Name: Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Poznaj metody przygotowania stabilnych mechanicznie hydrożeli peptydowych poprzez samoorganizację wywołaną zmianami środowiskowymi. Technika ta umożliwia tworzenie biomateriałów o zastosowaniu w inżynierii biomedycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 11674344 i 22201026) oraz Kluczowy Program Badawczy Nauk Granicznych, CAS (Grant No. QYZDJ-SSW-SLH019).

Szczegóły dotyczące plazmidów, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Metoda odpowiedzi pH
<ol>
	<li>Dodać 5 mg peptydów ECF-5 do 400 μl wody dejonizowanej. Sonikować przy 40 kHz przez 30 minut i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 40 μl wodorotlenku sodu (1 M, przefiltrowanego przez filtr 0,22 μm) do roztworu peptydu. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Kontynuuj sonikację przez 15 minut, aż roztwór całkowicie się wyklaruje.</li>
	<li>Dodać 60 μl kwasu solnego. Szybko zwiruj i zapewnij dokładne wymieszanie. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na ponad 30 minut, aby ułatwić tworzenie hydrożelu. 
	UWAGA: W razie potrzeby zastąp wodę dejonizowaną żądanym roztworem buforowym. Jeśli cząstki stałe są duże, należy je wcześniej sproszkować. Sonikować w celu uzyskania jednorodnej mieszaniny cząstek w cieczy. Jeśli peptyd nie toleruje warunków zasadowych, najpierw dodaj 1 M roztwór kwasu solnego i powtórz powyższe kroki. W razie potrzeby dostosuj ilości kwasu i zasady, aby osiągnąć blisko punktu izoelektrycznego lub pożądanego pH, zapewniając zachowanie właściwości żelotwórczych.</li>
</ol>
2. Metoda dodawania jonów metali
<ol>
	<li>Przygotowanie materiału
	<ol>
		<li>Przygotować 0,15 m Tris i 0,1 M buforu NaCl o pH 7,4. Przefiltrować przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
		<li>Przygotować samoorganizujący się roztwór peptydowy ECF-5 o stężeniu 10 mg/ml przy użyciu buforu przygotowanego w kroku 1.1.1. Rozpuścić metodą sonikacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór chlorku wapnia o stężeniu 50 mg/ml przy użyciu wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie hydrożelu peptydowego indukowane addycją jonów metali
	<ol>
		<li>Dodać 40 μl roztworu chlorku wapnia do 460 μl roztworu peptydu ECF-5. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na ponad 2 godziny 
		UWAGA: Unikaj stosowania buforu fosforanowego, ponieważ może to prowadzić do wytrącania się jonów wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda wymiany rozpuszczalnika
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Odważyć 10 mg liofilizowanego proszku peptydu ECF-5. Dodaj go do 100 μl DMSO. Dokładnie wymieszać za pomocą ultradźwięków i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 10 mM roztworu buforowego PBS. Przefiltruj i sterylizuj. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie hydrożelu peptydowego indukowanego rozpuszczalnikiem
	<ol>
		<li>Szybko wprowadź 1 ml PBS do peptydu rozpuszczonego w DMSO. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Odstaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
		<li>Dodać 500 μl PBS, odstawić na 15 minut, wyrzucić supernatant i zachować dolny żel. Powtórz ten proces trzy razy, aby usunąć DMSO. 
		UWAGA: Jeśli DMSO wpływa na kolejne eksperymenty, rozważ rozpuszczenie peptydu w wyższym stężeniu DMSO, aby zminimalizować jego wpływ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Reomechaniczna charakterystyka hydrożelu
<ol>
	<li>Analiza reologiczna
	<ol>
		<li>Nałóż hydrożel na aluminiową płytkę równoległą o średnicy 25 mm. Wykonaj dynamiczną analizę reologiczną hydrożeli peptydowych w czasie za pomocą reometru18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizy częstotliwości i przemiatania odkształceń
	<ol>
		<li>Przeprowadzaj systematycznie analizy częstotliwości i przemiatania odkształceń18, używając kontrolowanego odkształcenia 0,3% i częstotliwości 10 rad/s. Upewnij się, że kontrola temperatury jest ustawiona na 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mikroskopia sił atomowych (AFM) charakterystyka morfologii włókien
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór 95% etanolu i dodaj 5% APTES. Przechowywać w temperaturze -20 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.</li>
		<li>Nałóż dwustronny klej, aby usunąć warstwę miki. Przyklej powierzchnie miki za pomocą roztworu APTES i odstaw na 5 minut. Przed użyciem dokładnie spłucz czystą wodą.</li>
		<li>Rozcieńczyć i dokładnie wymieszać hydrożel. Upuść go na zmodyfikowaną powierzchnię miki i pozwól na adsorpcję statyczną przez 5 minut. Spłucz powierzchnię czystą wodą i wysusz przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda wykrywania
	<ol>
		<li>Wykorzystaj wielomodowy AFM wyposażony w skaner do badania morfologii włókien peptydowych lub hydrożelu. Stosować wsporniki krzemowe o nominalnej stałej sprężystości 48 N/m.</li>
		<li>Zainicjuj instrument, aby ustawić igłę. Wybierz tryb stukania, aby zeskanować próbkę w celu uzyskania obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

 Peptide Hydrogels: Methods for Environmentally Responsive Gelation of ECF-5

<ol><li>Whitesides, G. M., Mathias, J. P., Seto, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+self-assembly+and+nanochemistry%3A+a+chemical+strategy+for+the+synthesis+of+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular self-assembly and nanochemistry: a chemical strategy for the synthesis of nanostructures.</a> Science. 254 (5036), 1312-1319 (1991).</li>
<li>Matson, J. B., Zha, R. H., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+self-assembly+for+crafting+functional+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Solid+State+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Peptide self-assembly for crafting functional biological materials.</a> Curr Opin Solid State Mater Sci. 15 (6), 225-235 (2011).</li>
<li>Itzha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+self-assembly+as+a+strategy+for+facile+immobilization+of+redox+enzymes+on+carbon+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon+Energy%22%5BJournal%5D)">Peptide self-assembly as a strategy for facile immobilization of redox enzymes on carbon electrodes.</a> Carbon Energy. 5 (11), e411(2023).</li>
<li>Rosa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+PEG+diacrylates+%28PEGDA%29+generates+hybrid+Fmoc-FF+hydrogel+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Incorporation of PEG diacrylates (PEGDA) generates hybrid Fmoc-FF hydrogel matrices.</a> Gels. 8 (12), 831(2022).</li>
<li>Balasco, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+materials+based+on+fully+aromatic+peptides%3A+The+impact+of+tryptophan%2C+tyrosine%2C+and+dopa+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Self-assembled materials based on fully aromatic peptides: The impact of tryptophan, tyrosine, and dopa residues.</a> Langmuir. 40 (2), 1470-1486 (2024).</li>
<li>Bolan, F., et al. Intracerebral administration of a novel self-assembling peptide hydrogel is safe and supports cell proliferation in experimental intracerebral haemorrhage. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBolan%2C+F+%22Transl+Stroke+Res%22">Transl Stroke Res</a>. , (2023).</li>
<li>Tsutsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+on+hydrogels+fabricated+from+Ca2%2B+responsive+self-assembling+peptides+functionalized+with+bioactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation on hydrogels fabricated from Ca2+ responsive self-assembling peptides functionalized with bioactive peptides.</a> Bioorg Med Chem. 26 (12), 3126-3132 (2018).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide+hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide hydrogels in regenerative medicine.</a> Gels. 9 (8), 653(2023).</li>
<li>Guan, T., Li, J., Chen, C., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide-based+hydrogels+for+wound+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide-based hydrogels for wound tissue repair.</a> Adv Sci. 9 (10), e2104165(2022).</li>
<li>La, M. S., Di, N. C., Onesto, V., Marasco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+From+design+to+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: From design to biomedical applications.</a> Int J Mol Sci. 22 (23), 12662(2021).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+self-assembled+peptides+as+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in self-assembled peptides as drug carriers.</a> Pharmaceutics. 15 (2), 482(2023).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+pH-responsive+self-assembled+peptide+hydrogel+for+promoted+tumor+cell+uptake+and+enhanced+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Injectable and pH-responsive self-assembled peptide hydrogel for promoted tumor cell uptake and enhanced cancer chemotherapy.</a> Biomater Sci. 10 (3), 854-862 (2022).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomembrane+induced+in+situ+self-assembly+of+peptide+with+enhanced+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Biomembrane induced in situ self-assembly of peptide with enhanced antimicrobial activity.</a> Biomater Sci. 8 (7), 2031-2039 (2020).</li>
<li>Shao, T., Falcone, N., Kraatz, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+peptide+gels%3A+Influencing+properties+by+metal+ion+coordination+and+their+wide-ranging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Supramolecular peptide gels: Influencing properties by metal ion coordination and their wide-ranging applications.</a> ACS Omega. 5 (3), 1312-1317 (2020).</li>
<li>Abul-Haija, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative%2C+ion-sensitive+co-assembly+of+tripeptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Cooperative, ion-sensitive co-assembly of tripeptide hydrogels.</a> Chem Commun. 53 (69), 9562-9565 (2017).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-ion-mediated+self-assembly+of+forky+peptides+for+prostate+cancer-specific+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-ion-mediated self-assembly of forky peptides for prostate cancer-specific drug delivery.</a> Chem Commun. 54 (37), 4673-4676 (2018).</li>
<li>Apostolopoulos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Global+review+on+short+peptides%3A+Frontiers+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Global review on short peptides: Frontiers and perspectives.</a> Molecules. 26 (2), 430(2021).</li>
<li>Zhang, R. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+characterization+and+mechanical+properties+of+self-assembled+peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Rheological characterization and mechanical properties of self-assembled peptide hydrogels.</a> Soft Matter. 15 (11), 2370-2380 (2019).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+nanomaterials%3A+Self-assembly%2C+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioact+Mater%22%5BJournal%5D)">Peptide-based nanomaterials: Self-assembly, properties and applications.</a> Bioact Mater. 11, 268-282 (2021).</li>
<li>Sedighi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+self-assembled+peptide+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Multifunctional self-assembled peptide hydrogels for biomedical applications.</a> Polymers (Basel). 15 (5), 1160(2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W ciągu ostatnich kilku dekad, po odkryciu samoorganizujących się sekwencji peptydowych pochodzących z białek amyloidowych, zaprojektowano wiele samoorganizujących się peptydów w oparciu o ich właściwości, wykazując znaczny potencjał zastosowań w biomedycynie i materiałoznawstwie19. Hydrożele peptydowe wykazały wyjątkowe zdolności biofunkcjonalizacji w hodowli tkankowej, dostarczaniu leków i leczeniu nowotworów20.
W artykule opisano proste i szybkie metody przygotowania trzech rodzajów hydrożeli peptydowych: odpowiedź pH, dodawanie jonów metali i wymiana rozpuszczalnika. Peptydy samoorganizujące się generują różne oddziaływania niekowalencyjne w oparciu o charakterystykę ich sekwencji, przy czym dominującą siłą są oddziaływania hydrofobowe, a następnie oddziaływania elektrostatyczne. Interakcje te skutkują różnymi właściwościami samoorganizacji i sprzyjają przejściu ze stanu rozpuszczalnego do nierozpuszczalnego. Na przykład zarówno aminokwasy, jak i peptydy mają określone punkty izoelektryczne, w których ich rozpuszczalność jest minimalna. Gdy pH znacznie odbiega od ich punktu izoelektrycznego, ich rozpuszczalność wzrasta, umożliwiając samoorganizację. Tak więc dostosowanie pH roztworu może wywołać samoorganizację niektórych peptydów13. Jednak peptydy z wysoce polarnymi punktami izoelektrycznymi mogą wykazywać niestabilne struktury i są podatne na deamidację lub hydrolizę.
W tworzeniu hydrożeli peptydowych indukowanych przez jony metali, peptydy zazwyczaj zawierają ujemnie naładowane aminokwasy, takie jak kwas glutaminowy i kwas asparaginowy. Peptydy te mogą łączyć się za pomocą jonów metali jako mostków pod wpływem jonów metali dwuwartościowych, wywołując w ten sposób samoorganizację. Alternatywnie, peptydy z resztami histydyny mogą tworzyć wiązania koordynacyjne z niektórymi kationami metali dwuwartościowych, indukując samoorganizację. Jony metali ułatwiają samoorganizację peptydów poprzez zmniejszenie odpychania elektrostatycznego między peptydami i zwiększenie ich wzajemnego przyciągania, co prowadzi do powstania hydrożeli peptydowych14. Chociaż ta metoda jest odpowiednia do zastosowań, które wymagają określonych jonów metali, może nie być konieczna w większości warunków fizjologicznych, a jonów metali nie można łatwo usunąć.
Niektóre wysoce hydrofobowe peptydy są najpierw rozpuszczane w rozpuszczalnych w wodzie rozpuszczalnikach organicznych, a następnie dodawane do pierwotnie nierozpuszczalnej fazy wodnej w celu szybkiego utworzenia hydrożeli peptydowych. Jednak wiele rozpuszczalników organicznych może mieć szkodliwy wpływ na zastosowania biologiczne, zwłaszcza przy wyższych stężeniach. Metody opisane w niniejszym dokumencie są stosowane w szczególności do peptydów samoorganizujących się. Peptydy są projektowane w oparciu o wyżej wymienione mechanizmy wyzwalające, aby osiągnąć pożądane funkcje biologiczne przy jednoczesnej minimalizacji działań niepożądanych.

Poprzez projektowanie sekwencji peptydowych, niekowalencyjne interakcje między peptydami wywołują samoorganizację, prowadząc do powstania uporządkowanych struktur mikro- i nanometrowych, w tym nanorurek, nanowstążek, nanowłókien i struktur sferycznych1. Po samodzielnym złożeniu w mikro- i nanometrowe włókna/wstęgi, struktury te makroskopowo wykazują właściwości hydrożelowe. Samoorganizujące się hydrożele peptydowe różnią się od hydrożeli polimerowych tym, że samoorganizują się poprzez oddziaływania niekowalencyjne, ich forma żelowa jest odwracalna i łatwo reagują na określone warunki przejścia między fazą roztworu i żelu2. Na przykład, peptydy aminokwasów aromatycznych mogą być indukowane do żelatynizacji w oparciu o przełączanie rozpuszczalników3,4,5, peptydy RADA16 tworzą żele poprzez kationowe i anionowe oddziaływania elektrostatyczne6, a peptyd E1Y9 jest indukowany do tworzenia hydrożelu za pomocą jonów Ca2+7. Naturalne aminokwasy mogą być metabolizowane przez organizm ludzki i oferują doskonałą biokompatybilność, cechę, której hydrożele polimerowe nie mogą osiągnąć8. Białka to cząsteczki, które pełnią funkcje biologiczne, a różnice w sekwencjach peptydowych tworzą ich specyficzne funkcje biologiczne. Dlatego osadzenie określonych biofunkcjonalnych sekwencji peptydowych i nadanie im właściwości samoorganizujących się może zaprojektować samoorganizujące się hydrożele peptydowe o unikalnych funkcjach biologicznych i morfologiach9,10,11. W artykule przedstawiono trzy metody przygotowania hydrożeli peptydowych, w których proces żelowania jest wywoływany przez reakcję środowiska. Pokrótce omówiono również metody charakterystyki właściwości mechanicznych i morfologii hydrożeli peptydowych.
pH reguluje ładunek aminokwasów, wywołując żelowanie niektórych peptydów. Na przykład dodatnio naładowane aminokwasy (np. arginina, lizyna, histydyna) są regulowane przez pH w celu osiągnięcia stanu dodatniego lub obojętnego. Ujemnie naładowane aminokwasy są regulowane przez pH w celu osiągnięcia stanu ujemnego lub obojętnego, oddalając się od swojego punktu izoelektrycznego, a tym samym zmieniając ich hydrofilowość w roztworach wodnych. Dlatego kontrolowanie oddziaływań elektrostatycznych i hydrofobowych między peptydami ułatwia ich uporządkowany samoorganizowanie. Zhang i in. zaprojektowali amfifilowy, samoorganizujący się peptyd reagujący na pH, sprzężony z metotreksatem KKFKFEFEF, który reaguje na lekko kwaśne środowisko zarówno in vitro, jak i in vivo, umożliwiając przejście fazowe zol do żelu. Prowadzi to do wydajnego wychwytu komórkowego i endocytozy, dostarczając w ten sposób leków przeciwnowotworowych i poprawiając skuteczność chemioterapii12. Shen et al.13 zaprojektowali peptyd FF8 (KRRFFRRK), który łatwo sam się organizuje we włókna przy pH wyższym niż 9,4. W neutralnych warunkach mikroorganizmy neutralizują swoje ładunki dodatnie w wyniku oddziaływań elektrostatycznych z ujemnie naładowanymi błonami fosfolipidowymi, koordynując się z cząsteczkami fosfolipidów w celu samoorganizacji, powodując pęknięcie błony i wzmacniając działanie bakteriobójcze13.
Wywoływanie supramolekularnego samomontażu peptydów w hydrożele za pomocą metali koordynacyjnych jest stosunkowo rzadką metodą14. Kiedy jony metali oddziałują elektrostatycznie z peptydami, tworzą mostki solne, które łączą cząsteczki peptydów, prowadząc do oddziaływań niekowalencyjnych i samoorganizacji, co skutkuje właściwościami żelowania. Na przykład Abul-Haija et al.15 zaprojektowali tripeptyd FFD, który przechodzi z cieczy w hydrożel po dodaniu jonów miedzi. Tao i wsp.16 opracowali kwas glutaminowy i peptyd bogaty w fenyloalaninę E3F3, który samoorganizuje się w włókniste hydrożele w obecności jonów i jest używany do dostarczania leków na prostatę.
Powstawanie hydrożeli peptydowych powodujące wymianę rozpuszczalnika jest najczęstszym warunkiem wyzwalania samoorganizacji supramolekularnej. Po rozpuszczeniu peptydów hydrofobowych w rozpuszczalnikach organicznych, ich grupy hydrofobowe są w pełni odsłonięte. Po przeniesieniu do fazy wodnej grupy hydrofobowe zbliżają się do siebie, a cząsteczki wody ułatwiają tworzenie peptydowych wiązań wodorowych, co prowadzi do szybkiej samoorganizacji i łatwego tworzenia hydrożeli. Na przykład Zhang et al.17 zaprojektowali peptyd, który mógł stabilnie rozpuszczać się w wysokich stężeniach w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, a po rozcieńczeniu wodą samoorganizować się w struktury β-arkuszowe, tworząc hydrożele z włókien peptydowych. Shen et al.13 zaprojektowali redukcyjny peptyd ECF-5 (ECAFF), wstępnie rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie wstrzyknięty do fazy wodnej w celu utworzenia redukcyjnego hydrożelu, używanego do celowego usuwania reaktywnych form tlenu wytwarzanych przez niedokrwienie-reperfuzję, które następnie rozkładały się do roztworu po zmiataniu.
To badanie wybrało trzy proste, szybkie i wysoce uogólnione strategie przygotowania hydrożelu peptydowego na podstawie wcześniejszych doświadczeń: (1) metoda odpowiedzi pH: peptydy są rozpuszczane w roztworze o pH dalekim od ich punktu izoelektrycznego, a następnie pH jest dostosowywane do blisko punktu izoelektrycznego. Ta zmiana pozwala niektórym samoorganizującym się peptydom tworzyć włókna i tworzyć hydrożele peptydowe; (2) Metoda dodawania jonów metali: kationy koordynacyjne dodaje się do rozpuszczalnych w wodzie, ujemnie naładowanych peptydów samoorganizujących się. Chelatacja koordynacyjna metali między peptydami prowadzi do ich samoorganizacji w hydrożele; (3) Metoda wymiany rozpuszczalnika: peptydy o wysokim stężeniu rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych, a następnie rozcieńcza do fazy wodnej, wywołując żelowanie.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Aladyn</td><td>A107147</td><td>/</td></tr><tr><td>Mikroskopia sił atomowych</td><td>Wielomodowy nanoskop Bruker</td><td>VIII</td> <td>/</td></tr> <tr><td>CaCl 2</td> <td>Aladyn</td><td>C290953</td> <td>/</td></tr> <tr><td>Difenyloalanina (FF)</td> <td>Chiński peptyd</td><td>konfigurowalny</td><td>Czystość > 95%</td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34869</td><td>/ </td></tr><tr><td>Peptydy ECF-5 Sekwencja</td><td>chińskich peptydów</td><td>: ECAFF</td><td>Czystość > 95%</td></tr> <tr><td>Kwas solny</td><td>Aladyn</td><td>H399657&nbsp;</td><td>/</td></tr><tr><td>Mica</td><td>Sigma-aldrich</td><td>AFM-71856-02</td><td>/</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Aladdin</td><td>P492453</td><td>/</td></tr><tr><td>Reometr</td><td>Anton Paar GmbH</td><td>MCR302</td><td>/</td></tr><tr><td>Wsporniki krzemowe</td><td>MikroMasch</td><td>XSC11</td><td>/</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Aladdin</td><td>C111549</td><td>/</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Aladdin</td><td>S140903</td><td>/ </td></tr><tr><td>TRIS Chlorowodorek</td><td>Aladdin</td><td>T431531</td><td>/</td></tr></tbody></table>

przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Hydrożele peptydowe to wysoce hydrofilowe, trójwymiarowe żele sieciowe powstałe w wyniku samoorganizacji nanowłókien lub polimerów, tworzących sieci blokujące wodę. Ich morfologia jest bardzo podobna do morfologii macierzy zewnątrzkomórkowej, dzięki czemu mogą wykazywać zarówno biologiczne funkcje peptydów, jak i responsywne właściwości żelowania. Te unikalne cechy doprowadziły do ich szerokiego zastosowania w inżynierii tkankowej, trójwymiarowych hodowlach komórkowych, terapii nowotworów, medycynie regeneracyjnej i innych dziedzinach biomedycznych. W artykule opisano trzy metody wytwarzania hydrożeli peptydowych ECF-5 przy użyciu samoorganizujących się peptydów z procesami żelowania reagującymi na środowisko: (1) żelowanie reagujące na pH: różne poziomy pH indukują protonację lub deprotonację reszt aminokwasowych, zmieniając oddziaływania elektrostatyczne między cząsteczkami peptydów i promując ich samoorganizację w hydrożele; (2) Dodatek jonów metali: chelat wielowartościowych jonów metali z ujemnie naładowanymi resztami aminokwasowymi, działającymi jako mostki między peptydami, tworząc hydrożel sieciowy; (3) Wymiana rozpuszczalnika: peptydy hydrofobowe są początkowo rozpuszczane w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, a następnie indukują samoorganizację w hydrożele po przejściu do polarnego środowiska wodnego. Metody te wykorzystują konwencjonalne procedury eksperymentalne w celu ułatwienia samoorganizacji peptydów w hydrożele. Projektując sekwencje peptydowe w taki sposób, aby dostosowały się do określonych warunków indukujących żelowanie, możliwe jest uzyskanie precyzyjnie dostrojonych mikro/nanostruktur i funkcji biologicznych, podkreślając znaczący potencjał hydrożeli peptydowych w dziedzinie biomedycyny.

Trzy opisane w niniejszym artykule metody przygotowywania hydrożeli peptydowych umożliwiają szybką, niedrogą i prostą produkcję. Funkcja hydrożelu jest zależna od jego sekwencji peptydowej. W niniejszej pracy wykorzystano peptyd ECF-5 jako reprezentatywny przykład w celu zademonstrowania jego właściwości fizycznych, w tym morfologii mikroskopowej oraz właściwości mechanicznych.
Jak pokazano w Rycina 1A i Rycina uzupełniająca 1peptyd ECF-5 zawiera sekwencję przypominającą glutation oraz sekwencję difenylalaniny, co nadaje mu właściwości redukujące typowe dla glutationu oraz zdolność do samoorganizacji. Peptyd ECF-5 uprzednio rozpuszczono w DMSO, a następnie szybko zmieszano z roztworem wodnym. Na tym etapie peptyd uległ szybkiej samoorganizacji, tworząc w ciągu kilku minut stały żel. Gdy końcowe stężenie peptydu przekracza 1%, żel można podnieść pęsetą.
Obrazowanie powierzchni żelu za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) ujawniło sieć licznych włókien peptydowych z gęstymi porami zatrzymującymi wodę. Po rozcieńczeniu morfologia pojedynczych włókien, pokazana na Rysunku 1D, wykazuje wysokość około 3,5 nm, tworząc wysoce spójne, szersze pasma włókien. Jest to zgodne z morfologią włókien obserwowaną w sieci żelu. Dodatkowo, w warunkach neutralnych, kationy wapnia mogą również indukować tworzenie hydrożelu z peptydów, choć proces ten przebiega stosunkowo wolniej i prowadzi do powstania miększego żelu.
Makroskopowe zachowanie hydrożeli przygotowanych przy użyciu trzech metod – odpowiedzi na pH, dodawania metalu i wymiany rozpuszczalnika – przedstawiono na Rysunku 2A. W porównaniu z wodą dejonizowaną wszystkie hydrożele wykazywały właściwości półstałe. Reologia jest powszechnie stosowana do odróżniania hydrożeli od soli.
Makroskopową wiskoelastyczność hydrożeli ECF-5 otrzymanych za pomocą tych trzech metod żelowania porównano z wykorzystaniem technik reologicznych. Jak pokazano na Rysunku 2, hydrożel ECF-5 wykazywał wiskoelastyczność charakterystyczną dla typowych hydrożeli. Przedstawiono zależność między modułem zachowawczym (G') a modułem strat (G'') przy różnych częstotliwościach dla odkształcenia wynoszącego 0,3%. Hydrożel ECF-5 wykazał słabą korelację z częstotliwością. Moduł zachowawczy (G') hydrożeli otrzymanych trzema metodami wynosił około 10 kPa, co jest około 10 razy większe niż moduł strat (G''), co wykazało typowe właściwości półstałych hydrożeli (Rysunek 2B). Wskazuje to, że hydrożele ECF-5, niezależnie od metody przygotowania, wykazują typową dla hydrożeli wiskoelastyczność.
Wykresy modułu zachowawczego (G') i modułu strat (G'') w funkcji poziomu odkształcenia przy 10 rad/s (Rycina 2C) wykazały, że zarówno G', jak i G'' pozostawały niemal stałe w zakresie odkształcenia od 0,1% do 10%, przy czym G' był około 10 razy wyższy niż G''. Sugeruje to, że hydrożele ECF-5 są typowymi hydrożelami wiskoelastycznymi zdolnymi do wytrzymywania naprężeń.
<img alt="Struktura peptydów, mikroskopia włókien; wykresy przedstawiają montaż w nanoskali, analizę nanostruktury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67267/67267fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Hydrożele peptydowe ECF-5. (A) Struktura chemiczna ECF-5. (B) Morfologia makroskopowa hydrożelu peptydowego ECF-5 przy stężeniu 1%. (C) Mikrostruktura powierzchni hydrożelu. (D) Morfologia mikroskopowa włókien peptydowych ECF-5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/67267fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Reologia hydrożeli; wykres częstotliwości, odkształcenia względem modułu; wpływ pH, DMSO i Ca²⁺." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67267/67267fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Makroskopowa morfologia i charakterystyka reologiczna hydrożeli. (A) Makroskopowa morfologia hydrożeli w trzech różnych warunkach indukcji hydrożelu, przy końcowym stężeniu peptydu ECF-5 wynoszącym 3 mg/mL. Zależność modułu zachowawczego (G') i modułu strat (G'') od częstotliwości (B) oraz odkształcenia (B) dla hydrożelu ECF-5 w trzech warunkach indukcji przy stężeniu 1%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/67267fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Analiza LC-MS peptydu ECAFF. (A) Pik w czasie retencji 13,238 min jest pikiem produktu. Eluat z kolumny monitorowano przy 220 nm i szybkości przepływu 1 mL/min z zastosowaniem 0,1% kwasu trifluorooctowego w 100% acetonitrylu. Wydajność ECF-5 wynosi 97,33%. (B) Spektrometria mas ESI potwierdza, że masa cząsteczkowa ECF-5 wynosi 616,1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67267/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

Moje badania dotyczące funkcjonalizacji peptydów, koncentrujące się na samoorganizacji, biofunkcjonalizacji włókien, hydrożelach i odpowiedzialnych separacjach. Ten film opisuje, w jaki sposób peptydy ECF-5 samoorganizują się w odpowiedzi na zmiany środowiskowe i proces wytwarzania hydrożeli peptydowych. W porównaniu z tradycyjnymi hydrożelami polimerowymi, hydrożele peptydowe są przeznaczone do różnych biofunkcji dziedzinowych i oddzielnej biokompatybilności, co zwiększa ich potencjał w dziedzinach takich jak inżynieria biomedyczna i biomateriały.Przełomy technologiczne w tej dziedzinie koncentrowały się na poprawie wydajności samoorganizacji i biofunkcjonalizacji. obejmują hydrożele peptydowe z aminokwasami nienaturalnymi, szybszymi punktowymi lekami chemicznymi i elucjącją, wzmacniając w ten sposób ich cele związane z tworzeniem leków i biofunkcjonalnymi. Obecna metoda tworzenia leków peptydowych ma wysokie wymagania eksperymentalne i nie jest uniwersalna.Opracowanie metod samoorganizowania się hydrożeli przy użyciu wspólnych operacji i regionów będzie lepiej wspierać powszechne stosowanie hydrożeli peptydowych. Używając peptydu ECF-5, dodaliśmy fazę trzecią, uogólniliśmy metody wapnia reagujące na środowisko. Ta metoda obracania powierzchni i właściwości peptydu.Dodajemy projekt innego samoorganizującego się peptydu z lepszą kontrolą wapnia. Aby rozpocząć metodę odpowiedzi pH na tworzenie hydrożelu, dodaj pięć miligramów peptydów ECF-5 do 400 mikrolitrów wody dejonizowanej i poddaj ją sonikacji w 40 kilohercach przez 30 minut, Dodaj 40 mikrolitrów przefiltrowanego jednomolowego wodorotlenku sodu do roztworu peptydu i odwiruj, aby dokładnie wymieszać. Kontynuuj sonikację jeszcze przez 15 minut, aż roztwór całkowicie się wyjaśni.Następnie do przygotowanego roztworu dodaj 60 mikrolitrów kwasu solnego. Po zwirowaniu mieszaniny odstaw ją w temperaturze pokojowej na ponad 30 minut, aby ułatwić tworzenie hydrożelu. Na początek przygotuj samoorganizujący się roztwór peptydu ECF-5 o stężeniu 10 miligramów na mililitr przy użyciu odpowiedniego buforu.Sonikować mieszaninę, aby rozpuścić peptyd i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotuj 50 miligramów na mililitr roztworu chlorku wapnia za pomocą wody dejonizowanej. Dodać 40 mikrolitrów roztworu chlorku wapnia do 460 mikrolitrów roztworu peptydu ECF-5.Wirować, aby dokładnie wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez ponad dwie godziny. Szybko wprowadź jeden mililitr PBS do dimetylosulfotlenku lub peptydu rozpuszczonego DMSO. Dokładnie zwirować i inkubować w temperaturze pokojowej.Po pięciu minutach dodaj 500 mikrolitrów PBS i odstaw mieszaninę na 15 minut, a następnie wyrzuć supernatant i zachowaj dolny żel. Peptyd ECF-5 wykazywał podobne do glutationu właściwości redukujące i zdolność do samoorganizacji, tworząc stały żel w ciągu kilku minut, gdy stężenie przekroczyło 1%Hydrożel ECF-5 wykazywał właściwości półstałe, gdy został przygotowany przez reakcję pH, dodanie metalu lub wymianę rozpuszczalnika. Na początek przygotuj hydrożele peptydowe odpowiednią metodą.Nałożyć dwustronny klej, aby usunąć warstwę miki i przykleić powierzchnie miki za pomocą roztworu APTES i odstawić na pięć minut. Przed użyciem dokładnie spłucz powierzchnie miki czystą wodą. Rozcieńczyć hydrożel i dokładnie go wymieszać przed upuszczeniem na zmodyfikowaną powierzchnię miki w celu absorpcji statycznej.Po pięciu minutach spłucz powierzchnię czystą wodą i wysusz. Mikroskopia sił atomowych ujawniła, że powierzchnia żelu miała liczne włókna peptydowe z gęstymi porami zatrzymującymi wodę, a pojedyncze włókna tworzyły spójne, szersze pasma włókien o wysokości około 3,5 nanometra.

preparation-of-mechanically-stable-self-assembled-peptides-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Prezentujemy syntezę hydrożelu białkowego, w którym pośredniczy rozszczepiona inteina. Budulcem tego hydrożelu są dwa kopolimery białkowe, z których każdy zawiera podjednostkę białka trimerycznego, która służy jako środek sieciujący i połowę rozszczepionej inteiny. Zmieszanie dwóch kopolimerów białkowych wyzwala reakcję splicingu trans-inteinowego, w wyniku której powstaje jednostka polipeptydowa, która samoorganizuje się w hydrożel. Ten hydrożel jest wysoce stabilny pod względem pH i...

Synteza sztucznego hydrożelu białkowego za pośrednictwem inteiny

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Poznaj metody przygotowania stabilnych mechanicznie hydrożeli peptydowych poprzez samoorganizację wywołaną zmianami środowiskowymi. Technika ta umożliwia tworzenie biomateriałów o zastosowaniu w inżynierii biomedycznej.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Przeglądaj więcej filmów