Name: In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej do badania aktywności neuronalnej w larwach Danio rerio z ekspresją GCaMP. Protokół umożliwia obserwację dynamiki wapnia w odpowiedzi na stymulację sensoryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant dla ACR z National Institutes of Health (SC2GM1304854) oraz grant dla DLG z National Science Foundation (2050850).

Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care Use Committee na Uniwersytecie Stanowym Kalifornii w Fullerton (Protokół # 2023-1310).
1. Inscenizacja larw danio pręgowanego w agarozie o niskiej temperaturze topnienia
<ol>
	<li>Hoduj dorosłe transgeniczne zwierzęta o ekspresji neuronalnej Tg(elav3:GCaMP6s)6 z dwoma samcami na dwie samice zgodnie z wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami. Dorosłe osobniki umieszcza się w specjalnych komorach hodowlanych, tak aby wypuszczone jaja były chwytane w dolnej komorze z fałszywym dnem, które nie jest dostępne dla dorosłych. Przy pierwszym świetle lub po usunięciu przegrody separacyjnej samice uwalniają jaja, a samce zapładniają jaja schwytane w fałszywym dnie.</li>
	<li>Usunąć dorosłe osobniki i zebrać zapłodnione jaja za pomocą sitka do jaj i umieścić w pożywce dla zarodków (E3) (5 mM NaCl, 0,33 mM MgSO4, 0,33 mM CaCl2, 0,17 mM KCl, 1 mM HEPES, 0,00001% błękitu metylenowego, pH 7,0)30 o świetle 14 h/10 h ciemności w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze 
	UWAGA: Zastosowana receptura E3 ma niskie stężenie błękitu metylenowego, które nie wpływa na fluorescencję ani nie prowadzi do znaczącego sygnału autofluorescencji. Nie wymagamy stosowania 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w wieku rozwojowym określonym w protokole ze względu na naturalną przezroczystość zapewnianą przez linię transgeniczną GCaMP6s.</li>
	<li>Wierzchowce wierzchowa zwierzęta 2-7 dni po zapłodnieniu (dpf) przy użyciu 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia rozpuszczonej w pożywce E3. Podgrzej agarozę do temperatury, w której można manipulować danio pręgowanym bez uszkodzenia organizmu. Zanim agaroza o niskiej temperaturze topnienia ostygnie i zestale się (<1 min), umieść larwy grzbietem do góry na szalce Petriego ze szklanym dnem, tak aby obszar mózgu, który ma być badany, znajdował się jak najbliżej obiektywu, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. W zależności od doświadczenia, zazwyczaj wystarcza od 8 do 10 danio pręgowanego na grupę doświadczalną. 
	UWAGA: Zwierzęta nie były znieczulane w tym protokole.</li>
	<li>Po zastygnięciu agarozy z larwą na miejscu (około 2 do 3 minut) dodać 5 ml roztworu E3. Następnie przeciąć agarozę skalpelem zgodnie z wymogami protokołu eksperymentalnego. 
	UWAGA: Różne części agaru powinny zostać odcięte, w zależności od tego, jakie części danio pręgowanego muszą zostać uwolnione z ograniczeń i/lub otrzymać inny rodzaj bodźca.</li>
	<li>Przenieść szalkę Petriego zawierającą danio pręgowanego do stolika mikroskopu konfokalnego i pozwolić rybie zaaklimatyzować się przez 20 minut.</li>
</ol>
2. Konfiguracja i obrazowanie pod mikroskopią konfokalną z zastosowaniem bodźca
<ol>
	<li>Po okresie aklimatyzacji wyśrodkuj rybę pod obiektywem 40x (NA 1.0) zanurzenia w wodzie w temperaturze pokojowej za pomocą jasnego pola ze źródłem światła (~475 nm).</li>
	<li>Ustawienia akwizycji mikroskopu konfokalnego będą zależeć od jakości i poziomu ekspresji cząsteczki fluorescencyjnej, głębokości i właściwości optycznych tkanki, wielkości pola widzenia i prędkości nagrywania. Określ odpowiednie ustawienia za pomocą wskaźnika zasięgu, aby zapewnić optymalne przechwytywanie emitowanego światła zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Zapewnij odpowiednią regulację mocy lasera i wzmocnienia głównego, aby uchwycić światło fluorescencyjne w optymalnym zakresie, zapobiegając w ten sposób niepotrzebnej utracie sygnału fluorescencji zależnego od GCaMP6s. Skorzystaj z poniższej listy kluczowych ustawień i czynników konfokalnych, aby określić odpowiednie ustawienia.
	<ol>
		<li>Rozmiar otworka: Określ to na podstawie użytego obiektywu i ustawienia go tak, aby akceptował pojedynczą płaszczyznę ogniskowej, jednocześnie ograniczając inne płaszczyzny ogniskowe. W przypadku tego protokołu stosuje się otwór otworkowy o wielkości 32 μm.</li>
		<li>Moc lasera i długość fali: Dostosuj moc lasera w oparciu o poziom ekspresji cząsteczki fluorescencji oraz głębokość i właściwości optyczne tkanki. Użyj wskaźnika zasięgu, aby upewnić się, że laser nie wykracza poza zasięg fotodetektora. Ustaw długość fali wzbudzenia na długość fali światła, która optymalnie wzbudza cząsteczkę fluorescencyjną. W tym eksperymencie, ponieważ ryby były heterozygotyczne pod względem transgenu GCaMP6s, a poziomy ekspresji były niskie, użyj 5% mocy lasera przy długości fali 488 nm, wzmocnieniu 650. Przy silnej ekspresji transgenu moc lasera waha się od 1,5% do 3%, co zwykle wystarcza. 
		UWAGA: Jeśli moc lasera jest ustawiona zbyt nisko, informacje (światło wykryte przez lampę fotopowielacza) zostaną utracone. Jeśli moc lasera jest ustawiona zbyt wysoko, emitowane światło może przekroczyć zasięg detektora lub uszkodzić próbkę (fotowybielacz).</li>
		<li>Wzmocnienie główne: Wzmocnienie główne określa czułość fotodetektora. Użyj wskaźnika zasięgu, aby upewnić się, że wzmocnienie główne nie jest ustawione zbyt wysoko, przekraczając w ten sposób zakres fotodetektora. W tym eksperymencie wzmocnienie główne jest ustawione na 650.</li>
		<li>Pole widzenia: Upewnij się, że pole widzenia jest wystarczająco duże, aby uchwycić tkankę będącą przedmiotem zainteresowania. Jest to główne ograniczenie dla mikroskopów konfokalnych, ponieważ rozmiar pola widzenia ogranicza szybkość przechwytywania, jak pokazano na Rysunek 2. W przypadku eksperymentów z udziałem AITC ustaw pole widzenia na 79,86μm2.</li>
		<li>Szybkość przechwytywania: Wraz ze wzrostem szybkości przechwytywania ilość światła przechwyconego przez fotodetektor będzie się zmniejszać. Ponieważ przechwytywana jest mniejsza ilość światła, jakość obrazu ulegnie pogorszeniu. Upewnij się, że szybkość przechwytywania równoważy jakość obrazu i szybkość wymaganą do uchwycenia interesującego zdarzenia fizjologicznego. W tym przypadku prędkość przechwytywania jest ustawiona na 1,20 f/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyśrodkuj pole widzenia na skupisku neuronalnym ogonowym do commissura infima halleri w rostralnej części rdzenia kręgowego30. Gromada ta jest dość mała (~2,5 dpf), ale jest znacznie większa w późniejszym okresie rozwoju (7 dpf). 
	UWAGA: Jeśli montaż agarozy w kroku 1 jest nieoptymalny, to znaczy, że zwierzę jest umieszczone pod kątem lub zbyt głęboko w agarozie, wpłynie to niekorzystnie na jakość obrazu. Obraz rdzenia kręgowego danio pręgowanego u dobrze umieszczonego zwierzęcia i kontrastowy obraz rdzenia kręgowego u nieoptymalnie umieszczonego danio pręgowanego pokazano na Rysunek 3.</li>
	<li>Przeprowadź skanowanie szeregów czasowych przy polu widzenia 79,86μm2 przy 1,20 klatki na s (fps) z rozdzielczością przestrzenną 0,119μm2 na piksel. Dostosuj rozmiar pola widzenia i szybkość akwizycji obrazu zgodnie z żądanym zastosowaniem.</li>
	<li>Po 2 minutach od rozpoczęcia obrazowania dodać 41,67 μl roztworu podstawowego AITC (10 μM stężenie końcowe) lub roztworu E3 do naczynia za pomocą pipety. Kontynuuj nagrywanie przez ~30 sekund, aby obserwować wszelkie zmiany w aktywności GCaMP6s w obszarze zainteresowania za pomocą obrazowania poklatkowego. Po zakończeniu nagrywania uwolnij zwierzę od agarozy i poddaj je eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami. 
	UWAGA: Podczas rejestrowania aktywności GCaMP6s, samo światło konfokalne może być bodźcem. Należy to uwzględnić w analizie wyników obrazowania. Czas nagrywania jest funkcją liczby klatek i szybkości przechwytywania każdej klatki, którą można dostosować w razie potrzeby do żądanego czasu.</li>
</ol>
3. Analiza sygnału GCaMP przy użyciu FIJI
<ol>
	<li>Po nagraniu, jeśli dane wyjściowe nie są w formacie pliku .tif do dalszej analizy FIDŻI, wyeksportuj pliki obrazów jako pliki .tif z pakietu oprogramowania mikroskopowego.</li>
	<li>Pobierz FIJI do analizy śladów neuronowych. Otwórz FIJI, zaimportuj pliki .czi do programu, a po wyświetleniu monitu użyj ustawień domyślnych we wtyczce BioFormats.</li>
	<li>Podświetl interesujący Cię obszar/neuron za pomocą narzędzi Okrąg lub Odręczny, klikając Odpowiednie ikony. (Najechanie kursorem na ikony spowoduje nazwy narzędzia w programie.) 
	UWAGA: Ponieważ obszar zainteresowania ma różny rozmiar, stałe obszary/okręgi nie są możliwe. Oprogramowanie, które pozwala na rejestrację zmian fluorescencyjnych w czasie w postaci wokseli, takie jak pakiet Thunder32, może pozwolić na wykrywanie pojedynczych neuronów; Jednak w przypadku ~20 neuronów w obecnym eksperymencie, wykrycie granic błony przez niewidomego obserwatora byłoby prawdopodobnie lepsze niż zautomatyzowany system detekcji.</li>
	<li>Po wybraniu zwrotu z inwestycji na pasku narzędzi FIJI kliknij przycisk Analizuj narzędzia > > Menedżer zwrotu z inwestycji. Następnie kliknij Dodaj [t], a wybrany ROI zostanie dodany do okna Menedżera ROI.</li>
	<li>W Menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij opcję Więcej > wiele miar. Pozostaw ustawienia domyślne i kliknij OK. FIJI wygeneruje surowe dane, którymi można manipulować jako plik CSV za pomocą Pythona lub jako surowe dane w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	<li>Aby znormalizować nieprzetworzone dane i przedstawić je jako ślad neuronowy dla danego obszaru zainteresowania, uśrednij wartości z ostatnich ~30 s z 2-minutowego okna przed bodźcem i znormalizuj wszystkie wartości po bodźcu do tej średniej wartości bazowej: 
	Znormalizowana intensywność fluorescencji = (Chwilowa fluorescencja danego obszaru zainteresowania po bodźcu)/(Średnia fluorescencja ~30 s z 2-minutowego interwału przed bodźcem)</li>
	<li>Wykreśl dane jako ślady neuronowe, jak pokazano w Rysunek 4. 
	UWAGA: W niektórych typach mikroskopii, takich jak mikroskopia arkuszowa, w której rejestrowana jest objętość mózgu, artefakty ruchowe są adresowane poprzez rejestrację przestrzenną przetwarzania końcowego do referencyjnej objętości mózgu1,11. Ponieważ jednak nagrywamy tylko z jednej płaszczyzny, nie można wprowadzić żadnych zmian w artefaktach ruchu. W związku z tym w przypadku pokazanych tutaj wyników nie usunięto żadnych ramek. Jeśli jednak artefakty ruchu znacząco zmienią wyniki, zautomatyzowane systemy mogą zidentyfikować i skorygować klatki za pomocą artefaktów ruchu1, 11, lub zaślepiony obserwator może usunąć takie ramki.</li>
</ol>

<ol><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat Method. 10 (5), 413-420 (2013).</li>
<li>Meyer, M. P., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+from+in+vivo+imaging+that+synaptogenesis+guides+the+growth+and+branching+of+axonal+arbors+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms.</a> J Neurosci. 26 (13), 3604-3614 (2006).</li>
<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15 (9), 804-814 (2005).</li>
<li>Son, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+FingRs+for+live+mapping+of+synaptic+dynamics+in+genetically-defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic FingRs for live mapping of synaptic dynamics in genetically-defined neurons.</a> Sci Rep. 6, 18734(2016).</li>
<li>Zada, D., Tovin, A., Lerer-Goldshtein, T., Vatine, G. D., Appelbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+behavioral+performance+and+live+imaging+of+circuit-specific+neural+deficiencies+in+a+zebrafish+model+for+psychomotor+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered behavioral performance and live imaging of circuit-specific neural deficiencies in a zebrafish model for psychomotor retardation.</a> PLoS Genet. 10 (9), e1004615(2014).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Abdelfattah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+photostable+chemigenetic+indicators+for+extended+in+vivo+voltage+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">and photostable chemigenetic indicators for extended in vivo voltage imaging.</a> Science. 365 (6454), 699-704 (2019).</li>
<li>Abdelfattah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+optimization+of+a+rhodopsin-based+fluorescent+voltage+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensitivity optimization of a rhodopsin-based fluorescent voltage indicator.</a> Neuron. 111 (10), 1547-1563.e9 (2023).</li>
<li>Gao, Y. J., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Fos+and+pERK%2C+which+is+a+better+marker+for+neuronal+activation+and+central+sensitization+after+noxious+stimulation+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Pain+J%22%5BJournal%5D)">c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and central sensitization after noxious stimulation and tissue injury.</a> Open Pain J. 2, 11-17 (2009).</li>
<li>Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+for+functional+labeling+of+neurons%3A+activity-dependent+promoters+have+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age.</a> Front Neural Circuits. 8, 37(2014).</li>
<li>Randlett, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+activity+mapping+onto+a+zebrafish+brain+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas.</a> Nat Methods. 12, 1039-1046 (2015).</li>
<li>Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+stable+neural+correlate+of+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of a stable neural correlate of associative memory.</a> Science. 317 (5842), 1230-1233 (2007).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nature Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Wyart, C., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+there+be+light%3A+zebrafish+neurobiology+and+the+optogenetic+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Let there be light: zebrafish neurobiology and the optogenetic revolution.</a> Rev Neurosci. 22 (1), 121-130 (2011).</li>
<li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+behavior+elicited+by+single%2C+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li>
<li>Portugues, R., Severi, K. E., Wyart, C., Ahrens, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+a+transparent+animal%3A+circuit+function+in+the+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in a transparent animal: circuit function in the larval zebrafish.</a> Curr Opinion Neurobiol. 23 (1), 119-126 (2013).</li>
<li>Best, J. D., Alderton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo.+model+for+the+study+of+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiat+Dis+Treatment%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo. model for the study of neurological diseases.</a> Neuropsychiat Dis Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).</li>
<li>Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+pharmacological+tool%3A+the+how%2C+why+and+when%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when.</a> Curr Opinion Pharmacol. 4 (5), 504-512 (2004).</li>
<li>Roberts, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+of+the+C-start+response+in+larval+zebrafish+exhibits+several+distinct+phases+and+sensitivity+to+NMDA+receptor+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade.</a> PloS One. 6 (12), e29132(2011).</li>
<li>Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modulation+of+memory+formation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).</li>
<li>Ji, N., Freeman, J., Smith, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+imaging+neural+activity+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Technologies for imaging neural activity in large volumes.</a> Nat Neurosci. 19 (9), 1154-1164 (2016).</li>
<li>Panier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+functional+imaging+of+multiple+brain+regions+in+intact+zebrafish+larvae+using+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy.</a> Front Neural Circuits. 7, 65(2013).</li>
<li>Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDistel%2C+M+%22CSH+Protoc%22">CSH Protoc</a>. 2007, (2007).</li>
<li>Liu, T. T., Hou, H., Du, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+simultaneous+Ca2%2B+and+morphology+imaging+of+brain+endothelial+tip+cells+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for simultaneous Ca2+ and morphology imaging of brain endothelial tip cells in larval zebrafish.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100388(2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1217(2009).</li>
<li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+mounting+method+for+long+term+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development.</a> J Vis Exp. (119), e55210(2017).</li>
<li>Renaud, O., Herbomel, P., Kissa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell+behavior+in+whole+zebrafish+embryos+by+confocal+live+imaging%3A+application+to+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Studying cell behavior in whole zebrafish embryos by confocal live imaging: application to hematopoietic stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1897-1904 (2011).</li>
<li>Roberts, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+short-term+sensitization+by+an+aversive+chemical+stimulus+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Induction of short-term sensitization by an aversive chemical stimulus in zebrafish larvae.</a> eNeuro. 7 (6), (2020).</li>
<li>Prober, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+TRPA1+channels+are+required+for+chemosensation+but+not+for+thermosensation+or+mechanosensory+hair+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish TRPA1 channels are required for chemosensation but not for thermosensation or mechanosensory hair cell function.</a> J Neurosci. 28 (40), 10102-10110 (2008).</li>
<li>Freeman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+brain+activity+at+scale+with+cluster+computing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping brain activity at scale with cluster computing.</a> Nat Methods. 11, 941-950 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Wykazaliśmy, że aktywność neuronalną można rejestrować w mózgach larw danio pręgowanego za pomocą GCaMP6s wraz z mikroskopią konfokalną; niższe prędkości przechwytywania wymagane ze względu na wolniejszą kinetykę GCaMPS można skompensować poprzez zmniejszenie obserwowanego obszaru mózgu6. Dostępne są reportery o szybszej dynamice czasowej (tj. GCaMP6f), ale lepsza rozdzielczość czasowa zwykle odbywa się kosztem zmniejszonego sygnału fluorescencji6. Mikroskop konfokalny jest...

Danio pręgowany reprezentuje model zwierzęcia kręgowego, który jest podatny na szczegółowe badania neurobiologiczne komórkowo-molekularne. Larwy danio pręgowanego posiadają ~ 100 000 neuronów w 5 dni po zapłodnieniu (dpf), znacznie mniej niż mózgi ssaków. Co więcej, danio pręgowany jest stosunkowo przezroczysty, co ułatwia badania optyczne struktury i funkcji neuronów1,2,3,4,5. Opracowano kilka narzędzi optogenetycznych do stosowania u danio pręgowanego, w tym wysokiej jakości wskaźniki wapnia6, czujniki napięcia7,8 oraz zależne od aktywności markery aktywności neuronalnej9,10,11,12,13. Narzędzia te są komplementarne z innymi zaletami tego modelu, takimi jak podatność na modyfikacje genetyczne14,15,16,17 oraz gotowość, z jaką larwy danio pręgowanego absorbują substancje chemiczne obecne w roztworach kąpielowych18,19,20,21.
Różne metody są przydatne w fizjologii optycznej danio pręgowanego, szczególnie mikroskopia dwufotonowa, arkuszowa i konfokalna. Każda z tych technologii musi zrównoważyć dwa powiązane ze sobą problemy rozdzielczości: dostęp optyczny, w tym rozpraszanie światła przez otaczającą tkankę, oraz prędkość próbkowania, szczególnie w celu uchwycenia kinetyki potencjału czynnościowego w skali submilisekundowej22. Nastąpiła znaczna poprawa w obrazowaniu wapnia in vivo przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, ale metoda ta jest często ograniczona do pola widzenia <1mm2 i zazwyczaj można uzyskać tylko jedną płaszczyznę głębokości, co ogranicza przechwytywanie aktywności w dużych obszarach obwodów neuronowych22. W przypadku mikroskopii arkuszowej potencjału rejestrowania aktywności prawie wszystkich neuronów w mózgu rozwiązuje problem ograniczenia pola widzenia mikroskopii dwufotonowej, ale obecne prędkości kamery fizycznie ograniczają przechwytywanie do około trzech objętości mózgu na sekundę przy 40 płaszczyznach na objętość mózgu u larw danio pręgowanego1,23. Mikroskopia konfokalna jest gorsza zarówno pod względem rozdzielczości głębi, jak i szybkości przechwytywania niż mikroskopia dwufotonowa i lekka arkuszowa. Mikroskopia konfokalna ma zalety w postaci powszechnego dostępu do laboratoriów na całym świecie oraz możliwości uzyskania rekonstrukcji aktywności neuronalnej całego mózgu przy użyciu reporterów aktywności neuronalnej, takich jak cFos i p-ERK9. Ponadto, jeśli celem są małe obszary mózgu, mikroskop konfokalny może zapewnić odpowiednią rozdzielczość czasową aktywności neuronalnej.
Niniejszy artykuł opisuje metodę, która wykorzystuje mikroskopię konfokalną do rejestrowania aktywności neuronalnej u transgenicznych ryb pręgowanych, które wykazują panneuronalną ekspresję GCaMP6. Opracowano kilka podobnych protokołów wykorzystujących larwy danio pręgowanego, aby zrozumieć funkcję ścieżek neuronowych24,25,26,27,28,29. Kluczowe cechy kilku z tych protokołów, takie jak obrazowanie poklatkowe, fluorescencyjne wskaźniki dynamiki wapnia i obrazowanie na żywo, zostały połączone w celu zmierzenia aktywności neuronalnej w niewielkiej populacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym danio pręgowanego w odpowiedzi na izotiocyjanian allilu (AITC), awersyjny chemiczny środek drażniący11,26,27,29,30,31. AITC wywołuje reakcję całego mózgu skoncentrowaną w obszarze tyłomózgowia11. Jedna grupa neuronów biegnąca tylko ogonowo do tyłomózgowia odgrywa rolę w lokomocji i przedłużonej odpowiedzi na AITC. Ta odpowiedź trwa dłużej niż usunięcie bodźca awersyjnego30. Ograniczając pole widzenia, udało nam się wykryć aktywność neuronalną w tym klastrze neuronalnym, odzwierciedloną przez zmianę fluorescencji w neuronach wyrażających GCaMP6s. Zapewniamy techniki, wytyczne i najlepsze praktyki w celu osiągnięcia wystarczającej rozdzielczości czasoprzestrzennej za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponadto omawiamy ograniczenia naszej metody zapisu optycznego. Pomimo tych ograniczeń, metoda powinna umożliwić badanie różnych zjawisk neurobiologicznych, w tym pamięci i przetwarzania sensomotorycznego.

<table><tbody><tr><td>Niska temperatura topnienia Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Rozcieńczony do 3%</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian allilu (AITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>377430</td><td>Stymulant chemiczny</td></tr><tr><td>E3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Podłoże wodne dla larw danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-567-400</td><td>Służy do trzymania danio pręgowanego podczas eksperymentów</td></tr> <tr><td>obrazowychMikropipeta (10-100 uL)</td><td>Cole-Parmer</td><td>21600-14</td><td>Aparatura służąca do tworzenia rozcieńczeń AITC</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Służy do badań przesiewowych fenotypu</td></tr><tr><td>Kleszcze do lustrzanego wykończenia</td><td>DUMONT</td><td>11251-23</td><td>Służy do orientacji danio pręgowanego w agarozie</td></tr><tr><td>myTEMP Mini inkubatory cyfrowe</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td>Obszar przetrzymywania danio pręgowanego; ustawiony na 28,5&deg; C</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>MedPRIDE</td><td>MPR-50504</td><td>Podstawowe środki ochrony indywidualnej</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>89107-632</td> Pojemnik na probówki Posi-Click <td>danio pręgowanego</td></tr><tr><td></td><td>DENVILLE</td><td>C-2171</td><td>Używany do rozcieńczania AITC</td></tr><tr><td>Poliuretanowe pipety transferowe Samco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>225</td><td>Aparatura służąca do selekcji zwierząt/podawania rozcieńczonego bolusa AITC</td></tr><tr><td>Stemi SV11 Mikroskop Apo</td><td>Zeiss</td><td>1.25496E+11</td><td>Służy do inscenizacji danio pręgowanego</td></tr><tr><td>Transgeniczne larwy danio pręgowanego (2 do 7 DPF)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Obiekty badań na zwierzętach; Mikroskop konfokalny Zeiss szczepu Tg(elav3:GCaMP6s</td></tr><tr><td>) (model LSM9)</td><td>Zeiss</td><td>3523004097</td><td>Obrazowanie ryb</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Larwy danio pręgowanego są obiecującym modelem kręgowców do badania neuronalnych mechanizmów zachowania. Ich przezroczystość i stosunkowo proste obwody neuronalne ułatwiają wykorzystanie technik optogenetycznych w komórkowych analizach zachowań. Fluorescencyjne wskaźniki aktywności neuronalnej in vivo, takie jak GCaMP6s, są szeroko stosowane do badania aktywności neuronalnej związanej z prostymi zachowaniami u larw danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania aktywności sensorycznej indukowanej u częściowo skrępowanych larw danio pręgowanego za pomocą linii transgenicznej Tg(elav3:GCaMP6s). W szczególności używamy środka chemicznego izotiocyjanianu allilu do wywołania silnej, powtarzalnej odpowiedzi fluorescencyjnej w obszarze mózgu na granicy tyłomózgowia i rdzenia kręgowego. Omawiamy potencjalne zastosowania GCaMP6 do optycznego monitorowania aktywności neuronalnej podczas szeregu paradygmatów behawioralnych oraz ograniczenia tej techniki. Nasz protokół przedstawia przystępne podejście do monitorowania dynamicznej, związanej z zachowaniem aktywności neuronalnej in vivo w mózgu larw danio pręgowanego.

Podanie izotiocyjanianu allilu wywołuje powiązany z wapniem sygnał neuronalny u larw danio pręgowanego 
Podanie AITC (krok 2.6) powoduje rozległy wzrost aktywności neuronalnej związanej z GCaMP6s w całym mózgu larwy danio pręgowanego11,30. Zaobserwowano zwiększony sygnał fluorescencyjny w niewielkim obszarze mózgu po zastosowaniu AITC, co przedstawiono na Rysunku 4.
Równoważenie...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...

[Instruktor] Na początek przygotuj 3% agros o niskiej temperaturze topnienia w pożywce zarodkowej, podgrzej agros do temperatury bezpiecznej do manipulowania danio pręgowanym bez powodowania uszkodzeń. Zanim agros ostygnie i zastygnie, larwy, które są od dwóch do siedmiu dni po zapłodnieniu, umieść grzbietem do góry na szalce Petriego ze szklanym dnem. Gdy agros zestali się z larwami na miejscu, dodaj pięć mililitrów pożywki zarodkowej do naczynia. Za pomocą skalpela pokrój agros zgodnie z potrzebami wokół larw. Przenieś szalkę Petriego z rybą danio pręgowanego na stolik mikroskopu konfokalnego. Po aklimatyzacji przez 20 minut użyj obrazowania w jasnym polu, aby wyśrodkować rybę pod obiektywem 40-krotnego zanurzenia w wodzie w temperaturze pokojowej. Ustaw parametry akwizycji mikroskopu konfokalnego w oparciu o jakość i poziomy ekspresji cząsteczki fluorescencji, a także głębokość i właściwości optyczne tkanki. Dostosuj moc lasera i ustawienia wzmocnienia głównego, aby prawidłowo wychwytywać światło fluorescencyjne w optymalnym zakresie i zapobiec niepotrzebnej utracie fluorescencji zależnej od sukcesu obozu G. Następnie wyśrodkuj pole widzenia na skupisku neuronów znajdującym się w rostralnej części rdzenia kręgowego. Wykonaj skanowanie szeregów czasowych z polem widzenia 79,86 mikrometra kwadratowego przy liczbie klatek na sekundę 1,20 klatki na sekundę i rozdzielczości przestrzennej 0,119 mikrometra kwadratowego na piksel. Dostosuj pole widzenia, rozmiar i szybkość akwizycji w zależności od celów eksperymentu. Dwie minuty po rozpoczęciu obrazowania dodaj 41,67 mikrolitrów roztworu podstawowego izotiocyjanianu aloesu lub pożywki zarodkowej do naczynia i kontynuuj nagrywanie przez około 30 sekund, aby zaobserwować zmiany w aktywności G Camp 6 w obszarze zainteresowania za pomocą obrazowania poklatkowego. Jeśli nagrane dane wyjściowe nie są w formacie pliku .TIF, wyeksportuj pliki obrazów jako pliki .TIF z pakietu oprogramowania mikroskopowego do dalszej analizy Fidżi. Po pobraniu oprogramowania Fiji do analizy śladów neuronowych, otwórz Fiji, zaimportuj pliki kropkowe CZI do programu. Użyj kółka lub narzędzi odręcznych na Fidżi, aby podświetlić interesujący Cię obszar lub neuron, klikając odpowiednie ikony. Po wybraniu obszaru zainteresowania lub ROI kliknij przycisk analiza, narzędzia i menedżer zwrotu z inwestycji na pasku narzędzi Fidżi. Kliknij przycisk dodaj T, aby dodać wybrany zwrot z inwestycji do okna menedżera zwrotu z inwestycji. W menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij pozycję więcej i wiele miar, aby przeanalizować zwrot z inwestycji. Pozostaw ustawienia domyślne i kliknij OK, aby wygenerować nieprzetworzone dane. Następnie zapisz dane wyjściowe jako plik CSV do dalszej manipulacji za pomocą Pythona lub arkuszy kalkulacyjnych. Teraz znormalizuj surowe dane, aby przedstawić je jako ślad neuronowy, uśredniając ostatnie 30 sekund dwuminutowego bodźca wstępnego i wygeneruj znormalizowaną intensywność fluorescencji przy użyciu podanego wzoru i wykreśl znormalizowane dane jako ślady neuronowe. Podanie izotiocyjanianu aloesu spowodowało wzrost fluorescencji G CAMP 6S w zlokalizowanym regionie mózgu larwy danio pręgowanego, co wskazuje na zwiększoną aktywność neuronalną. Przy niskiej prędkości przechwytywania wynoszącej 0,10 klatki na sekundę neurony w tylnej części mózgu i rdzeniu kręgowym były wyraźnie widoczne w wysokiej rozdzielczości. Zwiększenie szybkości przechwytywania do 0,79 klatki na sekundę spowodowało niewielką utratę rozdzielczości przestrzennej, ale poprawiło rozdzielczość czasową. Przy 3,16 klatkach na sekundę neurony wydawały się mniej wyraźne, a jednocześnie wychwytywały więcej dynamiki czasowej.

in-vivo-confocal-fluorescence-imaging-neural-activity-induced-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Ten film demonstruje metodę badania wizualnego wykrywania zdobyczy u transgenicznych larw danio pręgowanego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego opartego na wskaźniku wapnia z ich neuronami wyrażającymi fluorescencyjne kompleksy wskaźnikowe wapnia.

Analiza aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz w transgenicznej larwie danio pręgowanego

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z neuronów doprowadzających u sparaliżowanej larwy danio pręgowanego poprzez umieszczenie mikropipety w pobliżu zwoju linii bocznej i utworzenie luźnej uszczelki do przechwytywania sygnału. Roztwór zewnątrzkomórkowy utrzymuje żywotność neuronów podczas tego procesu.

Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

Danio pręgowany to modelowy system, który posiada wiele cennych cech, w tym przejrzystość optyczną, szybki rozwój zewnętrzny oraz, co szczególnie ważne dla dziedziny słuchu i równowagi, zewnętrznie zlokalizowane czuciowe komórki rzęsate. W tym artykule opisano, w jaki sposób transgeniczny danio pręgowany może być używany do oznaczania zarówno mechanosensacji komórek rzęsatych, jak i funkcji presynaptycznych in toto.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek rzęsatych w linii bocznej u larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawiamy tutaj protokół przeprowadzania dwufotonowego obrazowania wapnia w grzbietowej części przedniej mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia aktywności przedmózgu u zachowujących się dorosłych danio

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej do badania aktywności neuronalnej w larwach Danio rerio z ekspresją GCaMP. Protokół umożliwia obserwację dynamiki wapnia w odpowiedzi na stymulację sensoryczną.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów