Inokulacja liści in vivo: alternatywna metoda oceny odporności klonów hybrydowych na choroby zakaźne w hodowli topoli na raka łodygi

Zakres niniejszego protokołu badawczego polega na zbadaniu metodyki inokulacji patogenów i metod oceny odporności na choroby z wykorzystaniem hodowli hybrydowej topoli. Podchodzimy do metody inokulacji liści in vivo jako alternatywy dla tradycyjnych metod w celu przyspieszenia hodowli raka łodygi topoli. Korzystając z metody inokulacji liści, naukowcy mogą badać odporność na choroby zakwitów hybrydowych na dużą skalę w drugich latach hybrydyzacji.

Uświadomienie sobie wcześniej selekcji ślizgowej w hodowli hybrydowej topoli choroby raka łodygi. Najkorzystniejszymi aspektami metody inokulacji liści są jej wysoka skuteczność i wysoka przepustowość. Po pierwsze, metoda liściowa może znacznie skrócić okres selekcji odporności na choroby, z pięciu do siedmiu lat po hybrydyzacji do dwóch lat po hybrydyzacji.

Po drugie, metoda może ocenić odporność na choroby klonów hybrydowych na dużą skalę w ciągu kilku tygodni, metoda inokulacji liści przyspieszy hodowlę hybrydową topoli Botryosphaeria dothidea i raka Cytospora chrysosperma w Chinach oraz hodowlę hybrydową topoli raka w Ameryce Północnej. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do znalezienia szczepów odpornych na choroby i poprawy rozwoju hodowli molekularnej topoli. Oprócz hodowli hybrydowej raka łodygi topoli, metoda liściowa może być stosowana do badań przesiewowych odporności na choroby naturalnych lub zmutowanych populacji topoli oraz podatności na patogeny raka łodygi topoli.

Co więcej, metoda ta może dostarczyć patotypów do eksploracji genów odpornych na choroby i analizy genetycznej odporności na choroby. Zacznij od dodania ekstrakcji ziemniaków, dekstrozy i agaru w wodzie, aby przygotować agar z dekstrozą ziemniaczaną lub pożywkę do hodowli PDA dla szczepów grzybów. Podgrzej roztwór w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby całkowicie rozpuścić składniki.

Wlej pożywkę PDA do 25 mililitrowych probówek. Sterylizuj wszystkie probówki w temperaturze 121,1 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić wysterylizowane probówki na czystej ławce do 50 do 60 stopni Celsjusza.

Wlej pożywkę do płytek hodowlanych o średnicy 9,0 centymetrów i ostudź je w temperaturze pokojowej. Następnie pokrój grzybnię patogenu grzybowego hodowanego w pożywce PDA w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez siedem dni na około 0,5 centymetra kwadratowego w kostkę. Zaszczepić kostki grzybów w środku płytek PDA, upewniając się, że boki grzybni są skierowane w stronę podłoża.

Następnie hoduj zaszczepione patogeny grzybowe w inkubatorze termostatycznym przez siedem do 10 dni. Po inkubacji pokrój pożywkę PDA zawierającą grzybnię na kwadratowe kostki o bokach o długości od 1,0 do 1,2 centymetra. Wybierz nowo dojrzałe, w pełni rozwinięte liście z wierzchołka głównych gałęzi jednorocznych klonów topoli.

Upewnij się, że liście są wolne od szkodników, chorób i uszkodzeń mechanicznych. W przypadku jednorocznych gałęzi wieloletnich popularnych klonów hybrydowych wybierz górne od piątego do siódmego liścia wybranych gałęzi jako zaszczepiony materiał. Spryskaj wybrane klony lub gałęzie topoli czystą wodą.

Po wyschnięciu przetrzyj wybrane liście 75% alkoholem na godzinę lub jeden dzień przed manipulacjami inokulacji. Na początek przygotuj kulturę grzybową na patogen rakowy i materiał topolowy do inokulacji liści. W przypadku małych liści należy zaszczepić dwie wcześniej przygotowane kwadratowe kostki grzybni grzybni i kostki PDA na górnej powierzchni górnych od piątych do siódmych liści klonów topoli.

Upewnij się, że grzybnia jest skierowana w stronę liści, a miejsca inokulacji znajdują się pośrodku połówek liści. Zaszczepić cztery kwadratowe kostki grzybni grzybów i cztery kostki PDA na górnej powierzchni górnych od piątych do siódmych liści dużych liści topoli. Następnie owiń zaszczepione liście przezroczystą taśmą klejącą.

Delikatnie dociśnij taśmę, aby przylegała do liści, zapobiegając ruchowi i utracie wody przez kostki grzybni podczas eksperymentu. Następnie, używając pięciomililitrowej igły strzykawki, przekłuj liście i kostki grzybni w pięciu miejscach, aż igła wbije się w kostki od górnej do dolnej powierzchni liści topoli. Umieść jedno miejsce przekłucia pośrodku, a pozostałe cztery od jednego do dwóch milimetrów w pobliżu czterech wierzchołków sześcianów.

Sprawdź zaszczepione liście w ciągu trzech dni pod kątem jakichkolwiek zmian lokalizacji lub utraty wody przez innokulanty grzybni. Obserwuj początek zmian martwiczych wokół miejsc ran kłujących na dolnej powierzchni liści. Pod koniec eksperymentu zerwij wszystkie zaszczepione liście i umieść je w plastikowych torebkach na próbki.

Na początek weź zaszczepione rakami liście topoli trzymane w plastikowych torebkach. Ostrożnie usuń plastikowe folie ochronne z liści i delikatnie usuń innokulanty grzybni z powierzchni liści. Obserwuj i identyfikuj patotypy liści każdego klonu topoli, badając kształt i kolor nekrotycznych plam.

Następnie umieść liście w linijce na czarnym tle. Sfotografuj dolną powierzchnię liści za pomocą aparatu lub zeskanuj je za pomocą skanera, aby uzyskać obrazy o rozdzielczości ponad 300 punktów na cal. Otwórz obrazy chorych liści w oprogramowaniu ImageJ 1.54G.

Ustaw skalę w ImageJ zgodnie z linijką widoczną na obrazach liści. Następnie, za pomocą narzędzia różdżki w ImageJ, zidentyfikuj zmiany na liściach i zmierz obszar każdego nekrotycznego miejsca. Po zmierzeniu wszystkich nekrotycznych plam zapisz wartości obszaru i wyeksportuj te wartości jako arkusz kalkulacyjny do dalszej analizy.

Jeśli zmiany wokół miejsc przekłucia pokrytych grzybnią są znacznie większe niż te wokół miejsc pokrytych PDA, należy je sklasyfikować jako miejsca chorobowe. Jeśli pokryte grzybnią miejsca ppierce wykazują zmiany, takie jak kolor zmiany, struktury podobne do hyphy, pignidia i canidia, zdefiniuj je jako miejsca chorobowe. Oblicz średnią powierzchnię efektywnych plam zmian PDA dla każdego klonu hybrydy topoli.

Podziel miejsca zaszczepione grzybnią na dwie kategorie, początek i brak początku. Następnie należy obliczyć częstość występowania choroby klonów badanej topoli. Oblicz średnią powierzchnię chorych plam na liściach.

Opierając się na średnich obszarach chorobowych miejsc we wszystkich badanych klonach topoli, ustal pięciopoziomowy standard klasyfikacji chorób. Oblicz indeks choroby każdego klonu topoli przy użyciu pięciopoziomowego standardu klasyfikacji chorób. Następnie, za pomocą testu Shapiro-Wilka, zweryfikuj normalny rozkład liczby klonów topoli na różnych poziomach odporności.

Na podstawie indeksu choroby sklasyfikuj wszystkie badane klony topoli do pięciu lub siedmiu grup odporności. Bardzo wysoka odporność, wysoka odporność, odporność, brak oporu i brak podatności, podatność, wysoka podatność i bardzo wysoka podatność. Inokulacja patogenem raka łodygi wywołała zmiany nekrotyczne, a nawet struktury podobne do pignidiów na liściach topoli.

Ponadto położenie liści i warunki świetlne liści wpływają na nasilenie choroby liści.