In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

[Instruktor] Na początek przygotuj 3% agros o niskiej temperaturze topnienia w pożywce zarodkowej, podgrzej agros do temperatury bezpiecznej do manipulowania danio pręgowanym bez powodowania uszkodzeń. Zanim agros ostygnie i zastygnie, larwy, które są od dwóch do siedmiu dni po zapłodnieniu, umieść grzbietem do góry na szalce Petriego ze szklanym dnem. Gdy agros zestali się z larwami na miejscu, dodaj pięć mililitrów pożywki zarodkowej do naczynia. Za pomocą skalpela pokrój agros zgodnie z potrzebami wokół larw. Przenieś szalkę Petriego z rybą danio pręgowanego na stolik mikroskopu konfokalnego. Po aklimatyzacji przez 20 minut użyj obrazowania w jasnym polu, aby wyśrodkować rybę pod obiektywem 40-krotnego zanurzenia w wodzie w temperaturze pokojowej. Ustaw parametry akwizycji mikroskopu konfokalnego w oparciu o jakość i poziomy ekspresji cząsteczki fluorescencji, a także głębokość i właściwości optyczne tkanki. Dostosuj moc lasera i ustawienia wzmocnienia głównego, aby prawidłowo wychwytywać światło fluorescencyjne w optymalnym zakresie i zapobiec niepotrzebnej utracie fluorescencji zależnej od sukcesu obozu G. Następnie wyśrodkuj pole widzenia na skupisku neuronów znajdującym się w rostralnej części rdzenia kręgowego. Wykonaj skanowanie szeregów czasowych z polem widzenia 79,86 mikrometra kwadratowego przy liczbie klatek na sekundę 1,20 klatki na sekundę i rozdzielczości przestrzennej 0,119 mikrometra kwadratowego na piksel. Dostosuj pole widzenia, rozmiar i szybkość akwizycji w zależności od celów eksperymentu. Dwie minuty po rozpoczęciu obrazowania dodaj 41,67 mikrolitrów roztworu podstawowego izotiocyjanianu aloesu lub pożywki zarodkowej do naczynia i kontynuuj nagrywanie przez około 30 sekund, aby zaobserwować zmiany w aktywności G Camp 6 w obszarze zainteresowania za pomocą obrazowania poklatkowego. Jeśli nagrane dane wyjściowe nie są w formacie pliku .TIF, wyeksportuj pliki obrazów jako pliki .TIF z pakietu oprogramowania mikroskopowego do dalszej analizy Fidżi. Po pobraniu oprogramowania Fiji do analizy śladów neuronowych, otwórz Fiji, zaimportuj pliki kropkowe CZI do programu. Użyj kółka lub narzędzi odręcznych na Fidżi, aby podświetlić interesujący Cię obszar lub neuron, klikając odpowiednie ikony. Po wybraniu obszaru zainteresowania lub ROI kliknij przycisk analiza, narzędzia i menedżer zwrotu z inwestycji na pasku narzędzi Fidżi. Kliknij przycisk dodaj T, aby dodać wybrany zwrot z inwestycji do okna menedżera zwrotu z inwestycji. W menedżerze zwrotu z inwestycji kliknij pozycję więcej i wiele miar, aby przeanalizować zwrot z inwestycji. Pozostaw ustawienia domyślne i kliknij OK, aby wygenerować nieprzetworzone dane. Następnie zapisz dane wyjściowe jako plik CSV do dalszej manipulacji za pomocą Pythona lub arkuszy kalkulacyjnych. Teraz znormalizuj surowe dane, aby przedstawić je jako ślad neuronowy, uśredniając ostatnie 30 sekund dwuminutowego bodźca wstępnego i wygeneruj znormalizowaną intensywność fluorescencji przy użyciu podanego wzoru i wykreśl znormalizowane dane jako ślady neuronowe. Podanie izotiocyjanianu aloesu spowodowało wzrost fluorescencji G CAMP 6S w zlokalizowanym regionie mózgu larwy danio pręgowanego, co wskazuje na zwiększoną aktywność neuronalną. Przy niskiej prędkości przechwytywania wynoszącej 0,10 klatki na sekundę neurony w tylnej części mózgu i rdzeniu kręgowym były wyraźnie widoczne w wysokiej rozdzielczości. Zwiększenie szybkości przechwytywania do 0,79 klatki na sekundę spowodowało niewielką utratę rozdzielczości przestrzennej, ale poprawiło rozdzielczość czasową. Przy 3,16 klatkach na sekundę neurony wydawały się mniej wyraźne, a jednocześnie wychwytywały więcej dynamiki czasowej.