Sztuczne urządzenie płucne do szczepienia powierzchni wiązki włókien in situ

Wyroby medyczne z barierą krwi niezbędne w intensywnej terapii często są narażone na tworzenie się skrzepliny, upośledzanie funkcji i zwiększanie ryzyka zakrzepicy ogólnoustrojowej. Kliniczne leki przeciwzakrzepowe łagodzą zakrzepicę, ale zwiększają ryzyko krwawienia. Absorpcja białka na powierzchni biomateriału wyzwala krzepnięcie i stan zapalny.

Zbadaliśmy wpływ płukania polimeru zoura przez powlekanie na absorpcję białek w obwodzie ECMO. Obecnie nie ma komercyjnego antykoagulantu, który selektywnie i skutecznie hamuje zakrzepicę w wyrobach medycznych bez wpływu na pacjenta. Ponadto niezbędna jest optymalizacja i wykazanie skuteczności powłok powierzchniowych i inżynierii w czasie, od dni do tygodni, a nawet miesięcy dla różnych urządzeń medycznych.

Nasze nowe cele naukowe obejmują ocenę wpływu różnych podejść do przetwarzania wstępnego na nakładanie powłok, ocenę wpływu metod obchodzenia się z roztworem do mycia przez powłokę na jednorodność powłoki, badanie wpływu alternatywnych przeszczepów polimerów przeciwporostowych na niespecyficzne zanieczyszczenie białkami oraz określenie zdolności zoptymalizowanych powłok do ograniczania zakrzepicy in vivo. Aby oczyścić obwód płuc, recyrkuluj 30% metanol w wodzie dejonizowanej przez 20 minut. Następnie poddaj recyklingowi 10% metanolu w wodzie dejonizowanej, a następnie samą wodę dejonizowaną przez kolejne 20 minut.

Osuszyć obwód płuc przefiltrowanym powietrzem domowym ustawionym na niski przepływ przez dwie godziny. Umieść oczyszczony i osuszony obwód płucny w generatorze plazmy ozonolizy ultrafioletowej. Zamknij generator i włącz instrument, aby rozpocząć ekspozycję na plazmę na 20 minut.

Po zakończeniu ekspozycji plazmowej przejdź bezpośrednio do etapu powlekania, aby zapobiec przegrupowaniu łańcucha powierzchniowego i utracie miejsc reaktywnych generowanych przez oddziaływanie plazmy. Podczas gdy urządzenie przechodzi modyfikację powierzchni, rozpuść 1,2 grama chlorowodorku dopaminy w 600 mililitrach buforu tris w szklanej zlewce. Następnie rozpuścić monomer metakrylanu sulfobetainy w stosunku od jednego do 15 chlorowodorku dopaminy do metakrylanu sulfobetainy.

Następnie dodać pięć milimoli periodyku sodu w postaci kropelek do roztworu powlekającego. Użyj mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej ustawionej na 150 obr./min, aby dokładnie wymieszać roztwór. Następnie zalać płuca roztworem powlekającym za pomocą dużej strzykawki, aby pobrać i napełnić obwód.

Clamp jeden koniec obwodu i zalać go od drugiego końca, prowadząc pęcherzyki powietrza przez złącze dostępu do obwodu. Gdy obwód zostanie całkowicie zalany, umieść urządzenie pod źródłem światła ultrafioletowego na dwie godziny. Mieszaj roztwór, zmieniając orientację końców głównego urządzenia w górę iw dół co 10 minut.

Po zabiegu świetlnym całkowicie opróżnij obwód. Delikatnie przepłukać wszystkie próbki wodą dejonizowaną, wielokrotnie zalewając i opróżniając za pomocą strzykawki o pojemności 60 centymetrów sześciennych, aż ścieki z płukania będą czyste. Na koniec przechowuj urządzenie napełnione wodą dejonizowaną w lodówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza w celu przeprowadzenia autopsji i analiz powierzchni.

Aby przeprowadzić test absorpcji fibrynogenu, przenieś próbki maty włóknistej w jednym mililitrze trzech miligramów na mililitr roztworu fibrynogenu w płytkach studzienkowych i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut przy 60 obr./min. Przemyć próbki PBS. Przenieś je do nowych studzienek i dodaj jeden mililitr jednego miligrama na mililitr roztworu BSA do każdej studzienki.

Inkubuj przez kolejne 90 minut. Następnie przemyć próbki jeszcze trzykrotnie roztworem PBS i przenieść je do nowych studzienek. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczenia od jednego do 1000 sprzężonego przeciwciała fibrynogenu peroksydazy chrzanu w roztworze PBS do każdej studzienki.

Po inkubacji próbek przez 30 minut i umyciu ich, przenieś je do nowych studzienek. W nowych studzienkach dodać 500 mikrolitrów ofenylenodiaminy w buforze fosforanu cytrynianu z 0,03% nadtlenkiem wodoru, dostosowanym do pH 5,0 w odstępach 30-sekundowych. Próbki należy inkubować z dala od światła przez 30 minut.

Aby zatrzymać reakcję peroksydazy i ofenylenodiaminy, dodaj 500 mikrolitrów jednego normalnego kwasu solnego do każdej studzienki. Przenieść supernatant z każdej studzienki do kuwety. Zmierzyć absorbancję supernatantu przy 492 nanometrach za pomocą spektrofotometru UV widzialnego.

Rozmrażać zestaw do oznaczania dehydrogenazy mleczanowej przez 20 minut. Podczas rozmrażania zestawu testowego należy przygotować zbiorcze osocze dorosłego człowieka w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego. Aby przygotować osocze bogatopłytkowe, odwiruj rozmrożone probówki z próbkami ludzkiego osocza o stężeniu 483 G, aby rozdzielić osocze na dwa regiony.

Zidentyfikuj dolną jedną trzecią zawierającą osocze bogatopłytkowe, a górne dwie trzecie zawierające osocze ubogie w płytki krwi. Ostrożnie usunąć osadki płytek krwi znajdujące się na dnie probówek i w dwóch trzecich górnych zawierających osocze ubogie w płytki krwi. Delikatnie rozprowadzić osad płytek krwi w górnym osoczu, potrząsając probówkami.

Przed badaniem dodaj chlorek wapnia do osocza bogatopłytkowego, aby odwrócić działanie cytrynianów. Następnie inkubuj próbki maty włóknistej w 500 mikrolitrach osocza bogatopłytkowego przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przenieść próbki do nowych studzienek i trzykrotnie przepłukać roztworem PBS.

Ponownie przenieś próbki do nowych studzienek. Dodaj 300 mikrolitrów roztworu PBS i 10 mikrolitrów 10 X buforu do lizy do każdej studzienki. Inkubować próbki przez 45 minut, następnie dodać 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka i inkubować przez 30 minut z dala od światła.

Dodaj 50 mikrolitrów kwasu solnego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcje. Aby wykryć aktywność dehydrogenazy mleczanowej z lizatów wchłoniętych płytek krwi, należy zmierzyć absorbancję światła opracowanych roztworów studzienkowych na głębokości 490 nanometrów i 680 nanometrów. Zanieczyszczenie fibrynogenem zostało znacznie zmniejszone w kodowanych włóknach PP-PDMS w porównaniu z niepowlekanymi kontrolami.

Nie stwierdzono istotnej różnicy w zanieczyszczeniu fibrynogenem między zewnętrznymi i wewnętrznymi wiązkami we włóknach PP-PDMS w warunkach braku przepływu. W ciągu 24 godzin przepływu PBS zanieczyszczenie fibrynogenem w wiązkach zewnętrznych i wewnętrznych pozostało niskie i nie wykazało istotnych różnic. Zanieczyszczenie płytek krwi było większe w zewnętrznym wiązce włókien PP-PDMS niż w wiązce wewnętrznej i stanowiło kontrolę niepowlekaną.

Zanieczyszczenie płytek krwi było znacznie wyższe w wiązce zewnętrznej w porównaniu z włóknami PP-PDMS kodowanymi w wiązce wewnętrznej bez ekspozycji na przepływ. W ciągu 24-godzinnego przepływu PBS nie zaobserwowano znaczącej różnicy w zanieczyszczeniu płytek krwi między zewnętrznymi i wewnętrznymi wiązkami o niskim poziomie zanieczyszczenia.