do środowiska roboczego. Następnie oddziel dane dotyczące ekspresji genów i multipleksowania HTO od roboczego zestawu danych. Utwórz obiekt Seurat, korzystając z danych ekspresji genów, jednocześnie odfiltrowując geny wykryte w mniej niż pięciu komórkach i komórkach z mniej niż 200 genami. W przypadku zestawów danych bez danych HTO utwórz obiekt Seurat z tymi samymi parametrami filtrowania i przełącz się na test ekspresji genów. Oblicz procent genu mitochondrialnego w każdej komórce i przypisz tę wartość jako zmienną metadanych. Wizualizacja rozkładu liczby genów, całkowitego RNA i procentowego udziału genów mitochondrialnych we wszystkich komórkach. Usuń komórki, których zawartość mitochondriów przekracza 25% za pomocą progu i wizualizuj zaktualizowane dystrybucje po odfiltrowaniu tych komórek o niskiej jakości. Wykrywanie prawdopodobnych dubletów za pomocą metody wyszukiwarki dubletów SC. Uruchom potok wyszukiwania dubletów SC przy użyciu poleceń i przypisz wynikowe wyniki dubletów jako nową zmienną metadanych. Teraz zwizualizuj rozkład wyników dubletów we wszystkich komórkach. Usuń wszystkie komórki z wynikiem dubletu powyżej 0,25 i zapisz oczyszczony obiekt Seurat jako plik RDS w katalogu roboczym. Przeprowadzanie normalizacji danych, skalowania i analizy składników głównych. Wizualizacja udziału wariancji w pierwszych 50 składnikach zasady. Grupuj komórki, używając pierwszych 13 głównych składników i rozdzielczości grupowania 0,1. Wykonaj jednorodne przybliżenie i projekcję rozmaitości lub redukcję UMAP w analizie sąsiadów, używając pierwszych 13 podstawowych składowych i ustaw liczbę początkową na 123. Teraz zwizualizuj grupowanie komórek na wykresie UMAP, a następnie adnotacje czasu i przestrzeni na wykresie UMAP. Następnie wygeneruj tabelę kojarzącą klastry komórek z adnotacjami czasu i przestrzeni nawinięcia. Określ tożsamości głównych typów komórek po obliczeniu genów o zróżnicowanej ekspresji między wszystkimi klastrami i przypisz wynikowe listy DEG do zmiennej przed zapisaniem ich jako rozdzielanego pliku tekstowego w katalogu roboczym. Teraz otwórz plik znaczników klastra zestawu danych w aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Użyj Kreatora importu tekstu, aby ustawić przecinek jako ogranicznik i sformatować kolumny nazw genów jako tekst, aby zapobiec automatycznej konwersji nazw genów na daty. W arkuszu kalkulacyjnym uszereguj średnią kolumnę logarytmu dwóch FC od największej do najmniejszej, aby uporządkować wiersze, zmniejszając wartości podwójnej zmiany logarytmu, a następnie kolumnę klastra od najmniejszej do największej. Aby uporządkować wiersze, zwiększając liczbę klastrów Seurat, przefiltruj średnią kolumnę logarytmu dwa FC w celu uwzględnienia tylko wartości większych lub równych 2,5, a następnie przefiltruj kolumnę PCT 1 w celu uwzględnienia wartości większych lub równych 0,4. Następnie przefiltruj kolumnę PCT 2, aby uwzględnić wartości mniejsze lub równe 0,2. Na koniec przefiltruj kolumnę Skorygowana wartość P, aby uwzględnić wartości mniejsze lub równe 0,01. Teraz otwórz internetowe narzędzie do analizy wzbogacania Enrichr. Dla każdego klastra skopiuj listę genów o zróżnicowanej ekspresji do osobnego okna narzędzia Wzbogacanie i kliknij przycisk analizuj. Następnie kliknij kartę typów komórek powyżej danych wyjściowych analizy i skoncentruj się na pięciu pierwszych wzbogaceniach w trzech wyselekcjonowanych bazach danych znaczników komórek. Na podstawie najważniejszych wzbogaceń z analizy narzędzia Enrichr przypisz prawdopodobne tożsamości do ośmiu klastrów. Połącz klastry dwa i sześć w jedną adnotację oznaczoną jako fibroblasty i przypisz te adnotacje jako nową zmienną metadanych o nazwie typy komórek. Następnie zwizualizuj typy komórek z adnotacjami na wykresie UMAP i wyświetl lokalizację pogrubionych genów znacznika górnego klastra na serii wykresów UMAP. Wizualizuj geny o zróżnicowanej ekspresji górnego markera klastra na wykresie kropkowym pogrupowanym według oryginalnych numerów klastrów, a następnie ponownie geny górnego markera na wykresie kropkowym, tym razem pogrupowane według typów komórek z adnotacjami. Aby przygotować się do analizy szeregów czasowych, usuń adnotacje przestrzenne i uprość zestaw danych. Ponownie przypisz metadane czasu i przestrzeni rany do nowej zmiennej o nazwie DPW dla dni po zranieniu. Wizualizuj nowe grupowania kursów czasowych DPW na wykresie UMAP i generuj tabele pokazujące liczbę komórek każdego typu w każdej grupie DPW. Następnie przelicz liczbę komórek na proporcje, aby ocenić względne zmiany w składzie typu komórek podczas gojenia i zwizualizuj proporcje każdej kategorii DPW w każdym typie komórek. Na koniec zwizualizuj proporcje każdego typu komórki w każdej grupie DPW i zapisz końcowy obiekt Seurat zawierający wszystkie adnotacje i filtry jako plik RDS w katalogu roboczym. Wszystkie komórki w zestawie danych zostały wyraźnie zgrupowane w główne typy komórek oznaczone kolorami na wykresie UMAP, potwierdzając pomyślną adnotację na podstawie wzbogaconych sygnatur typów komórek. Wysoka ekspresja genów markerów górnych klastrów była zlokalizowana w odpowiednich klastrach typów komórek na wykresach UMAP. Wizualizacja na wykresie kropkowym potwierdziła, że najwyższe poziomy ekspresji genów markerów klastrowych były ograniczone do ich głównych typów komórek. Ułożony wykres słupkowy ujawnił, że neutrofile i makrofagi dominowały w pierwszym dniu po zranieniu, podczas gdy fibroblasty, komórki nabłonkowe i śródbłonka stały się bardziej rozpowszechnione w późniejszych punktach czasowych, odzwierciedlając znaną kaskadę komórkową gojenia się ran.

using-r-seurat-cellchat-to-analyze-single-cell-transcriptomics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.

Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Niniejszym przedstawiamy protokół wykorzystania małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 (HSP27) do oceny funkcji HSP27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. Interferencja RNA jest najlepszą metodą skutecznego obniżania ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w różnych typach komórek.

Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Ten artykuł opisuje zastosowanie nieukierunkowanej metabolomiki, transkryptomiki i wielowymiarowej analizy statystycznej do transkryptów i metabolitów z jagód winogron w celu uzyskania wglądu w koncepcję terroir, tj. wpływ środowiska na cechy jakości jagód.

Koncepcja terroir interpretowana za pomocą metabolomiki i transkryptomiki jagód winogron

Poznaj analizę transkryptomiki pojedynczych komórek gojenia ran skóry myszy przy użyciu R, Seurat i CellChat. Protokół obejmuje kontrolę jakości, wizualizację klastrów i identyfikację typów komórkowych.

Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

Przeglądaj więcej filmów