Name: Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do delecji genu L2HGDH w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych H9. Technika ta zachowuje zdolności różnicowania i ma zastosowanie w biologii rozwoju oraz medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Uniwersytetu Zjednoczonych Emiratów Arabskich (ZEA) - grant #12M105, grant #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) oraz ASPIRE, filar zarządzania programami technologicznymi Rady Badań nad Zaawansowanymi Technologiami w Abu Dhabi (ATRC), za pośrednictwem ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) grant numer VRI-20-10.

Szczegóły dotyczące sekwencji genów, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Projektowanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), klonowanie i produkcja wektorów lentiwirusowych
UWAGA: Używane są dwie różne sekwencje sgRNA ukierunkowane na ekson 1 genu L2HGDH, obie zaadaptowane z Qiu et al.6z miejscami PAM AGG i TGG odpowiednio dla sekwencji 1 i 2. Oba sgRNA miały długość 20 pz, a ich końce zostały zmodyfikowane w celu dodania sekwencji łącznikowych dla enzymu restrykcyjnego Bsmb1, który ma zostać sklonowany w wektorze docelowym (LentiCRISPRv2), jak opisano w poprzednim raporcie6. Sekwencje łącznikowe zostały dodane podczas projektowania sgRNA do celów klonowania.
<ol>
	<li>Wyżarzanie chemicznie zsyntetyzowane sgRNAs6 i sklonowane do wektora lentiwirusowego Bsmb1 z pojedynczym cięciem, LentiCRISPRv2 przy użyciu zoptymalizowanego protokołu, jak wcześniej zgłoszono7.</li>
	<li>Kontynuuj pakowanie i zagęszczanie lentiwirusa przy użyciu ustandaryzowanego i zoptymalizowanego protokołu7.</li>
	<li>Do produkcji lentiwirusa należy HEK293T nasienne komórki (1 × 105 komórek/cm2) przy użyciu DMEM, 10% FBS i 1x penicyliny/streptomycyny (P/S) i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w wilgotnych warunkach.</li>
	<li>Gdy 90% zlewają się, współtransfekują komórki HEK293T z wektorem wejściowym (pusty szkielet lub plazmidy eksprymujące sgRNA) i plazmidami pakującymi za pomocą taniego polimeru kationowego PEI, jak opisano wcześniej7.</li>
	<li>Zebrać kondycjonowane pożywki zawierające cząstki supernatantu lentiwirusowego (LVS) po 48 godzinach i 72 godzinach po transfekcji i przystąpić do ultrawirowania z użyciem poduszki sacharozowej i wirować probówki w temperaturze 1,25 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kontynuować zagęszczanie cząstek LVS do co najmniej 200-krotności pierwotnej objętości w PBS, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Oznaczyć miano cząstek lentiwirusa za pomocą zestawu do miana lentiwirusa qPCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Infekcje lentiwirusowe i rozmnażanie klonów jednokomórkowych
<ol>
	<li>W przypadku zakażeń cząstkami LVS zawiesinę komórek nasiennych hESC (H9) zawierającą 1 × 105 komórek/0,5 ml pożywki hodowlanej hESC (pożywka podstawowa + P/S + 10 μM inhibitora skały) na kompletnych płytkach dołkowych Matrigel (1:50) pokrytych 500 μl pożywki i inkubować przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się. Nasiona dodatkowych dołków, które nie byłyby zakażone LVS, ale potraktowane puromycyną, aby służyły jako niezakażona kontrola. 
	UWAGA: Zliczanie komórek można przeprowadzić za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Następnego dnia należy zainfekować komórki przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 wraz z 8 μg/ml polibrenu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin, a następnie zastąpić pożywkę świeżą pożywką hESC + P/S bez inhibitora skał i kontynuować hodowlę, aż komórki będą zlewać się w 90%.</li>
	<li>Rozpocznij selekcję puromycyny od uzupełnienia pożywki stężeniem 0,8 μg/ml puromycyny, gdy komórki osiągną 90% konfluencji, co zwykle ma miejsce 48-72 godziny po zakażeniu, i kontynuuj selekcję, aż wszystkie komórki umrą w komórkach niezakażonych (grupa kontrolna).</li>
	<li>Po zakończeniu selekcji (zwykle 4-6 dni) podziel stabilne komórki (1:4) i rozszczep je w celu kriokonserwacji i dalszej analizy.</li>
	<li>Przeprowadź selekcję pojedynczej komórki i ekspansję klonalną przy użyciu komórek eksprymujących L2HGDH-sgRNA-16.</li>
	<li>W tym celu należy przygotować zawiesinę komórkową odpowiadającą 500 komórkom/10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i zasiać 100 μl tej zawiesiny w każdym dołku na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Pozostaw komórki w spokoju przez 3 dni, a następnie obserwuj.</li>
	<li>Zaznacz studzienki, w których powstają pojedyncze klony i zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż do osiągnięcia wystarczającej wielkości, aby kolonie (zwykle 2 tygodnie) mogły się dalej rozwijać, kriorezerwować i analizować.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja gDNA, MS-BSP PCR i sekwencjonowanie Sangera
<ol>
	<li>Wyizolować gDNA z komórek za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Kontynuuj mapowanie miejsc mutacji przed sekwencjami rozpoznawania PAM za pomocą analizy MS-BSP (Mutation Sites Based Specific Starters)8.</li>
	<li>W tym celu bezstronny prawy starter L2H-UMSBSP-R1 został zaprojektowany do wzmacniania obszaru poza Exonem1 w celu wzmocnienia dowolnych celów.</li>
	<li>Zaprojektuj tendencyjny lewy starter L2H-BMSBSP-F1 o identycznej sekwencji do sgRNA, aby wzmocnić sekwencję docelową w pobliżu sekwencji rozpoznawania PAM. 
	UWAGA: W bardzo rygorystycznych warunkach PCR produkt będzie obserwowany na żelu w niezmutowanych klonach. Nie zaobserwowano żadnego produktu w klonach z nokautem CRISPR, które wykazywały mutacje zbliżone do sekwencji rozpoznawania PAM.</li>
	<li>W celu zmapowania mutacji pojedynczej pary zasad, PCR amplifikuje sekwencję 468 pz obejmującą cały ekson 1 L2HGDH i poddaje sekwencjonowaniu Sangera, a następnie analizie dopasowania wielu sekwencji przy użyciu clustalw8.</li>
</ol>
4. Test różnicowania hESC i tworzenia ciał zarodkowych (EB)
<ol>
	<li>Kontynuuj ukierunkowane różnicowanie kontroli i różnych klonów CRISPR hESC (H9) w kierunku losu neuro-ektodermy zgodnie z ustalonymi protokołami, jak opisano wcześniej, przy użyciu metody podwójnego hamowania smad9,10,11.</li>
	<li>Przy 90% konfluencji należy potraktować komórki LDN193189 (200 nM) i SB431542 (10 μM) przez początkowe 24 godziny w pożywce 100% KSR, a następnie dodać XAV939 (2 μM) przez dodatkowe 2 dni.</li>
	<li>Po 3 dniach zmniejsz procentową zawartość pożywek KSR (Knockout DMEM uzupełnionych 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutaminy, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM i 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanolu (75%, 50%, 25%) poprzez połączenie z pożywką N2 (DMEM/F12 uzupełnioną 1x suplementem N2, 1x P/S, ) do 100% nośników N2 przez okres 8 dni.</li>
	<li>Na początku 12 dnia utrwal komórki do barwienia immunologicznego za pomocą PAX6 jako markera neuro-ektodermy.</li>
	<li>W badaniach nad określaniem losów mezodermy i endodermy należy zastosować podejście oparte na CHIR99021 małych cząsteczek opisane w poprzednich publikacjach12,13.</li>
	<li>W tym celu, gdy komórki osiągną 70% zbieżności, należy potraktować 3 μM CHIR99021 w pożywce Definitive Endoderm (DE) przez 24 godziny, a następnie utrwalić w celu barwienia immunologicznego przy użyciu Brachuary jako markera specyficznego dla mezodermy.</li>
	<li>Na etapie endodermalnym należy hodować komórki przez dodatkowe 24 godziny w samym pożywce DE bez dodawania CHIR99021 przed utrwaleniem do barwienia immunologicznego za pomocą FOXA2.</li>
	<li>W przypadku testu tworzenia EB, przed wykonaniem mikrofotografii należy wysiać komórki na niskich powierzchniach komórek przyłączeniowych bez użycia Matrigelu do hodowli komórek w warunkach zawieszenia przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Analiza Western blot
<ol>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie za pomocą PBS i lizuj za pomocą 1x buforu RIPA zawierającego 1% SDS i 1x koktajlu inhibitorów proteazy i fosfatazy.</li>
	<li>Oczyścić lizaty przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zebrać supernatanty.</li>
	<li>Określ ilościowo całkowite białko komórkowe za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosować próbki do 2 μg/μl za pomocą 4× ładowania buforu próbki barwnika.</li>
	<li>Denaturować próbki białek w temperaturze 70 °C przez 10 minut, załadować równe ilości każdej próbki i rozpuścić za pomocą żeli SDS-PAGE o gradiacji 4%-12%, 7, a następnie przenieść do membrany PVDF przy stałym napięciu 100 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zablokować błony za pomocą 5% mleka beztłuszczowego i inkubować w rozcieńczeniach przeciwciał pierwotnych w temperaturze 4 °C przez noc z rotacją.</li>
	<li>Następnie przemyć błony 5x za pomocą buforu PBST i inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie przemyć membrany PBST 5x, inkubować z podłożem chemiluminescencyjnym i wywołać za pomocą klisz rentgenowskich.</li>
</ol>
6. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Wysiewać komórki na płytkach dołkowych P4 i inkubować przez co najmniej 24 godziny przed utrwaleniem, aby umożliwić prawidłowe przyłączenie komórek do powierzchni.</li>
	<li>Umyj komórki 3x PBS, aby usunąć wszelkie martwe komórki, a także składniki pożywki, a następnie utrwal przy użyciu 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,3% trytonu X-100, a następnie blokowanie niespecyficznego wiązania za pomocą 2% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Próbki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) rozcieńczonymi w 1% BSA przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki 3x PBS i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (Koza anty-mysia 488, Koza anty-królik 488, Koza anty-mysz 546, Koza anty-królik 546) rozcieńczonymi w 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Na koniec umyj próbki PBS 3x i przebarwij je przeciw DAPI i zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Badanie to ustandaryzowało metodę, która umożliwia wysoce wydajne i opłacalne delecje genów w hESC za pomocą technologii CRISPR-Cas9. Metoda ta z powodzeniem doprowadziła do homozygotycznej delecji genu L2HGDH w hESC w ciągu 3-4 tygodni, począwszy od zakażenia hESC do selekcji i namnażania klonów jednokomórkowych (Tabela 1). Chociaż manipulacje genami za pośrednictwem CRISPR-Cas9 można osiągnąć poprzez przejściowe transfekcje w większości komórek, staje się to wyzwaniem w komórkach macierzystych ze wzglę...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są komórkami macierzystymi z potencjałem różnicowania się we wszystkie typy komórek w organizmie. Komórki te służą jako cenne narzędzia do badania rozwoju człowieka, a także do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób, oferując w ten sposób ogromną obietnicę dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i odkrywania leków. Takie badania polegają na zbadaniu sposobu, w jaki określone geny przyczyniają się do rozwoju, funkcjonowania i regulacji organizmów1,2.
Do rozszyfrowania funkcji genów stosuje się różne techniki i podejścia, w tym manipulacje genetyczne, takie jak nokaut lub nadekspresja genów, oraz edycję genomu. Wśród nich technologia CRISPR-Cas9 okazała się najbardziej efektywnym podejściem do badań nad nokautem genów i edycją genów1,2,3. System CRISPR-Cas9 działa poprzez wykorzystanie pojedynczej cząsteczki przewodnika RNA (sgRNA) zaprojektowanej specjalnie do identyfikacji i wiązania się z określoną sekwencją DNA. Działając jako przewodnik molekularny, sgRNA kieruje enzym Cas9 do precyzyjnego miejsca w genomie, które wymaga modyfikacji. Po związaniu Cas9 inicjuje dwuniciowe pęknięcie DNA w wyznaczonym miejscu. Po rozszczepieniu DNA aktywowane są wrodzone mechanizmy naprawcze komórki. Należą do nich dwie główne ścieżki naprawy: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR). NHEJ często powoduje insercje lub delecje (indelecja) w miejscu pęknięcia, co prowadzi do zakłócenia lub inaktywacji genu. I odwrotnie, HDR umożliwia wstawienie nowych sekwencji DNA w miejscu pęknięcia, ułatwiając wprowadzenie ukierunkowanych zmian genetycznych4.
Biorąc pod uwagę znaczenie delecji genów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, opublikowano kilka protokołów dotyczących nokautów genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w hESC/iPSC. Jednak wiele z tych protokołów napotyka na poważne ograniczenia, takie jak niezwykle czasochłonność, pracochłonność i niska skuteczność ze względu na stosowanie metod dostarczania genów innych niż wirusowe5. Wyzwania te są jeszcze bardziej widoczne w przypadku komórek hESC/iPSC, ponieważ wiadomo, że komórki te mają niższą wydajność edycji w porównaniu z innymi typami komórek5. Niektóre z tych ograniczeń można rozwiązać, zwiększając wydajność dostarczania plazmidu zawierającego Cas9 i sgRNA. Można to z powodzeniem osiągnąć za pomocą systemu wektorów lentiwirusowych, który może znacznie poprawić wyniki edycji genów. Protokoły pakowania lentiwirusów są dobrze ugruntowane i proste, co pozwala na łatwe zastosowanie w laboratoriach, nawet przez badaczy o ograniczonym doświadczeniu. Lentiwirusy wykazują wysoką skuteczność infekcji w różnych typach komórek, w tym w hESC i iPSC. Dlatego wykorzystanie systemu lentiwirusowego do ekspresji Cas9-sgRNA jest idealne do rutynowych eksperymentów z edycją genów w hESC/iPSC do badań funkcji genów.
Tutaj oferujemy prostą i nieskomplikowaną metodę wysoce efektywnych delecji genów opartych na CRISPR-Cas9 w hESC w stosunkowo krótszym czasie niż konwencjonalne protokoły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Chociaż zastosowano wektor lentiwirusowy z konstytutywną ekspresją Cas9 i sgRNA, można go łatwo zastąpić indukowaną lekiem ekspresją Cas9 w celu kontrolowania ekspresji Cas9.

<table><tbody><tr><td>2-MERKAPTOETANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td> 38,5 ml, sterylne + certyfikowane bezpłatne ultraprzezroczyste probówki cienkościenne < <td></td></tr><tr><td>></td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinowany ludzki</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matryca błony podstawnej, wolna od LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine Technologie</td><td>komórek macierzystych</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca i Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica na ciało płodu</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Przeciwciało mAb królika</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórek</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon Aminokwasy endogenne (NEAA) 100x roztwór</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) MAb królika</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik</td> <td>surowicy nokautującejInvitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINE, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Makrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Makrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Makrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Makrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Makrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 kompletne media</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Przeciwciało</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Suplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Suplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Przeciwciało</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICYLINA STREPTOMYCYNA SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Addgene</td><td></td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji polibrenem</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninamina, rozgałęziona</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Lentivirus Titer Kit</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor skały Y-27632 dichlorowodorek&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Sox2</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSYNA .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNA&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

delecja genu za pośrednictwem crispr-cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

System CRISPR-Cas9 do edycji genomu zrewolucjonizował badania funkcji genów w komórkach ssaków, w tym w komórkach macierzystych. Jednak praktyczne zastosowanie tej techniki, szczególnie w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, wiąże się z pewnymi wyzwaniami, takimi jak czasochłonność i pracochłonność oraz niska wydajność edycji. W tym miejscu opisujemy generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) stabilnie eksprymujących sgRNA dla genu L2HGDH, przy użyciu wysoce wydajnego i stabilnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa. SgRNA ukierunkowane na ekson 1 genu L2HGDH zostały chemicznie zsyntetyzowane i sklonowane do wektora lentiCRISPR v2-puro, który łączy konstytutywną ekspresję sgRNA z Cas9 w wysoce wydajnym systemie jednowektorowym w celu uzyskania wyższych mian lentiwirusa dla zakażenia hESC i stabilnej selekcji przy użyciu puromycyny. Komórki wybrane za pomocą puromycyny poddano dalszej namnażce, a klony jednokomórkowe uzyskano przy użyciu metody ograniczonego rozcieńczenia. Pojedyncze klony zostały namnażone i uzyskano kilka homozygotycznych klonów nokautujących dla genu L2HGDH, co potwierdzono 100% redukcją ekspresji L2HGDH przy użyciu analizy Western blot. Ponadto, za pomocą MSBSP-PCR, zmapowano miejsce mutacji CRISPR przed sekwencją rozpoznającą PAM Cas9 w wybranych homozygotycznych klonach. Przeprowadzono sekwencjonowanie Sangera w celu przeanalizowania dokładnych insercji/delecji oraz przeprowadzono charakterystykę funkcjonalną klonów. Metoda ta spowodowała znacznie wyższy odsetek homozygotycznych delecji w porównaniu z wcześniej opisanymi niewirusowymi metodami dostarczania genów. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na genie L2HGDH, to solidne i opłacalne podejście może być wykorzystane do stworzenia homozygotycznych nokautów dla innych genów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych do badań funkcji genów.

Klonowanie sgRNA dla L2HGDH w wektorze lentiCRISPRv2 puro 
Wektor lentiCRISPRv2 puro pozyskano komercyjnie (patrz Tabela materiałów) i poddano trawieniu enzymem BsmB1, co doprowadziło do uwolnienia fragmentu wypełniającego (stuffer fragment) o wielkości 1,8 Kb. Jak pokazano na Rysunku 2A, zaobserwowano całkowite trawienie wektora. W przypadku każdej konstrukcji przesiewowo sprawdzono sześć klonów pod kątem obecności lub braku wstawki, wykorzystując jako p...

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

Na początek wysiewaj zawiesinę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na pokrytej Matrigelem płytce dołkowej P24 z 500 mikrolitrami pożywki. Inkubować przez noc, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Następnego dnia zainfekuj przyłączone komórki przy wielokrotności infekcji wynoszącej 10, wraz z ośmioma mikrogramami na mililitr polibrenu.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Po inkubacji należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką uzupełnioną penicyliną streptomycyną, ale bez inhibitora skalnego. Gdy komórki osiągną 90% konfluencję, uzupełnij pożywkę 0,8 mikrograma na mililitr puromycyny, aby rozpocząć proces selekcji.Po około czterech do sześciu dniach podziel stabilne komórki w stosunku jeden do czterech i rozwiń je w celu kriokonserwacji i dalszej analizy. Aby przeprowadzić selekcję pojedynczych komórek, przygotuj zawiesinę komórek odpowiadającą 500 komórkom w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej. Wysiewaj 100 mikrolitrów tej zawiesiny do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.Pozostaw komórki w spokoju w inkubatorze na trzy dni, a następnie obserwuj je pod kątem dalszego wzrostu. Następnie zaznacz studzienki zawierające pojedyncze klony

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Poznaj metodę CRISPR-Cas9 do delecji genu L2HGDH w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych H9. Technika ta zachowuje zdolności różnicowania i ma zastosowanie w biologii rozwoju oraz medycynie regeneracyjnej.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego (Wideo) | JoVE Journal

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Przeglądaj więcej filmów