Name: Sztuczne urządzenie płucne do szczepienia powierzchni wiązki włókien in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę powlekania polimerem zoura włókien płucnych do ECMO w celu zmniejszenia adsorpcji białek i zapobiegania powstawaniu zakrzepów. Technika ta poprawia bezpieczeństwo urządzeń medycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez umowę o świadczenie usług w ramach NIH 1R01HL140231-01A1.

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Uniwersytetu New Haven.
1. Powłoka obwodu sztucznego płuca
UWAGA: Sztuczny obwód płuc został pokryty dwuetapowym metodą szczepienia metodą zwitterionic DOPA-SBMA. Szczegóły wiązki światłowodów/dotleniacza są informacjami zastrzeżonymi. W eksperymentach, w których skupiono się na wpływie przepływu na działanie przeciwporostowe powlekanego płuca, dotleniacz i obwód rurki (rurka Tygon 5/16" z sprzężonymi łącznikami poliwęglanowymi) poddano 24-godzinnemu przepływowi soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; pH 7,34, temp. ~37 °C) ograniczonemu maksymalnym natężeniem przepływu naszej pompy wynoszącym 1,22 l/min. Dla porównania, dokładne natężenia przepływu w oksygenatorach zależą od potrzeb pacjenta i konkretnej sytuacji klinicznej, ale zazwyczaj wahają się od 2 do 7 l/min u dorosłych pacjentów. PBS został użyty w tym przypadku, aby umożliwić łatwe ilościowe określenie kluczowego markera krzepnięcia krwi zanieczyszczającego włókna powlekane po przepływie. Wszelkie zakłócające skutki zanieczyszczenia krwi pełnej, gdyby do oceny wpływu szybkości ścinania na aktywność przeciwporostową włókien powlekanych, zostały wyeliminowane przy użyciu PBS. Do pokrycia sztucznego płuca zastosowano następujące etapy:
<ol>
	<li>Oczyść obwód płuc poprzez recyrkulację 30% metanolu w wodzie dejonizowanej (DI) przez 20 minut, a następnie recyrkulację 10% metanolu w wodzie dejonizowanej i wodzie demineralizowanej przez 20 minut.</li>
	<li>Osuszyć obwód przefiltrowanym powietrzem domowym o niskim przepływie przez 2 godziny przed ekspozycją na plazmę ozonolizy ultrafioletowej (UVO).</li>
	<li>Umieść oczyszczony obwód płuc w generatorze plazmy UVO (UVO-Cleaner), zamknij go i włącz przyrząd generatora plazmy UVO do interakcji plazmy z urządzeniem na 20 minut.</li>
	<li>Po ekspozycji na plazmę urządzenie powinno niezwłocznie przejść do etapu powlekania, aby ograniczyć przegrupowanie łańcucha powierzchniowego i ukrywanie reaktywnych miejsc powstałych w wyniku interakcji plazmy.</li>
	<li>Podczas modyfikacji powierzchni urządzenia należy przygotować świeży roztwór powłoki. W 600 ml buforu TRIS (pH 8,5) rozpuść 1,2 g dopaminy-HCl, a następnie rozpuść monomer metakrylanu sulfobetainy (SBMA) w stosunku 1:15 DOPA:SMBA.</li>
	<li>Dodać 5 mM kropelek periodianu sodu (20 μl) do roztworu powlekającego i wymieszać. Użyj szklanej zlewki, mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej przy 150 obr./min, aby ułatwić mieszanie. 
	UWAGA: Roztwór powlekający należy dodać do urządzenia nie później niż 20 minut po przygotowaniu. Dlatego, jeśli powlekanych jest wiele płuc, pomocny może być łatwy sposób zalewania urządzeń - na przykład użycie pomp do zalewania.</li>
	<li>Zalać urządzenie płucne roztworem powlekającym za pomocą strzykawki o dużej objętości (60 cm³) w celu pobrania i napełnienia obwodu. Po zaciśnięciu jednego końca obwodu, zalać go od drugiego, upewniając się, że pęcherzyki powietrza mogą być wyprowadzone z obwodu przez złącze dostępu do obwodu.</li>
	<li>Po całkowitym zalaniu umieść urządzenie pod źródłem światła UV na 2 godziny i mieszaj roztwór, zmieniając orientację końców zalanego urządzenia w górę iw dół co 10 minut.</li>
	<li>Po obróbce światłem UV opróżnij obwód i delikatnie przepłucz wszystkie próbki wodą dejonizowaną (DI), zalewając strzykawką o pojemności 60 ml i kilkakrotnie opróżniając. Gdy ścieki z płukanki DI są czyste, przechowuj urządzenie zalane wodą DI w lodówce o temperaturze 4 °C do autopsji i analizy powierzchni.</li>
</ol>
2. Sekcja zwłok płuc
<ol>
	<li>Opróżnij i osusz obieg płuc z przefiltrowanym i delikatnym przepływem powietrza w kapturze chemicznym.</li>
	<li>Wykonaj autopsję urządzenia, mocując je w imadle stołowym z obrotową podstawą. Za pomocą piły taśmowej przeciąć połączenia wlotowe/wylotowe z obudową urządzenia oraz przednią i tylną płytą czołową obudowy, ostrożnie przecinając wzdłuż ich obwodów za pomocą przemysłowego noża X-acto i młotka.</li>
	<li>Po zdjęciu płyt czołowych dostępne są warstwy maty z włókna. Ostrożnie przekrój włókna, aby uzyskać dostęp do próbek maty włóknistej w dowolnym miejscu w wiązce (np. na powierzchni i wewnątrz). Chwytaj próbki pęsetą na ich krawędziach i przenieś je do probówek o pojemności 60 ml wypełnionych wodą dejonizowaną, aby ograniczyć zanieczyszczenie próbki.</li>
</ol>
3. Ocena zanieczyszczenia białek na powlekanych materiałach obwodów płucnych
<ol>
	<li>Test adsorpcji fibrynogenu.
	<ol>
		<li>Inkubować standaryzowane próbki matowe z włókien w 1 ml 3 mg/ml fibrynogenu w dołkach przez ponad 90 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 60 obr./min.</li>
		<li>Przemyć (3x) próbki buforem PBS, przenieść je do nowych studzienek i dodać 1 ml 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdej studzienki. Inkubować przez kolejne 90 minut, a następnie ponownie przemyć buforem PBS (3x) i przenieść próbki do nowych studzienek.</li>
		<li>W nowych studzienkach dodać 1 ml rozcieńczenia 1:1000 przeciwciała fibrynogenu sprzężonego z peroksydazą chrzanowa (HRP) w PBS do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut. Następnie przepłukać (3x) próbki buforem PBS i przenieść je do nowych studzienek.</li>
		<li>W nowych studzienkach dodać 500 μl 1 mg/ml o-fenylenodiaminy (OPD) do 0,1 M buforu cytrynianowo-fosforanowego z 0,03% nadtlenkiem wodoru, pH 5,0 w odstępach 30 s i inkubować z dala od światła przez 30 minut.</li>
		<li>Zatrzymać reakcję peroksydazy i OPD, dodając 500 μl 1 N HCL do każdego dołka.</li>
		<li>Usunąć i przenieść supernatant z każdej studzienki do kuwety. Zmierzyć absorbancję supernatantu za pomocą spektrofotometru UV widzialnego przy długości fali 492 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test adhezji płytek krwi.
	<ol>
		<li>Rozmrażać zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) przez 20 minut.</li>
		<li>Podczas rozmrażania należy przygotować zbiorcze osocze dorosłego człowieka w celu uzyskania osocza bogatego w płatki (PRP).</li>
		<li>Aby przygotować PRP, odwiruj rozmrożone probówki z próbkami ludzkiego osocza przy twardym wirowaniu przy 483 x g, aby rozdzielić osocze na dwa regiony, w których dolna jedna trzecia to PRP, a górne dwie trzecie probówki będą zawierać osocze ubogie w płytki krwi (PPP).</li>
		<li>Usunąć granulki płytek krwi utworzone na dnie probówki, jak również górne dwie trzecie odwirowanego osocza krwi i rozproszyć osad w górnych dwóch trzecich osocza, delikatnie potrząsając probówkami.</li>
		<li>Dodać chlorek wapnia (0,2 M) do PRP (1:1 v/v), aby odwrócić działanie cytrynianów przed badaniem.</li>
		<li>Próbki inkubować (~1 cm x 1 cm) w 500 μl PRP przez 90 minut w temperaturze 37 °C, następnie trzykrotnie przepłukać buforem PBS i przenieść je do nowych studzienek.</li>
		<li>Dodać 300 μl PBS i 10 μl 10x buforu do lizy i inkubować przez 45 minut.</li>
		<li>Dodać 50 μl mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez 30 minut z dala od światła.</li>
		<li>Dodaj 50 μl HCL, aby zatrzymać dobre reakcje.</li>
		<li>Aby wykryć aktywność LDH lizatów z zaadsorbowanych płytek krwi, należy zmierzyć absorbancję światła za pomocą opracowanych roztworów studzienkowych o długości fali 490 nm i 680 nm i odjąć odczyt 680 nm od 490 nm, aby przeanalizować adhezję płytek krwi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wpływ przepływu na działanie przeciwporostowe
<ol>
	<li>Zalać obwód sztucznego płuca PBS i upewnić się, że nie ma wycieków. Następnie przymocuj obwód do pompy rolkowej i recyrkuluj PBS przez 24 godziny 
	UWAGA: Przepływ na poziomie 1,22 l/min był najwyższym możliwym do osiągnięcia.</li>
	<li>Aby zasymulować normotermiczną temperaturę krwi, która przepływałaby przez urządzenie płucne, należy inkubować sztuczne płuco w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C podczas recyrkulacji.</li>
	<li>Następnie należy przeprowadzić autopsję płuc i badania prowokacyjne zanieczyszczenia białkami, jak opisano powyżej. 
	UWAGA: Jednoczynnikowa analiza wariancji została użyta do określenia, czy istnieją statystycznie istotne różnice między średnimi grup niezależnych, a HSD Tukeya użyto do określenia, które konkretne grupy się różnią.</li>
</ol>

Zwitterionic Polymer Grafts for Antifouling in Artificial Lung Fiber Bundles

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych. Dr Keith Cook i dr David Skoog posiadają udziały w ART LLC.

Włókna polipropylenowe (PP) powlekane PDMS w sztucznym płucu wykazały związek między ekspozycją na ozon a strukturą włókien, ustalając granicę uczulenia dla plazmy ultrafioletowej ozonu. Limit ten określa czasy ekspozycji potrzebne do wytworzenia rodników powierzchniowych do szczepienia materiałów powłokowych, w szczególności polidopaminy i metakrylanu polisulfobetyny. Gdy włókna były wystawione na działanie plazmy ozonowej ultrafioletowej przez mniej niż 20 minut, nie zaobserwowano żadnych znaczących zmian strukturalnyc...

Sztuczne włókna płucne, znane również jako membrany z pustych włókien, są niezbędnymi materiałami do produkcji urządzeń do pozaustrojowego natleniania membranowego (ECMO), które zapewniają wspomaganie oddychania krytycznie chorym pacjentom. Wiele warstw tych włókien tworzy gęstą wiązkę, która służy jako jednostka wymiany gazowej. Powierzchnia włókna polimerowego aktywuje jednak kaskadę krzepnięcia krwi - prowadząc do tworzenia się skrzepów (zakrzepicy). Zakrzepica na sztucznych powierzchniach jest napędzana przede wszystkim przez aktywację kaskady krzepnięcia, złożonej serii reakcji enzymatycznych, które prowadzą do powstania skrzepu krwi. Gdy krew wchodzi w kontakt z ciałami obcymi, takimi jak te w wyrobach medycznych (np. sztuczne płuca, stenty, cewniki), wyzwalana jest kaskada krzepnięcia1,2. Proces ten rozpoczyna się od wystawienia krwi na powierzchnię sztucznego materiału, który aktywuje wewnętrzną ścieżkę kaskady. Ta aktywacja prowadzi do wytworzenia trombiny, kluczowego enzymu, który przekształca fibrynogen w fibrynę, tworząc strukturalną podstawę skrzepu. Jednocześnie płytki krwi są aktywowane i agregują się w tym miejscu, dodatkowo wzmacniając skrzep. Rezultatem jest zakrzepica, która może utrudniać przepływ krwi i prowadzić do poważnych powikłań, takich jak udar lub zawał mięśnia sercowego.
Aby zapobiec zakrzepicy na sztucznych powierzchniach, powszechnie stosuje się tradycyjne antykoagulanty, takie jak heparyna, warfaryna i nowsze bezpośrednie doustne antykoagulanty (DOAC)3,4. Leki te działają poprzez zakłócanie różnych etapów kaskady krzepnięcia. Na przykład heparyna zwiększa aktywność antytrombiny III, naturalnego inhibitora trombiny, podczas gdy warfaryna hamuje syntezę czynników krzepnięcia zależnych od witaminy K. Jednak stosowanie antykoagulantów wiąże się z kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, zwiększają ryzyko krwawienia, które w niektórych sytuacjach może zagrażać życiu. Po drugie, skuteczność leków przeciwzakrzepowych może być zmienna, co wymaga regularnego monitorowania i dostosowywania dawki, szczególnie w przypadku warfaryny. Ponadto długotrwałe stosowanie leków przeciwzakrzepowych wiąże się z działaniami niepożądanymi, takimi jak osteoporoza i martwica skóry. Konieczność ogólnoustrojowego leczenia przeciwzakrzepowego ogranicza również stosowanie wyrobów medycznych u pacjentów, którzy są narażeni na wysokie ryzyko krwawienia.
Ponieważ zakrzepica może utrudniać wymianę gazową przez membranę z pustych włókien, na włókna płuc nałożono powłoki przeciwporostowe przy użyciu różnych metod, takich jak powlekanie zanurzeniowe i elektroprzędzenie, aby zapobiec biofoulingowi5,6. Producenci sztucznych płuc zazwyczaj przetwarzają puste włókna, które są komercyjnie pozyskiwane od producentów włókien i łączą je w płuca poprzez etapy, w tym wiązanie włókien wokół stałego rdzenia, zalewanie (klejenie) końców wiązek, włączanie zalewowych wiązek do kapsuły obudowy z kanałami przepływu gazu i krwi oraz czyszczenie po montażu. Podczas gdy powłoka włókien, które nie zostały wszczepione do płuc, może być bardziej elastyczna, modyfikacja powierzchni na etapie przed wiązaniem będzie poddana kilku etapom produkcyjnym, które wymagają mechanicznych i chemicznych interakcji między powłoką powierzchniową a dalszymi środowiskami procesu, co może prowadzić do ogołocenia włókien w urządzeniu, w którym wysokie pokrycie powłoką jest niezbędne do ograniczenia zakrzepicy. Alternatywnie powłokę można nałożyć na doniczkową wiązkę. Zaletą możliwości powlekania gotowych płuc jest to, że jest to praktyczne i łatwe podejście do modyfikacji inżynierii powierzchniowej urządzenia do sztucznego płuca i wielu innych urządzeń. Ale ogólnie rzecz biorąc, metoda nakładania powłok, czy to poprzez natryskiwanie, czy powlekanie zanurzeniowe, jest mniej krytyczna dla zapobiegania zakrzepicy niż skuteczność samej powłoki. Na przykład puste włókna stosowane w wyrobach medycznych mogą być powlekane zanurzeniowo podczas wytłaczania, a następnie dziane w maty, zwijane w wiązki i włączane do gotowego urządzenia do sztucznego płuca. Alternatywnie powłoki można nakładać po wyprodukowaniu urządzenia. Kluczowymi czynnikami są jednak skuteczne zastosowanie, trwałość i skuteczność powłoki przeciwzakrzepowej5. Dzieje się tak dlatego, że przy braku ogólnoustrojowej antykoagulacji, funkcja tych powłok jest istotnym elementem układanki zapobiegającej tworzeniu się skrzepów, co wymaga zastosowania wysoce skutecznych i długotrwałych właściwości przeciwporostowych, aby zapewnić skuteczną profilaktykę zakrzepicy.
Pomimo stosowania powłok przeciwzakrzepowych i jednoczesnego podawania niskich dawek antykoagulantów, moduł sztucznego płuca musi być wymieniony dopiero po stosunkowo krótkim okresie użytkowania, od dni do 3 tygodni7,8, z powodu zakrzepicy. Wydajność wymiany gazowej ich membran włóknistych pogarsza się po stosunkowo krótkim czasie z powodu zanieczyszczenia błoniastą strukturą skrzepu krwi (składającą się z fibryny, pojedynczych komórek i klastrów komórek), która pokrywa duże obszary włókien, zwiększając ich barierę dyfuzyjną gazu9. Ogólnie rzecz biorąc, rodzaj powłoki i metoda aplikacji10,11,12,13,14,15,16,17,18 stosowany zależy od pożądanych właściwości, takich jak biokompatybilność i trwałość. Na sztucznych włóknach płuc zastosowano kilka przykładów powłok przeciwporostowych. Należą do nich silikon, który jest szeroko stosowany ze względu na swoją biokompatybilność19, trwałość i odporność na biofouling; poliuretan (PU) ze względu na jego biokompatybilność i odporność na biofouling20; Chitozan ze względu na swoje właściwości biokompatybilne i przeciwdrobnoustrojowe<klasa SUP = "xref">21,< klasa SUP = "xref">22, heparyna, która inaktywuje trombinę<klasa SUP="xref">23,< klasa SUP = "XREF">8, oraz hydrofilowe< klasa SUP = "xref">24 powłoki na bazie polimerów, w tym poli(glikol etylenowy)<klasa SUP="xref">25,<klasa SUP="xref">26, poli (akrylan 2-metoksyetylu)<klasa SUP ="xref">27 i fosforylcholina28,29.
Powłoki jonowe stanowią obiecującą strategię zmniejszania zakrzepicy na sztucznych powierzchniach bez potrzeby stosowania ogólnoustrojowej antykoagulacji5,6. Powłoki te składają się z cząsteczek o ładunkach dodatnich i ujemnych, które równoważą się nawzajem i dają wysoce hydrofilową, niezabrudzoną powierzchnię. Obudnio-jonowy charakter tych powłok zmniejsza adsorpcję białek i adhezję płytek krwi, które są krytycznymi etapami inicjacji kaskady krzepnięcia. Zapobiegając początkowej interakcji między białkami krwi a sztuczną powierzchnią, obojno-jonowe powłoki skutecznie hamują aktywację kaskady krzepnięcia i zmniejszają ryzyko zakrzepicy. Takie podejście nie tylko minimalizuje zapotrzebowanie na ogólnoustrojowe antykoagulanty, ale także oferuje bardziej biokompatybilne rozwiązanie dla długotrwałego stosowania wyrobów medycznych.
W tym badaniu oceniliśmy skuteczność gruntowania sztucznego płuca powłoką z ultra nisko zanieczyszczającego, obojkowo-jonowego poliakrylanu (metakrylanu sulfobetainy) (pSBMA) w połączeniu z warstwą adhezyjną z polidopaminy (pDOPA). Po zagruntowaniu urządzenia, było ono ustawiane na boki co 10 minut przez 2 godziny podczas procesu powlekania. Aby ocenić potencjalne różnice w powłoce na wiązce włókien, zmierzyliśmy zanieczyszczenie fibrynogenem i płytkami krwi na włóknach znajdujących się na powierzchni i w wiązce. Dodatkowo przeanalizowaliśmy wpływ przepływu na działanie przeciwporostowe, porównując dane dotyczące zanieczyszczenia z płuc przed i po ekspozycji na przepływ. W przypadku długotrwałych zastosowań przeciwporostowych obejmujących złożony przepływ mediów, powłoki jonowe muszą nie tylko hamować zanieczyszczenie krwi pełnej - co jest trudnym zadaniem - ale także utrzymywać swoją skuteczność w warunkach stresu hemodynamicznego przez cały okres aplikacji. Powłoki te muszą zapewniać silne odpychanie steryczne przed niespecyficzną adsorpcją białek i osiągać odpowiednią gęstość upakowania powierzchni, aby utworzyć barierę filmu hydratacyjnego między podłożem a złożonymi mediami. Ponadto muszą one pozostać bezpiecznie przymocowane do powierzchni bez odczepiania się łączników zakotwiczających powłokę do podłoża30. Opisany tutaj protokół ma na celu zapewnienie stosowania powłok, które spełniają te krytyczne wymagania dotyczące skutecznej i trwałej ochrony powierzchni.

<table><tbody><tr><td>Zlewki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90094065</td><td>Używany w eksperymentach</td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Coulter Allegra X-30R Beckman</td><td>Coulter</td><td>https://www.mybeckman.in/centrifuges/general-purpose/allegra-x-30</td><td>Do wirowania</td></tr><tr><td>Kaptur ochronny Biochemguard BSL2 Osłona ochronna</td><td>Biochemguard</td><td>https://bakerco.com/images/uploads/assets/BiochemGARD_220v_Web_0.pdf</td><td>Używany jako źródło światła UV w powłoce przeszczepu</td></tr><tr><td>Surowica albuminy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/bovineserumalbumin123459048468</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Cytrynowane osocze krwi męskiej</td><td>ZenBio</td><td>https://www.zen-bio.com/products/serum/human-blood-products.php</td><td>Używany do eksperymenty</td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowo-fosforanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/citrate-phosphate-buffer?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=citrate-phosphate%20buffer&type=product</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Chlorowodorek dopaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h60255</td><td>Do powlekania</td></tr><tr><td>Chlorowodorek dopaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Immunoglobulina kozia sprzężona z fluoresceiną G (IGG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/aq303f</td><td>do pomiarów natężenia światła fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyfibrynogenowe sprzężone z peroksydazą chrzanową</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/horseradish-peroxidase-conjugated-anti-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=horseradish%20peroxidase%20conjugated%20anti-fibrinogen&type=product</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/lab-equipment/hot-plates-stirrers/lab-hot-plates.html</td><td>Używany w eksperymentach</td></tr><tr><td>Ludzki fibrynogen w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/human-fibrinogen?focus=products&page=1&perpage=30&sort=relevance&term=human%20fibrinogen&type=product</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Jelight UVO-Cleaner model 144AX</td><td>Jelight</td><td>https://www.jelight.com/uvo-cleaner/</td> <td>Używany do plazmowej obróbki materiałów wyrobów medycznych</td></tr><tr><td>Zestaw testowy LDH</td><td>ABCAM</td><td>https://www.abcam.com/en-us/products/assay-kits/ldh-assay-kit-lactate-dehydrogenase-assay-kit-colorimetric-ab102526</td><td>Do testu LDH</td></tr><tr><td>O-fenylenodiamina (OPD)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p9029</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Włókna polipropylenowe powlekane PDMS</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>Część sztucznych materiałów płucnych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p4417</td><td>Materiały do oznaczania fibrynogenu</td></tr><tr><td>Czytnik płytek (BioTek)</td><td>BioTek</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/plate-reader-metabolic-assays</td><td>Do odczytu Fluorescencja Natężenie światła</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>Część sztucznych materiałów płucnych</td></tr><tr><td>Periodynian sodu (NaIO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sodiummetaperiodate213897790285</td><td>Dla powłoka</td></tr><tr><td>Wieloprzepływowa pompa rolkowa Stockert Shiley</td><td>Sorin Biomedical</td><td>N/A</td><td>Do eksperymentów przepływowych</td></tr><tr><td>Metakrylan sulfobetainy (SBMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/sulfobetaine-methacrylate-(sbma)</td><td>Do powlekania</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej TRIS (pH 8,5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8793</td><td>Przygotowane w laboratorium z saszetek TRIS</td></tr><tr><td>Rurki Tygon</td><td>ART LLC</td><td>N/A</td><td>Część sztucznych materiałów płucnych</td></tr></tbody></table>

sztuczne urządzenie płucne do szczepienia powierzchni wiązki włókien in situ

Artificial Lung Device Priming for In Situ Fiber Bundle Surface Grafting

Chociaż wysoki stosunek powierzchni do objętości wiązki włókien płucnych zwiększa wymianę gazową, duża powierzchnia, gęste ułożenie i chemia powierzchni włókien są głównymi czynnikami przyczyniającymi się do zakrzepicy. Aby temu zapobiec, konieczna jest jednolita modyfikacja składu chemicznego powierzchni, aby skutecznie zmniejszyć niespecyficzne zanieczyszczenie białkami, co może pomóc w ograniczeniu zakrzepicy i zmniejszyć ryzyko choroby zakrzepowo-zatorowej lub krwawienia spowodowanego przez ogólnoustrojowe leki przeciwzakrzepowe.
W tym badaniu badaliśmy zastosowanie i właściwości przeciwporostowe szczepów polimerowych na wiązkach włókien polipropylenowych. Proces szczepienia polegał na zalaniu sztucznego płuca obojoobojnymi cząsteczkami polisulfobetyiny i łącznikami polidopaminy do powlekania in situ. Skuteczność przeciwporostową oceniano za pomocą standardowego testu immunoenzymatycznego fibrynogenu (ELISA) i testów zanieczyszczenia dehydrogenazą mleczanową płytkową. Rentgenowska spektroskopia fotoelektronów potwierdziła powłokę powierzchniową i zaobserwowano znaczne zmniejszenie zanieczyszczenia na włóknach powlekanych w porównaniu z włóknami niepowlekanymi, co świadczy o użyteczności procesu szczepienia i obietnicy jego działania przeciwporostowego.
Jednak różnice w wyglądzie powłoki na włóknach w pakiecie zostały zauważone w procesie powlekania przez gruntowanie, co mogło wpłynąć na ogólną skuteczność przeciwporostową. Rozwiązanie tego problemu może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność przeciwporostową wiązek włókien płucnych zmodyfikowanych poprzez szczepienie in situ.

Przedstawiono protokół szczepienia zwitterionowego polimeru w sztucznym obiegu płucnym poprzez zaprawianie, demontaż urządzenia w celu pobrania próbek powlekanych włókien oraz ocenę właściwości przeciwosadowych przeciętych włókien. W Rysunek 1przedstawiono metodę modyfikacji powierzchni obwodu sztucznego płuca. Płuca poddano działaniu plazmy UVO w celu wywołania oddziaływania singletowego tlenu rodnikowego z włóknami, po czym przeprowadzono etapy powlekania sztucznych płuc zwiterionową warst...

To badanie badało działanie przeciwporostowe sztucznych pustych włókien płuc pokrytych przez zalewanie urządzenia płucnego. Chociaż to podejście polegające na modyfikacji powierzchni włókien jest praktyczne, skuteczność procesu powlekania zależy od pokrycia przeszczepem na warstwach maty włóknistej w wiązce.

Sztuczne urządzenie płucne do szczepienia powierzchni wiązki włókien in situ

Although the high surface area-to-volume ratio of the artificial lung fiber bundle enhances gas exchange, the large surface area, dense arrangement, and ...

Wyroby medyczne z barierą krwi niezbędne w intensywnej terapii często są narażone na tworzenie się skrzepliny, upośledzanie funkcji i zwiększanie ryzyka zakrzepicy ogólnoustrojowej. Kliniczne leki przeciwzakrzepowe łagodzą zakrzepicę, ale zwiększają ryzyko krwawienia. Absorpcja białka na powierzchni biomateriału wyzwala krzepnięcie i stan zapalny.Zbadaliśmy wpływ płukania polimeru zoura przez powlekanie na absorpcję białek w obwodzie ECMO. Obecnie nie ma komercyjnego antykoagulantu, który selektywnie i skutecznie hamuje zakrzepicę w wyrobach medycznych bez wpływu na pacjenta. Ponadto niezbędna jest optymalizacja i wykazanie skuteczności powłok powierzchniowych i inżynierii w czasie, od dni do tygodni, a nawet miesięcy dla różnych urządzeń medycznych.Nasze nowe cele naukowe obejmują ocenę wpływu różnych podejść do przetwarzania wstępnego na nakładanie powłok, ocenę wpływu metod obchodzenia się z roztworem do mycia przez powłokę na jednorodność powłoki, badanie wpływu alternatywnych przeszczepów polimerów przeciwporostowych na niespecyficzne zanieczyszczenie białkami oraz określenie zdolności zoptymalizowanych powłok do ograniczania zakrzepicy in vivo. Aby oczyścić obwód płuc, recyrkuluj 30% metanol w wodzie dejonizowanej przez 20 minut. Następnie poddaj recyklingowi 10% metanolu w wodzie dejonizowanej, a następnie samą wodę dejonizowaną przez kolejne 20 minut.Osuszyć obwód płuc przefiltrowanym powietrzem domowym ustawionym na niski przepływ przez dwie godziny. Umieść oczyszczony i osuszony obwód płucny w generatorze plazmy ozonolizy ultrafioletowej. Zamknij generator i włącz instrument, aby rozpocząć ekspozycję na plazmę na 20 minut.Po zakończeniu ekspozycji plazmowej przejdź bezpośrednio do etapu powlekania, aby zapobiec przegrupowaniu łańcucha powierzchniowego i utracie miejsc reaktywnych generowanych przez oddziaływanie plazmy. Podczas gdy urządzenie przechodzi modyfikację powierzchni, rozpuść 1,2 grama chlorowodorku dopaminy w 600 mililitrach buforu tris w szklanej zlewce. Następnie rozpuścić monomer metakrylanu sulfobetainy w stosunku od jednego do 15 chlorowodorku dopaminy do metakrylanu sulfobetainy.Następnie dodać pięć milimoli periodyku sodu w postaci kropelek do roztworu powlekającego. Użyj mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej ustawionej na 150 obr./min, aby dokładnie wymieszać roztwór. Następnie zalać płuca roztworem powlekającym za pomocą dużej strzykawki, aby pobrać i napełnić obwód.Clamp jeden koniec obwodu i zalać go od drugiego końca, prowadząc pęcherzyki powietrza przez złącze dostępu do obwodu. Gdy obwód zostanie całkowicie zalany, umieść urządzenie pod źródłem światła ultrafioletowego na dwie godziny. Mieszaj roztwór, zmieniając orientację końców głównego urządzenia w górę iw dół co 10 minut.Po zabiegu świetlnym całkowicie opróżnij obwód. Delikatnie przepłukać wszystkie próbki wodą dejonizowaną, wielokrotnie zalewając i opróżniając za pomocą strzykawki o pojemności 60 centymetrów sześciennych, aż ścieki z płukania będą czyste. Na koniec przechowuj urządzenie napełnione wodą dejonizowaną w lodówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza w celu przeprowadzenia autopsji i analiz powierzchni.Aby przeprowadzić test absorpcji fibrynogenu, przenieś próbki maty włóknistej w jednym mililitrze trzech miligramów na mililitr roztworu fibrynogenu w płytkach studzienkowych i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut przy 60 obr./min. Przemyć próbki PBS. Przenieś je do nowych studzienek i dodaj jeden mililitr jednego miligrama na mililitr roztworu BSA do każdej studzienki.Inkubuj przez kolejne 90 minut. Następnie przemyć próbki jeszcze trzykrotnie roztworem PBS i przenieść je do nowych studzienek. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczenia od jednego do 1000 sprzężonego przeciwciała fibrynogenu peroksydazy chrzanu w roztworze PBS do każdej studzienki.Po inkubacji próbek przez 30 minut i umyciu ich, przenieś je do nowych studzienek. W nowych studzienkach dodać 500 mikrolitrów ofenylenodiaminy w buforze fosforanu cytrynianu z 0,03% nadtlenkiem wodoru, dostosowanym do pH 5,0 w odstępach 30-sekundowych. Próbki należy inkubować z dala od światła przez 30 minut.Aby zatrzymać reakcję peroksydazy i ofenylenodiaminy, dodaj 500 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego do każdej studzienki. Przenieść supernatant z każdej studzienki do kuwety. Zmierzyć absorbancję supernatantu przy 492 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV widzialnego.Rozmrażać zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej przez 20 minut. Podczas rozmrażania zestawu testowego należy przygotować zbiorcze osocze dorosłego człowieka w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego. Aby przygotować osocze bogatopłytkowe, odwiruj rozmrożone probówki z próbkami ludzkiego osocza o stężeniu 483 G, aby rozdzielić osocze na dwa regiony.Zidentyfikuj dolną jedną trzecią zawierającą osocze bogatopłytkowe, a górne dwie trzecie zawierające osocze ubogie w płytki krwi. Ostrożnie usunąć osadki płytek krwi znajdujące się na dnie probówek i w dwóch trzecich górnych zawierających osocze ubogie w płytki krwi. Delikatnie rozprowadzić osad płytek krwi w górnym osoczu, potrząsając probówkami.Przed badaniem dodaj chlorek wapnia do osocza bogatopłytkowego, aby odwrócić działanie cytrynianów. Następnie inkubuj próbki maty włóknistej w 500 mikrolitrach osocza bogatopłytkowego przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przenieść próbki do nowych studzienek i trzykrotnie przepłukać roztworem PBS.Ponownie przenieś próbki do nowych studzienek. Dodaj 300 mikrolitrów roztworu PBS i 10 mikrolitrów 10 X buforu do lizy do każdej studzienki. Inkubować próbki przez 45 minut, następnie dodać 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka i inkubować przez 30 minut z dala od światła.Dodaj 50 mikrolitrów kwasu solnego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcje. Aby wykryć aktywność dehydrogenazy mleczanowej z lizatów wchłoniętych płytek krwi, należy zmierzyć absorbancję światła opracowanych roztworów studzienkowych na głębokości 490 nanometrów i 680 nanometrów. Zanieczyszczenie fibrynogenem zostało znacznie zmniejszone w kodowanych włóknach PP-PDMS w porównaniu z niepowlekanymi kontrolami.Nie stwierdzono istotnej różnicy w zanieczyszczeniu fibrynogenem między zewnętrznymi i wewnętrznymi wiązkami we włóknach PP-PDMS w warunkach braku przepływu. W ciągu 24 godzin przepływu PBS zanieczyszczenie fibrynogenem w wiązkach zewnętrznych i wewnętrznych pozostało niskie i nie wykazało istotnych różnic. Zanieczyszczenie płytek krwi było większe w zewnętrznym wiązce włókien PP-PDMS niż w wiązce wewnętrznej i stanowiło kontrolę niepowlekaną.Zanieczyszczenie płytek krwi było znacznie wyższe w wiązce zewnętrznej w porównaniu z włóknami PP-PDMS kodowanymi w wiązce wewnętrznej bez ekspozycji na przepływ. W ciągu 24-godzinnego przepływu PBS nie zaobserwowano znaczącej różnicy w zanieczyszczeniu płytek krwi między zewnętrznymi i wewnętrznymi wiązkami o niskim poziomie zanieczyszczenia.

artificial-lung-device-priming-for-situ-fiber-bundle-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Skonstruowano i scharakteryzowano nowatorski bioreaktor fałdowania głosowego, zdolny do dostarczania fizjologicznie istotnej, wibracyjnej stymulacji do hodowanych komórek. To dynamiczne urządzenie do hodowli, w połączeniu z włóknistym rusztowaniem poli(ε-kaprolaktonu), tworzy środowisko wokalno-mimetyczne, które moduluje zachowanie mezenchymalnych komórek macierzystych.

Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych

Rekapitulacja mikrośrodowiska specyficznego dla danego narządu, która stymuluje miejscową angiogenezę, jest niezbędna do skutecznej regeneracji uszkodzonych tkanek. W niniejszym raporcie przedstawiono nowatorską metodę wszczepiania żeli fibrynowych na powierzchnię płuc żywej myszy w celu zbadania, w jaki sposób mikrośrodowisko specyficzne dla płuc moduluje angiogenezę i regenerację pęcherzyków płucnych u dorosłych myszy.

Implantacja żelu fibrynowego do płuca myszy w celu zbadania angiogenezy specyficznej dla płuc

Postępy w technologiach biomateriałów umożliwiają rozwój trójwymiarowych konstruktów wielokomórkowych. Opracowaliśmy protokoły elektroprzędzenia w celu wytworzenia trzech pojedynczych rusztowań do hodowli głównych komórek strukturalnych dróg oddechowych, aby zapewnić model 3D in vitro ściany oskrzelików dróg oddechowych.

Dostosowanie procesu elektroprzędzenia w celu zapewnienia trzech unikalnych środowisk dla trójwarstwowego modelu ściany dróg oddechowych in vitro

Zwężenie przeszczepu stanowi krytyczną przeszkodę w wymianie dróg oddechowych za pomocą inżynierii tkankowej. Aby zbadać mechanizmy komórkowe leżące u podstaw zwężenia, wykorzystujemy mysi model wymiany tchawicy za pomocą inżynierii tkankowej z wysiewanymi komórkami jednojądrzastymi szpiku kostnego (BM-MNC). Tutaj szczegółowo opisujemy nasz protokół, w tym produkcję rusztowań, izolację BM-MNC, siew przeszczepu i implantację.

Wysiew i implantacja biosyntetycznego przeszczepu tchawicy zmodyfikowanego tkankowo w modelu mysim

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Protokół ten prezentuje model perfuzji płuc ex vivo szczura, który uwzględnia przejściową ekspozycję na skalibrowane obciążenie termiczne, promując endogenne mechanizmy ochronne dla terapeutycznego odnowienia uszkodzonych przeszczepów płuc. Podejście to jest skalowalne i powtarzalne oraz wspiera rozwój terapii niefarmakologicznych, które poprawiają skuteczność przeszczepów płuc.

Prekondycjonowanie termiczne podczas perfuzji płuc ex vivo w celu rehabilitacji uszkodzonych przeszczepów płuc przed przeszczepem

Poznaj metodę powlekania polimerem zoura włókien płucnych do ECMO w celu zmniejszenia adsorpcji białek i zapobiegania powstawaniu zakrzepów. Technika ta poprawia bezpieczeństwo urządzeń medycznych.

Sztuczne urządzenie płucne do szczepienia powierzchni wiązki włókien in situ

Przeglądaj więcej filmów