Pomiar czterech podtypów komórek NK macicy za pomocą multipleksowanego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego u kobiet z powtarzającym się niepowodzeniem implantacji

Komórki NK macicy gromadzą się dramatycznie w środkowej fazie lutealnej przygotowanej do zagnieżdżenia się zarodka. Warto zauważyć, że komórki te są niejednorodne. Dokładna identyfikacja ich fenotypów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia receptywności endometrium.

Nasze badanie ma na celu wykrycie czterech podtypów komórek NK macicy za pomocą barwienia immunohistochemicznego multipleksowego. Barwienie immunohistochemiczne jest szeroko stosowane do odzwierciedlania gęstości komórek NK macicy u kobiet z niewydolnością rozrodczą. Jednak ta tradycyjna technologia nie rozróżnia skutecznie różnych podtypów komórek NK macicy.

Nasz protokół wykorzystujący multipleksowe barwienie immunohistochemiczne oferuje zaawansowane podejście do identyfikacji czterech odrębnych podtypów komórek NK macicy. Wraz z wdrożeniem tego protokołu ocenimy różnice w podtypach komórek NK macicy między kobietami z powtarzającymi się niepowodzeniami implantacji a płodnymi kontrolami. Jeśli zostaną zidentyfikowane znaczące różnice, przystąpimy do zbadania, czy te podtypy komórek NK macicy mogą przewidzieć ryzyko niepowodzenia implantacji.

Ostatecznie naszym długoterminowym celem jest opracowanie testu diagnostycznego do oceny stanu immunologicznego komórek NK macicy pod kątem receptywności endometrium. Na początek uzyskaj wycinek ludzkiej tkanki endometrium na szkiełku do immunohistochemii multipleksowej i piecz skrawki tkanki w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie zanurz szkiełko kolejno w odpowiednich roztworach do odparafinowania, nawilżania i utrwalania.

Dodaj 200 mililitrów odpowiedniego buforu AR6 lub AR9 dla każdego przeciwciała do żaroodpornej kasety do pobierania antygenu. Po umieszczeniu skrawków w buforze do odzyskiwania antygenu podgrzej je w kuchence mikrofalowej na dużej mocy do wrzenia. Przykryj luźno kasetę i podgrzewaj na małej mocy przez 15 minut.

Po ostygnięciu szkiełka spłucz je wodą podwójnie destylowaną, a następnie PBST. Następnie usuń nadmiar roztworu papierem chłonnym i narysuj pełne kółko wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Następnie inkubować skrawki z 3% nadtlenkiem wodoru przez osiem minut w temperaturze pokojowej.

Następnie nałóż roztwór blokujący i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu roztworu blokującego nanieść 150 mikrolitrów pierwszego pierwszorzędowego przeciwciała CD49a na każde szkiełko w rozcieńczeniu od jednego do 1000 w rozcieńczalniku przeciwciał 1X. Przed zastosowaniem przeciwciała wtórnego należy usunąć nadmiar wilgoci za pomocą papieru chłonnego.

Dodaj cztery do pięciu kropli przeciwciała drugorzędowego 1X przeciwko peroksydazie chrzanowej myszy i królika chrzanowi na każde szkiełko. Następnie rozcieńczyć wzmacniacz sygnału tyramidu lub barwnik TSA od jednego do 100 razy w rozcieńczalniku wzmacniającym. I dodaj 150 mikrolitrów tego rozcieńczonego roztworu do każdego szkiełka i inkubuj.

Aby wyeliminować niezwiązane fluorofory, gotuj skrawki w 200 mililitrach buforu AR6 w żaroodpornej kasecie w kuchence mikrofalowej przez dwie minuty. Następnie przełącz kuchenkę mikrofalową z dużej mocy na niską moc na 15 minut. Dodaj kroplami 150 mikrolitrów roztworu roboczego DPI rozcieńczonego w PBST.

Wysuszyć sekcje całkowicie w ciemnym miejscu przez około 30 minut. Nałóż pojedynczą kroplę anty-gaszącego środka fluorescencyjnego i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe. Na początek wybarwić zamontowane skrawki tkanki endometrium pożądanymi przeciwciałami.

Włącz imager i wybierz odpowiednie fluorofory na bazie barwników TSA. Ręcznie ustaw ostrość na obszarze slajdu, który pokazuje uczciwą ekspozycję każdego znacznika, i użyj funkcji automatycznej ekspozycji, aby ustawić czas ekspozycji dla tego fluoroforu. Aby zapewnić bezstronne próbkowanie, losowo wybierz początkowy obszar do uzyskania obrazu, koncentrując się na granicy nabłonka światła.

Po przechwyceniu początkowego pola przesuń jedno pole w lewo lub w prawo, aby zaznaczyć kolejne obszary, pomijając jedno pole między każdym przechwyconym obrazem. Utrzymuj granicę nabłonka światła w kadrze, aby uchwycić co najmniej pięć różnych obszarów, w tym około 10 000 komórek zrębu. Barwienie monopleksowe i multipleksowe TSA ujawniło wyraźną kolokalizację markerów komórek NK, co pozwoliło na identyfikację odrębnych populacji komórek NK.

W strategii multipleksu wykorzystano barwniki fluorescencyjne o odległych długościach fal, aby uniknąć nakładania się widm i zapewnić wyraźne tło potwierdzające specyficzność sygnału. Na początek zobrazuj skrawki tkanki endometrium, po wybarwieniu odpowiednimi przeciwciałami. Aby zaimportować obrazy wielospektralne, przejdź do pliku, a następnie otwórz obraz w interfejsie oprogramowania.

Kliknij Wybierz fluorofory i wybierz odpowiednią bibliotekę spektralną, aby rozmieszać fluorofory, a następnie kliknij przycisk OK, aby potwierdzić. Wyizoluj widmo autofluorescencji za pomocą kroplomierza AF, aby pobrać próbkę reprezentatywnego obszaru tkanki z obrazu AF. Oznacz czterokomórkowe znaczniki powierzchni i przypisz określone kolory do identyfikacji.

Kliknij przycisk Przygotuj obraz lub przygotuj wszystko, aby sfinalizować przygotowanie. W przypadku segmentacji tkanek należy ręcznie wyznaczyć od trzech do pięciu regionów na typ tkanki, w tym obszary nabłonkowe, zrębowe i ślepe. Dostosuj regiony i parametry zgodnie z potrzebami, aby ulepszyć zestaw danych treningowych, zwiększając dokładność oprogramowania w identyfikowaniu struktur tkankowych.

W obszarze Segmentuj komórki wybierz pozycję Jądra i błona. Wybierz DPI, aby zidentyfikować jądra komórkowe i dostosuj ustawienie intensywności, aby wykryć wszystkie jądra komórkowe bez szumów tła. Wybierz sygnały CD16, CD49a i CD56, aby znaleźć membranę i pomóc w rozszczepieniu jądrowym.

Użyj funkcji podziału składowej jądrowej, aby rozróżnić blisko położone jądra. W schemacie fenotypowania zastosuj markery CD56, CD49a, CXCR4 i CD16 do fenotypowania komórek. Użyj przycisku Dodaj, aby skategoryzować komórki jako pozytywnie lub negatywnie wyrażające każdy znacznik.

Ręcznie oznacz co najmniej pięć komórek dla każdego fenotypu podczas procesu trenowania. Po skonfigurowaniu fenotypowania komórki, oprogramowanie wskaże ekspresję markerów powierzchniowych dla każdej komórki. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

Zidentyfikowano nową strategię klasyfikacji podtypów komórek NK na podstawie ekspresji CD49a i CXCR4.