Korzenie przybyszowe topoli indukowane przez patogeny raka łodygi: eksperymentalny system do badania biologii korzeni i procesów związanych z reakcją na światło

Przedmiotem niniejszego protokołu badawczego jest opisanie metody wytwarzania korzeni przybyszowych poprzez opasanie i inokulację patogenów grzybowych na pniach gałęzi topoli. Proponujemy tę metodę jako idealny system eksperymentalny do badania biologii korzeni i procesów odpowiedzi na światło w oddziaływaniach topola z patogenem.

Chociaż u wielu gatunków roślin odnotowano wspomaganie wzrostu pożytecznych mikroorganizmów na korzeniach, takich jak ryzobakterie wspomagające wzrost roślin, bakterie ektoendofityczne lub grzyby mikoryzowe naczyniowe lub grzyby ektomikoryzowe, indukcja przypadkowego wzrostu przez patogeny nie została udokumentowana. Protokół ten przedstawia normalne zjawisko rozwoju korzeni topoli.

Rozwój i zachowanie korzeni topoli badano w różnych środowiskach i w interakcji z pożytecznymi mikroorganizmami. Jednak nasze badania wprowadzają nowy obszar biologii wzrostu roślin, czyli indukcję korzeni przybyszowych u topoli przez patogeny łodyg grzybów. Wierzymy, że to odkrycie przyczyni się nie tylko do postępu w badaniach nad biologią wzrostu, ale także do zrozumienia interakcji między roślinami a patogenami.

Ten protokół badawczy wykazał, że patogeny łodyg indukowały przypadkowe korzenie topoli. Możemy przyjąć, że patogeny mogą również zmieniać wzorce ekspresji genów w korzeniach przybyszowych na poziomie transkrypcji, potranskrypcji i modyfikacji epigenetycznej. Dlatego metody zaproponowane w tym protokole utorowały drogę do badań nad korzeniami przybyszowymi topoli.

W przyszłości skupimy się na fizjologicznych i molekularnych mechanizmach patogenów rakowych, które indukują powstawanie korzeni przybyszowych u topoli. Będziemy również badać mechanizm odporności i modyfikację epigenetyczną korzeni przybyszowych topoli po inokulacji patogenami oraz próbować dowiedzieć się, jak zjawisko to jest zalesiane.

[Narrator] Aby przygotować agar z dekstrozą ziemniaczaną lub pożywkę PDA, rozpuść sześć gramów ekstraktu ziemniaczanego, 20 gramów dekstrozy i 20 gramów agaru w jednym litrze wody. Sterylizuj pożywkę w temperaturze 121,1 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wlej pożywkę na szalki Petriego, z których każda zawiera 20 mililitrów pożywki PDA. Zaszczepić aktywowaną kostkę grzybni grzybów Valsa sordida lub Botryosphaeria dothidea w środku szalki Petriego. Inkubuj naczynie w ciemności w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez siedem do 10 dni. Po inkubacji pokrój pożywkę PDA z grzybnią na paski. Następnie wybierz jednoroczne, energicznie rosnące drzewko topoli i wybierz dojrzałą łodygę z drzewka. Wysterylizuj obszar inokulacji 75% etanolem. Ostrożnie opasaj naskórek i łyko wysterylizowanej łodygi topoli. Usuń opasane pierścienie łyka, w tym częściowe kambium, aby odsłonić wewnętrzne tkanki kambium lub ksylemu. Całkowicie przykryj obszar opasywania paskami grzybni jako zabieg inokulacji łyka. Owiń zaszczepioną łodygę czterema warstwami rozciągliwej, przezroczystej taśmy do szczepienia, aby zatrzymać wilgoć. Za pomocą wysterylizowanego noża zeskrob i uszkodzić wewnętrzną tkankę kambium odsłoniętego obszaru. Następnie zaszczepij pasek PDA w obszarze opasywania w ramach zabiegu usuwania kambium. Następnie zaszczepij obszary opasywania bezpośrednio za pomocą niehodowanych pasków PDA jako kontroli opasywania. Owiń zaszczepioną łodygę czterema warstwami rozciągliwej, przezroczystej taśmy do szczepienia, aby zatrzymać wilgoć. Zawiąż zaszczepioną łodygę patykiem, aby chronić ją przed wiatrołomem. Po 14 do 30 dniach od zaszczepienia obserwuj i zapisuj tworzenie się korzeni przybyszowych topoli. Ostrożnie opasaj naskórek łodygi topoli, aby odsłonić zieloną tkankę łyka. Następnie zeskrob pionowo tkankę łyka i odsłoń wewnętrzną strukturę łyka. Zaszczep opasany obszar naskórka grzybnią i paskiem PDA, jak pokazano wcześniej. Owiń zaszczepione łodygi czterema warstwami rozciągliwej, przezroczystej taśmy do szczepienia. Po 14 do 30 dniach od zaszczepienia obserwuj i zapisuj tworzenie się korzeni przybyszowych topoli lub korzeni przybyszowych. Patogeny raka łodyg V. sordida i B. dothidea indukowały tworzenie się korzeni przybyszowych w pędach Populus alba var. pyramidalis po inokulacji łyka. Korzenie przybyszowe zostały również wywołane na pniach 6-letniego P. alba var. pyramidalis przez patogen V. sordida po opasaniu łyka, o długości korzeni przekraczającej 7,0 cm. Po wywołaniu korzeni przybyszowych u topoli za pomocą metody inokulacji opasającej łyko lub opasującej naskórek, należy owinąć obszar zaszczepiony patogenem folią aluminiową w celu zacienienia. Zawiąż łodygę patykiem, aby chronić ją przed wiatrołomem. Po 20 dniach usuń folię aluminiową z łodyg. Obserwuj i fotografuj zacienione folią aluminiową i niezacienione korzenie przybyszowe topoli. Uprawiaj zacienione korzenie przybyszowe topoli w świetle słonecznym lub pod sztucznymi źródłami światła. Po jednym do pięciu dni ekspozycji na światło usuń taśmy do szczepienia i zbierz korzenie przybyszowe topoli. Owiń korzenie przybyszowe folią aluminiową. Namocz przypadkowe próbki korzeni w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ekspozycja na światło przekształciła białe lub jasnoczerwone korzenie przybyszowe w czerwone korzenie przybyszowe P. alba var. pyramidalis w ciągu trzech dni, z biosyntezą pigmentu związaną z tworzeniem 3-O-glukozydu cyjanidyny.